Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av humane primære ventilceller for in vitro sykdomsmodellering

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62439
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Division of Cardiology, Department of Medicine, and the Pittsburgh Heart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Cardiothoracic Surgery, University of Pittsburgh and Heart and Vascular Institute, University of Pittsburgh Medical Center, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

Summary

Denne protokollen beskriver samlingen av humane aortaklaffer ekstrahert under kirurgiske aortaklaffutskiftningsprosedyrer eller fra kadaverisk vev, og den påfølgende isolasjonen, utvidelsen og karakteriseringen av pasientspesifikke primære ventilendotel- og interstitielle celler. Inkludert er viktige detaljer om prosessene som trengs for å sikre cellens levedyktighet og fenotypespesifisitet.

Abstract

Kalsial aortaklaffsykdom (CAVD) er tilstede i nesten en tredjedel av den eldre befolkningen. Fortykkelse, avstivning og forkalkning av aortaklaffen forårsaker aortastenose og bidrar til hjertesvikt og hjerneslag. Sykdomspatogenese er multifaktoriell, og spenninger som betennelse, ekstracellulær matriseombygging, turbulent strømning og mekanisk stress og belastning bidrar til osteogen differensiering av ventilendotel- og ventilinterstitielle celler. Imidlertid er de nøyaktige initierende faktorene som driver den osteogene overgangen til en sunn celle til en forkalkningscelle, ikke fullt definert. Videre er den eneste aktuelle behandlingen for CAVD-indusert aortastenose aortaklaffutskifting, hvorved den opprinnelige ventilen fjernes (kirurgisk aortaklaffutskifting, SAVR) eller en fullt sammenleggbar erstatningsventil settes inn via et kateter (transkateter aortaklaffutskifting, TAVR). Disse kirurgiske prosedyrene kommer til en høy pris og med alvorlige risikoer; Dermed er det viktig å identifisere nye terapeutiske mål for narkotikaforskning. For dette formål utvikler denne studien en arbeidsflyt der kirurgisk fjernet vev fra pasienter og donorkadavervev brukes til å lage pasientspesifikke primære linjer med valvulære celler for in vitro sykdomsmodellering. Denne protokollen introduserer bruken av en kald lagringsløsning, som ofte brukes i organtransplantasjon, for å redusere skaden forårsaket av den ofte lange anskaffelsestiden mellom vevseksisjon og laboratoriebehandling med fordelen av sterkt stabiliserende celler i det utskårne vevet. Resultatene fra denne studien viser at isolerte ventilceller beholder sin proliferative kapasitet og endotel- og interstitielle fenotyper i kultur opptil flere dager etter ventilfjerning fra donoren. Bruk av disse materialene tillater innsamling av kontroll- og CAVD-celler, hvorfra både kontroll- og sykdomscellelinjer etableres.

Introduction

Calcific aortaklaffsykdom (CAVD) er en kronisk patologi preget av betennelse, fibrose og makrokalsifisering av aortaklaffbrosjyrer. Progressiv ombygging og forkalkning av brosjyrene (kalt aortasklerose) kan føre til obstruksjon av blodstrømmen (aortastenose) som bidrar til hjerneslag og fører til hjertesvikt. For tiden er den eneste behandlingen for CAVD kirurgisk eller transkateter aortaklaffutskifting (henholdsvis SAVR og TAVR). Det er ikke noe ikke-kirurgisk alternativ for å stoppe eller reversere CAVD-progresjon, og uten ventilutskifting nærmer dødeligheten seg 50% innen 2-3 år 1,2,3. Definere de underliggende mekanismene som driver denne patologien vil identifisere potensielle nye terapeutiske tilnærminger.

I en sunn voksen er aortaklaffbladene omtrent en millimeter tykke, og deres hovedfunksjon er å opprettholde den ensrettede strømmen av blod ut av venstre ventrikel4. Hver av de tre brosjyrene består av et lag av ventilendotelceller (VEC) som strekker den ytre overflaten av pakningsvedlegget og fungerer som en barriere. VEC opprettholder ventilhomeostase ved å regulere permeabilitet, inflammatorisk celleadhesjon og parakrin signalering 5,6,7. Ventilinterstitielle celler (VIC) utgjør de fleste cellene i ventilpakningsvedlegget8. VIC er arrangert i tre karakteristiske lag i pakningsvedlegget. Disse lagene er kjent som ventricularis, spongiosa og fibrosa9. Ventrikkelis vender mot venstre ventrikel og inneholder kollagen og elastinfibre. Det midterste laget, spongiosa, inneholder høyt proteoglykaninnhold som gir skjærfleksibilitet under hjertesyklusen. Det ytre fibrosalaget ligger nær utstrømningsoverflaten på aortasiden og er rikt på type I og type III fibrillært kollagen som gir styrke til å opprettholde koaptasjon under diastolen10,11,12. VICs ligger i hvilemodus, men faktorer som betennelse, ombygging av den ekstracellulære matrisen (ECM) og mekanisk stress kan forstyrre VIC homeostase 8,9,13,14,15,16. Med tap av homeostase aktiverer og får VICs en myofibroblastlignende fenotype som er i stand til proliferasjon, sammentrekning og sekresjon av proteiner som ombygger den ekstracellulære millieu17. Aktiverte VIC kan gå over til forkalkningsceller som minner om differensieringen av en mesenkymal stamcelle (MSC) til en osteoblast 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

Forkalkning ser ut til å initiere i det kollagenrike fibrosalaget fra bidrag fra både VEC og VICs, men utvider og invaderer de andre lagene i brosjyren8. Det er således klart at både VECs og VICs reagerer på stimuli for å oppregulere uttrykket av osteogene gener, men de nøyaktige hendelsene som driver aktiveringen av osteogene gener, samt det komplekse samspillet mellom cellene og den ekstracellulære matrisen i brosjyren, forblir dårlig definert. Murine modeller er ikke en ideell kilde for å studere ikke-genetiske drivere av CAVD patogenese, da mus ikke utvikler CAVD de novo26,27, derfor er bruk av primære humane vev og de primære cellelinjene isolert fra disse vevene nødvendig. Spesielt er det viktig å skaffe disse cellene i høyt antall og god kvalitet, da feltet 3D-cellekulturer og organoidmodellering utvides og sannsynligvis vil bli et ex vivo menneskebasert alternativ til murine modeller.

Hensikten med den nåværende metoden er å dele en arbeidsflyt som har etablert betingelsene for effektivt å isolere og vokse VECs og VICs hentet fra kirurgisk fjernede ventiler fra menneskelige givere. Tidligere studier har vist vellykket isolering av VEC og VIC fra svin28 og murine ventiler29, så vidt vi vet er dette den første som beskriver isoleringen av disse cellene i humant vev. Protokollen som er beskrevet her, gjelder for menneskelige utskårne ventiler og omgår og forbedrer skaden forårsaket av den ofte lange anskaffelsestiden mellom vevseksisjon og laboratoriebehandling ved å innføre bruk av en kald lagringsløsning, en bufret løsning klinisk utnyttet i organtransplantasjoner som i stor grad stabiliserer celler i det utskårne vevet. Protokollen beskrevet her viser også hvordan man bestemmer cellefenotype og garanterer høy effektivitet av celleoverlevelse med minimal cellekrysskontaminering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle pasientprøver er samlet inn fra personer som er registrert i studier godkjent av det institusjonelle vurderingsstyret ved University of Pittsburgh i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Kadavervev oppnådd via Center for Organ Recovery and Education (CORE) ble godkjent av University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).

1. Godkjenning og sikkerhet

  1. Få godkjenning fra Institutional Review Board (IRB) eller et unntatt notat for innsamling av pasientprøver eller kadavervev i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
  2. Ta nødvendig institusjonell opplæring for å jobbe med menneskelig vev som Bloodborne Pathogens Training, Biomedical Human Subjects Research, Privacy and Information Security, og transport og frakt av biologiske materialer.

2. Logistikk og forberedelse

  1. Kirurgiske prøver
    1. Sørg for at et kjøleskap er tilgjengelig og plassert i nærheten av operasjonen. Oppbevar 50 ml koniske rør forhåndsmerket med avidentifisert nomenklatur som inneholder 40 ml sterile aliquots kaldlagringsløsning i dette kjøleskapet for bruk av kirurgisk personale. Disse rørene er stabile ved 4 °C til utløpsdato på originalpakningen.
    2. Ved ekstraksjon, plasser ventilvev i disse rørene. Plasser rørene i en forseglet sekundærbeholder, for eksempel en lekkasjesikker plastpose eller en plastbeholder som er merket med en biohazard-etikett. Vev plukkes opp og transporteres på is i henhold til institusjonelle protokoller for transport av biofarer.
  2. Kadaveriske prøver
    1. Senk gjenvunnede organer i kjølelagringsløsning, plasser i et forseglet sekundært inneslutningsbeholder og transport på is i henhold til institusjonelle protokoller for transport av biofarer.

3. Klargjøring av reagenser

  1. Lag kollagenbelagte plater minst dagen før.
    1. I et 50 ml konisk rør blandes 5 ml isopropylalkohol, 8,7 ml eddiksyre og 0,5 μg kollagen I-pulver. Ta opptil 50 ml med sterilt vann. Bland og filtrer gjennom et 0,45 μm filter.
    2. Under en steril cellekulturhette, legg til nok kollagenløsning til 6 brønnplater og 10 cm retter for å bare dekke hele bunnen. Dekk platen og la den stå i 4-6 timer ved romtemperatur. Fjern overflødig oppløsning med en steril pipette, sett i et nytt sterilt 50 ml konisk rør, og spar ved 4 °C for å lage ekstra plater. Oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i flere måneder.
    3. Tørk platene i en 37 °C inkubator over natten, og oppbevar dem deretter i en gjenlukkbar pose ved 4 °C. Kollagenbelagte tallerkener og retter kan lagres i flere måneder.
  2. Autoklav følgende elementer: vev tang, vev saks, bomullspinner og gasbind pads.
  3. VEC vekstmedier: Forbered og bruk endotelcellevekstmedium i henhold til produsentens protokoller. Oppbevares i mørket ved 4 °C. Varm til 37 °C rett før bruk på cellene, ikke la mediet stå i varmebadet lenger enn nødvendig (10-15 min er tilstrekkelig). Bruk mediet innen en måned etter forberedelsen.
  4. VIC vekstmedier: Supplement DMEM base medium (4,5 g / L glukose, L-glutamin supplement, 110 mg / L natriumpyruvat)30 med 10% varmeinaktivert FBS og 100 IE / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin. Oppbevares i mørket ved 4 °C i opptil 3 måneder. Varm til 37 °C rett før bruk på cellene, ikke la mediet stå i varmebadet lenger enn nødvendig (10-15 min er tilstrekkelig).
  5. Lag steril skylleløsning like før bruk. Tilskudd steril PBS med 2,5 μg / ml soppdrepende middel, 0,05 mg / ml gentamicin og 5 μg / ml bakteriedrepende middel.
  6. Lag steril kollagenaseløsning like før bruk. Tilsett 5 mg kollagenase II til 5 ml sterilt friskt DMEM basemedium. Bland godt og steriliser løsningen ved å passere gjennom et 0, 45 μm filter. Hold på isen til bruk.

4. Vevspreparering og behandling

MERK: Institusjonell godkjenning for bruk av menneskelig vev må innhentes før arbeidet påbegynnes. Ved håndtering av vev må følgende personlige verneutstyr (PPE) brukes: en engangs væskebarriere wrap-around kjole, eller en dedikert knapp foran lab frakk med en væske-barriere vikle rundt forkle og engangs ermet kløver; et fullt ansiktsskjold, eller vernebriller med kirurgisk maske; doble hansker; nær-toed sko; og klær for å dekke bena. Omfattende arbeidsflytdiagrammer over vevspreparatet for forkalkningsvurdering (avsnitt 5) og celleisolering (henholdsvis avsnitt 6 og 7) er illustrert i henholdsvis figur 1A, B .

  1. Ved mottak av kadaverisk organprøve, excise aortaroten og nedsenk i et 50 ml konisk rør med steril skylleløsning. Ved mottak av kirurgisk prøve, fjern fra transportbeholdere og senk ned i et 50 ml konisk rør med steril skylleløsning. Plasser røret som inneholder vevet i isbøtte på rocker og bland i 10 minutter ved romtemperatur (RT).
    MERK: Behandling av vev så nært som mulig til ekstraksjonstidspunktet vil gi den beste celleutvinningen, men levedyktige celler kan samles opp til 61 timer etter eksisjon, og data viser at VIC er mer robuste enn VEC når tiden øker. Hvis vev ikke kan behandles umiddelbart, når det er mulig, fjern vev, utfør trinn 4.1, og sett deretter vevet tilbake i fersk steril lagringsløsning og hold ved 4 ° C til det er klart til å fortsette. Ventiler samlet under natt- eller helgeoperasjoner kan lagres i 40 ml kjølelagringsløsning ved 4 ° C og kan fortsatt gi levedyktige celler mer enn 2 dager etter ekstraksjon.
  2. Spray ned rør med 70% etanol og flytt til en steril hette. Fjern vev og fjern to ventilbrosjyrer (figur 2A). Plasser ett pakningsvedlegg i et kryogenisk hetteglass (eller 2-3 hetteglass hvis det er behov for flere mindre biter for fremtidig analyse) og frys ved å slippe inn flytende nitrogen og deretter oppbevares ved -80 °C.
    1. Hvis ventilen er bicuspid, avgifter bare en brosjyre. Bruk saks, klipp brosjyren i to fra knuten til hengslet. Bruk den ene halvdelen av pakningsvedlegget til hurtigfrysing og den andre halvparten til trinn 4.3.
  3. Behandle den andre brosjyren for parafininnstøping for å vurdere forkalkningsinnholdet ved å kutte det i to fra knute til hengsel. Plasser begge brikkene i en kassett som er nedsenket i 4% paraformaldehyd (PFA), og legg deretter på en rocker ved RT i minst 2 timer, men ikke mer enn 4 timer.
    MERK: Lengre fikseringstider skaper mer bakgrunn med immunfluorescerende farging. Når trinn 4.2 og 4.3 er utført, går du umiddelbart til avsnitt 6 og kommer tilbake til trinn 4.4 etter trinn 6.12.
  4. Etter fiksering, vask vevet ved å senke i fersk PBS i 1 time 3-4 ganger. Etter disse vaskene kan prøvene holde seg i PBS ved 4 °C i flere måneder om nødvendig. Fortsett til neste trinn rett før innebygging.
  5. Gradvis endres fra PBS til 70% etanol. Vask 30-60 min hvert trinn med 1:4 70% etanol:PBS; 1: 1 70% etanol: PBS, 4: 1 70% etanol: PBS; 70% etanol.
  6. Legg inn vevet slik at seksjonene vil avsløre de tre lagene i brosjyren (figur 1A) i henhold til etablerte protokoller31. Alternativt, og hvis tilgjengelig, bringe vevet til en patologikjerne for innebygging og kutting.
  7. Etter håndtering av vev, kast eller oppbevar PPE etter behov og vask hendene umiddelbart. Dekontaminerer alt utstyr, overflater og fast og flytende avfall med en 1:10 fortynning av blekemiddel eller vaskemiddel desinfeksjonsmiddel. Tillat 20 minutter for dekontaminering, og følg deretter med en 70% etanolskylling. Behandle cellekulturhetten med mykoplasma spray i henhold til produsentens instruksjoner.

5. Von Kossa-farging for kalsiuminnhold

MERK: Dette kan gjøres bra etter celleisolasjon og linjeetablering, men sørg for å knytte forkalkningsnivået til vevet til dokumenter knyttet til den primære cellelinjen som er etablert.

  1. Skjær 5 eller 10 μm tykke parafinskiver på glassglass og stek lysbilder ved 65 ° C i 1 time, og avkjøl deretter til RT.
  2. Bruk friske løsninger, deparaffinize lysbilder ved å senke seg som følger: 100% xylen i 30 min, 2x; 100% etanol i 3 minutter, 2x; 90% etanol i 3 minutter; 80% etanol i 3 minutter; 70% etanol i 3 minutter; 50% etanol i 3 minutter; ultrarent vann i 3 minutter; Hold i ultrarent vann til neste trinn.
    MERK: Tidene ovenfor er minimum, hvert trinn kan gå lenger.
  3. Fortsett med Von Kossa-farging i henhold til produsentens protokoller.
  4. Vurder fullt ventilområde mikroskopisk og tilordne et kontrollvev (ingen tegn på forkalkning) eller CAVD (eventuelle tegn på forkalkning, figur 2B).

6. Valve Endothelial Cell (VEC) isolasjon, utvidelse og bekreftelse

  1. I en steril cellekulturhette åpner du det koniske røret som inneholder den gjenværende ventilbrosjyren og plasserer pakningsvedlegget i et nytt 50 ml konisk rør fylt med iskald PBS. Cap tube og forsiktig inverter eller plasser på en rocker i 2 min på RT.
  2. Fjern vev til en 60 mm tallerken fylt med 5-7 ml kald kollagenaseløsning. Bruk tang, dypp begge sider av pakningsvedlegget i løsningen 3-4 ganger. Inkuber vevet i 5-10 minutter i cellekulturinkubatoren ved 37 °C, og vugg vevet forsiktig hvert 2. minutt 3-4 ganger.
  3. Fjern 2 ml av løsningen fra fatet og legg i et sterilt 15 ml konisk rør. Plasser tang ved knuten og bruk en tørr steril bomullspinne til å sveipe fra tangen til hengslet, snurre vattpinnen mens du beveger den langs brosjyren. Mellom hvert sveip sveiper du vattpinnen i løsningen i det 15 ml koniske røret for å fjerne cellene. Gjenta for å vattpinne overflaten av vevet, snu deretter og gjenta på den andre siden.
  4. Hold ventilpakningen med tang i den ene hånden og en 1 ml pipette i den andre, skyll overflatene på pakningsvedlegget med løsningen i fatet. Når den er skyllet, overfør all oppløsningen som inneholder VEC-ene i parabolen til det samme 15 ml koniske røret med cellene fra vattpinnen og fortsett til trinn 6.5. Plasser det gjenværende ventilvevet i et nytt 15 ml konisk rør med 7 ml steril kollagenaseoppløsning og fortsett til trinn 7.1.
  5. Sentrifuge røret som inneholder VEC-ene ved 180 x g i 5 minutter for å pelletere de isolerte VEC-ene. Aspirer supernatanten og resuspend i 3 ml VEC vekstmedier. Sentrifuge en gang til og fjern supernatanten. Resuspend cellene i 1 ml vekstmedier og bestem antall celler ved hjelp av et hemocytometer og trypanblått.
  6. Resuspendere VEC-pellet i 2 ml VEC-vekstmedium og plate cellene i en kollagenbelagt brønn på en 6-brønnplate ved ca. 5 x 105 celler/cm2. La cellene vokse minst 3-4 dager, fjern deretter media og fyll på med friske medier. Gjenta media endring hver 4. VEC-er vil vokse i brosteinformede flekker (figur 3B, venstre paneler).
  7. Når VEC-patcher dekker >80% av platen, deler du celler på omtrent 1,3 x 104 celler / cm 2, avhengig av hvor fort de vokser (hvis de når 80% på mindre enn 1 uke, splitt på et litt lavere antall celler / cm2).
  8. For å splitte, vask celler to ganger med 2 ml DPBS og tilsett deretter nok dissosiasjonsreagens til bare å dekke overflaten av cellene. Inkuber i 2-3 minutter ved 37 °C, og kontroller at cellene ikke er overinkubert. Stopp fordøyelsen ved å tilsette like volum VEC-vekstmedier og overfør væske til et 15 ml rør. Sentrifuge ved 180 x g i 5 minutter, fjern supernatant, og resuspend i passende volum av media for antall brønner / plater som trengs.
    MERK: Når de er utvidet til en 10 cm plate, kan VEC-er noen ganger miste morfologien og endre fenotypen når de sprer seg. Dette skjer vanligvis når VECs blir sådd ved lav sammenløp under etablering og utvidelse av cellelinjen.
  9. For å garantere en ren kultur bør du vurdere å bruke CD31+ superparamagnetiske perler med hver splitting.
  10. For 1 x 108 eller færre celler (en 10 cm tallerken eller mindre), tilbered 25 μL superparamagnetiske perler ved å vaske i henhold til produsentens protokoller.
    MERK: Trinn 6.10 anbefales å utføres før trypsinisering av VEC.
  11. Løsne celler som i trinn 6.8, men resuspend i 500 μL PBS med 0,1% BSA, pH 7,4, og plasser i et 2 ml sentrifugerør. Tilsett 500 μL vasket og resuspendert perler til 2 ml rør av celler og inkuber på en rotator i 20 minutter ved 4 ° C.
  12. Plasser rør på magneten i 2 minutter. Mens røret fortsatt er i magneten, fjern forsiktig supernatant. Fjern røret fra magneten, tilsett 1 ml fersk PBS med 0,1% BSA, pipette forsiktig 2-3 ganger, og sett deretter på magneten igjen i 2 minutter. Gjenta 2 ganger til. Etter endelig fjerning av buffer, resuspend celler i vekstmedier i volum som trengs for replating.
    MERK: Celler vil fortsatt ha perler, men disse vil ikke påvirke veksten og vil bli fjernet i påfølgende passasjer.
  13. Når celler er utvidet, i tillegg til morfologi, bekrefter VEC-fenotype ved positiv farging for immunfluorescerende markører som von Willebrand-faktor (vWF), cadherin 5 (CDH5) eller PECAM-1/CD31, og negativ farging for VIC-markører som kalponin 1 (CNN) eller alfa-2 glatt muskelaktin (αSMA, figur 4, venstre paneler).

7. Valve Interstitial Cell (VIC) isolasjon, utvidelse og lagring

  1. Som angitt i trinn 6.4, etter fjerning av VEC fra ventilvevet, plasseres pakningsvedlegget i et 15 ml konisk rør med 7 ml kollagenaseoppløsning. Inkuber i 12 timer i cellekulturinkubatoren med hetten litt åpen for å tillate gassutveksling. Vellykket isolering av VIC kan fortsatt forekomme med opptil 18 timer i kollagenaseoppløsning.
  2. Etter inkubasjon, i en steril cellekulturhette, bland vevet forsiktig ved pipettering med en serologisk pipette for å sikre frigjøring av VIC fra pakningsvevet.
  3. Fjern cellesuspensjonen og pass gjennom et 0,70 μm filter inn i et 50 ml konisk rør.
  4. Tilsett 7 ml VIC vekstmedium til 50 ml rør og sentrifuge ved 180 x g i 5 minutter. Aspirer supernatant og resuspend cellepellet i 1 ml VIC vekstmedier og bestem cellenummeret. Plate VIC-ene i en 60 mm vevskulturbehandlet tallerken ved 1,3 x 104 celler/cm2.
  5. La cellene vokse minst 1-2 dager før du bytter ut media. Fjern media og vask to ganger DPBS for å fjerne gjenværende rusk og erstatt med friskt vekstmedium. Fyll på medium hver 2-3 dag. VIC vil vokse i fibroblastform (figur 3B, høyre paneler).
  6. Når VICs når en sammenheng på >90%, vask to ganger med DPBS for å fjerne overflødig media og løsne cellene ved å legge til passende volum forvarmet dissosiasjonsreagens for å dekke platen (dvs. 2-3 ml per 10 cm tallerken). Inkuber retten i en 37 °C inkubator. VICs vil løsne fra parabolen etter 2-3 min inkubasjon. Tilsett 4-6 ml forhåndsoppvarmede medier.
    MERK: Hvis celler tar lengre tid enn 3 minutter å løfte av platen, kan dissosiasjonsreagenset ha mistet styrken. Om nødvendig kan en celleskrape brukes til å løfte cellene forsiktig.
  7. Overfør cellesuspensjonen til et rør og sentrifuger forsiktig ved 180 x g i 5 minutter. Etter å ha fjernet supernatanten, resuspenderer du forsiktig cellepelleten i forvarmede VIC-vekstmedier og bestemmer antall levedyktige celler ved å bruke et hemocytometer og trypanblått. Frø de levedyktige cellene ved en 1: 2 tetthet av den opprinnelige parabolen (dvs. ~ 1 × 106 celler per 10 cm tallerken eller 1,3 x 104 celler / cm2).
  8. Vurder VIC-fenotype ved positiv farging for immunfluorescerende markører som αSMA, CNN eller SM22α og negativ farging for VEC-markører som CD31, CDH5 eller vWF (figur 4, høyre paneler).
    MERK: Protokollarbeidsflyten som presenteres her, velger objektivt en brosjyre for VEC- og VICs-isolasjon, mens de resterende brosjyrene brukes til Von Kossa-farging (seksjon 5) og snapfrysing.

8. Langsiktig cellelagring

  1. Når de er utvidet, fryser cellene ned for langtidslagring. Vask celler to ganger med 2-5 ml DPBS og tilsett deretter nok dissosiasjonsreagens til å løsne celler som i trinn 6.8 og 7.6. Stopp fordøyelsen ved å legge til like volum VEC eller VIC vekstmedier og overfør cellesuspensjon til et 15 ml rør.
  2. Bestem antall levedyktige celler ved å bruke et hemocytometer og trypanblått.
  3. Sentrifuge ved 180 x g i 5 min.
  4. Resuspend celler i kjølt betinget vekstmedium til en celletetthet på ~ 3 × 106 celler / ml.
  5. Forsiktig med virvling, tilsett et likt volum kjølt 2x kryopreserveringsmedium. Dette vil bringe cellekonsentrasjonen til ~ 1,5 × 106 celler / ml.
  6. Aliquot 1 ml i kryopreserveringsflasker. Plasser hetteglass i en cellefrysebeholder, lukk og inverter 5-6 ganger for å sikre at cellene forblir suspendert. Plasser beholderen ved -80 °C i 6-72 timer eller i henhold til frysebeholderprotokollen. Fjern hetteglassene fra -80 °C og overfør til flytende nitrogen for langtidsoppbevaring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ovennevnte protokoll skisserer trinnene som er nødvendige for håndtering av humant ventilvev og isolering og etablering av levedyktige cellelinjer fra disse vevene. Brosjyrer av aortaklaffen behandles for parafininnbygging, snap frosset for langtidslagring for biokjemisk eller genetisk analyse og fordøyes for isolering av VECs og VICs (figur 1). Mens kirurgiske prøver sannsynligvis vil ha en klinisk diagnose av aortastenose og kan vise tunge knuter av forkalkning som kan være synlige med det blotte øye, er aortaklaffforkalkning tilstede hos et betydelig antall eldre (>65 år) individer32, og på grunn av denne utbredelsen blir alle vev - kirurgisk og kadaverisk - utsatt for Von Kossa-farging eller lignende prosedyre for å vurdere om forkalkning er tilstede (figur 2).

Det ble funnet at bruk av kjølelagringsløsning i stor grad stabiliserte cellene i det utskårne ventilvevet. Kaldlagringsløsning brukes i levende organtransplantasjoner. Det skylles gjennom organer enten før eller etter fjerning fra giveren og blir igjen i vaskulaturen til det organet under transport på is. Det ble observert at VEC-linjer lettere ble etablert fra donorprøver enn kirurgisk vev, og donorlinjene var mer sannsynlig å beholde sin endotelcellemorfologi for flere passasjer. Dette var forvirrende, da donorvev ofte ikke ville nå laboratoriet i 12-24 timer postmortem mens kirurgisk vev ble oppnådd mellom 2 og 4 timer. Ved pakking av kirurgiske prøverør med kald lagringsløsning i stedet for PBS, økte celleutvinningen kraftig. Som vist i figur 3, kan både levedyktige VEC-er og VIC-er oppnås i overkant av 61 timer etter ventilekstraksjon. Mens en litt høyere prosentandel av levende VIC oppnås enn VEC når celler isoleres opptil en dag etter ventileksisjon, forblir celler levedyktige etter 48 timer etter eksisjon. Opptil 40% av de totale gjenvunnede cellene tilsvarer levende celler, og vi har observert konsistente tall mellom biologiske replikasjoner. Videre bekrefter morfologiinspeksjon også celleidentitet; mens VEC vises som pakkede, brosteinlignende og vekstkontakthemmede celler, ligner VIC-morfologi myofibroblaster med spindelform. Immunostaining av prøvene bekreftet at 91,8 % ± 1,8 (n = 3) av ekspanderte VEC-er var positive for endotelmarkøren vWF, mens 92,0 % ± 5,0 (n = 3) av ekspanderte VIC var positive for interstitialcellemarkøren αSMA (figur 4). Disse tallene er i tråd med tidligere rapporterte resultater33.

Figure 1
Figur 1: Ventilvevsprosessering og celleisolering fra humane kontroll- og CAVD-ventiler . (A) Skjematisk fremstilling av vevsprosessering for vurdering av forkalkningsnivåer i ventilene. (B) Skjematisk fremstilling av tidsforløpet og trinnene for isolering og karakterisering av humane ventilendotelceller (VEC) og ventilinterstitielle celler (VICs) fra kontroll- og CAVD-vev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Vurdering av forkalkning . (A) Representativt bilde av kontroll (øverst) og forkalket (nederst) ventilvev fra humane donorer. Legg merke til at forkalkningsknutene i CAVD-vevet kan endre morfologien og evnen til å fjerne brosjyrene rent. (B) Representant von Kossa farging av kontroll (venstre) og CAVD (høyre) ventilvev etter fiksering og videre behandling av det menneskelige ventilvevet. Merk forkalkning avsløres ved tilstedeværelse av mørk nedbør i pakningsvevet. Ventilbilder ble tatt med et laboratoriekamera. Von Kossa-fargede ventiler ble fanget med en 10x objektiv, skala bar 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vurdering av overlevelseskurver for celleoverlevelse (A) VEC og VIC. Tre brosjyrer ble hentet fra fem ventilprøver. Den første brosjyren fra hver ventil ble behandlet umiddelbart (3-12 timer etter ekstraksjon), den andre brosjyren ble behandlet ca. 24 timer senere (22-35 timer), og den tredje brosjyren ble behandlet ca. 48 timer etter oppnåelse av vevet (45-61 timer). Ventilbladene ble oppbevart i kjølelagringsløsning ved 4 °C til de ble behandlet. Y-aksen representerer prosentandelen av levende celler. (B) Morfologi av sunne kulturer av VECs (venstre paneler) og VICs (høyre paneler). Grafer viser gjennomsnittlig ± SD levende celleandel av celler isolert fra n = 5 ventilvev. Bildene ble tatt med et 4x og 10x mål, skalastenger henholdsvis 200 μm og 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativ immunfluorescerende farging på VEC og VICs. VEC-er er positive for endotelmarkøren von Willebrand Factor (vWF, venstre paneler), mens VIC er positive for interstitialmarkøren αSMA. Merk at vår isolasjonsprotokoll garanterer en høy isolasjonseffektivitet; ingen krysskontaminering mellom VECs og VICs oppdages. Bildene ble tatt med en 10x mål, skala bar 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Innhenting av kontroll- og sykdomsvev fra mennesker er avgjørende for in vitro og ex vivo sykdomsmodellering; Men mens man ofte snakker om utfordringene med å bygge bro over gapet mellom benk til seng, er omvendt rekkefølge - å gå fra kirurgisk suite til benk - ofte like skremmende et gap. Viktig for en grunnleggende forsker for å skaffe primære menneskelige vevsprøver er et samarbeid med en investert kirurgforsker som har et team av sykepleiere, kirurgiske teknikere, legeassistenter, medisinske studenter og innbyggere, og kliniske protokollledere som kan registrere og samtykke pasienter, delta og bistå i riktig håndtering av utskårne vev, og koordinere logistikken som kreves for vevsplukking. Uten den største innsats fra alle involverte for å redusere tiden fra eksisjon til celleisolasjon, vil viktig cellulært materiale og informasjonen den inneholder bli uopprettelig endret eller tapt.

Kritisk for å opprettholde levedyktigheten til vevsprøvene er bruken av kald lagringsløsning. Dette er den samme løsningen som brukes av organtransplantasjonsteamene ved UPMC og andre transplantasjonsmedisinske sentre. Bedre celleutbytte ble oppnådd fra kadavervev som hadde blitt skåret ut fra giveren mange timer på forhånd enn fra vev oppnådd raskere fra operasjonsstuen, men holdt i kald PBS. Denne tilfeldige oppdagelsen har vært avgjørende for celleinnkjøp fra menneskelig vev. Innkjøpstiden fra vevseksisjon til levering i laboratoriet varierer fra 1-5 timer for kirurgisk vev og oppover 24 timer for kadavervev. Til sammenligning kan anskaffelse og behandling av animalsk vev ofte gjøres innen få minutter etter eutanasi, noe som er ideelt for cellens levedyktighet. I mangel av kald lagringsløsning er det sannsynlig at et medium som er egnet for dyrking av celler, også kan fungere bedre enn PBS, men dette mediet ble ikke testet her på grunn av suksessen til kjølelagringsløsningen i levende organtransplantasjon og mottak av kadavervev i denne løsningen. Løsningen er hyllestabil som er ideell for lagring i operasjonsstuer, og spesifikke ingredienser som adenosin er kjent for å fremme gunstige responser på cellulære påkjenninger som iskemi / hypoksi21,34.

Et annet viktig skritt for å skaffe levedyktige celler er å vaske vevet med soppdrepende middel, gentamicin og bakteriedrepende middel. Denne korte skyllingen bidrar til å sikre at cellene forblir uforurenset av bakterier og sopp. Like kritisk er trinnene for å fordøye VEC-er ut av ventilvevet, hvor VECs i løpet av bare noen få minutter løsnes og deretter swabbed av overflaten av ventilbrosjyrene. Den etterfølgende fordøyelsen av VICs som ligger på den tette ekstracellulære matrisen av brosjyren, har mye mer slingringsmonn for varighet og styrke. Den objektive vevsbehandlingen som er beskrevet i denne protokollen, tillater isolering av de to viktigste cellepopulasjonene som er tilstede i ventilbrosjyren, VEC og VICs. Selv om en nylig enkeltcelle transkriptomanalyse har vist sameksistensen av minst fjorten forskjellige celleundertyper som bor i den menneskelige ventilen, inkludert seks ikke-ventilavledede stromale celler i CAVD-vev35, kan dette mangfoldet representere variasjoner på grunn av effekter fra behandling og fordøyelse av disse herdede vevene, eller det kan skyldes forskjellige mikromiljøer som pakningscellene blir utsatt for: VECs er utsatt for to forskjellige blodstrømmer mens VICs er innebygd i tre forskjellige ekstracellulære matriselag 8,9. Den storskala isolasjonsprotokollen og analysen som er beskrevet her, sikrer at over 90% av VECs og VICs samsvarer med deres hovedfenotype. Selv om en grad av heterogenitet kan bli funnet, påvirker det ikke de generelle resultatene av studien av VEC og VIC homeostase 8,9,13,14,15,16.

Det er også viktig å merke seg at pasienter og deres ventilvev, og dermed cellelinjene som er anskaffet fra dem, ikke er identiske. Genetikk, komorbiditeter, håndtering under kirurgi og behandling, og friskhet av fordøyelsesoppløsningsingredienser kan påvirke vekstraten og til og med kanskje oppførselen eller fenotypen til cellene som er isolert. Mens denne studien demonstrerer evnen til å gi et tilstrekkelig antall levedyktige celler med denne prosedyren, kan det være medfødte eller induserte forskjeller i disse cellelinjene som kan påvirke nedstrøms eksperimentering. Det er ofte vanskelig å vite nøyaktig når det er siden vevet er fjernet fra pasienten eller donoren, og spesielt når det gjelder sistnevnte, har tiden siden sirkulasjonen stoppet. Videre er det iboende variasjon mellom vev angående antall levedyktige ventilceller oppnådd, cellens proliferative kapasitet og oppbevaring av cellefenotype. Cellelinjer kan ha genetiske mutasjoner - enten medfødte eller somatiske - som legen og forskerteamet ikke er klar over, og ombygging og etterfølgende håndtering av vevet kan også endre cellefenotypen eller til og med epigenetikk. Som sådan, for alle eksperimenter der disse primære humane cellene brukes, er det helt avgjørende at biologiske replikasjoner - dvs. cellelinjer hentet fra forskjellige pasienter - brukes, til tross for den betydelige tiden og kostnaden de pådrar seg. Dette bidrar til å sikre at eventuelle resultater ikke skyldes forstyrrende effekter fra anskaffelse og behandling av vevet. Den variable proliferasjonshastigheten til forskjellige cellelinjer kan justeres ved enten å samle celler i eksperimenter på forskjellige tidspunkter eller så celler for eksperimenter ved forskjellige tettheter; Ingen svar er best for alle eksperimentelle design. Selv om komplikasjonene ikke er ubetydelige, er bruk av primær human kontroll og CAVD-vevsavledede cellelinjer for in vitro og ex vivo eksperimentelle modeller avgjørende for å definere initierende faktorer og forplantningsprosesser som driver CAVD-patogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

IS mottar institusjonell forskningsstøtte fra Atricure og Medtronic og fungerer som konsulent for Medtronic Vascular. Ingen av disse konfliktene er knyttet til dette arbeidet. Alle andre forfattere har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Jason Dobbins for innsiktsfull diskusjon og kritisk lesning av dette manuskriptet. Vi vil gjerne anerkjenne Center for Organ Recovery and Education for deres hjelp og støtte og takke vevsdonorer og deres familier for å gjøre denne studien mulig. Alle pasientprøver er samlet inn fra personer som er registrert i studier godkjent av det institusjonelle vurderingsstyret ved University of Pittsburgh i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Kadavervev oppnådd via Center for Organ Recovery and Education (CORE) ble godkjent av University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).

Noen figurer laget med Biorender.com.

CSH støttes av National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 og R01 HL142932, American Heart Association 20IPA35260111.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Thermo Scientific 7211345 Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plate Greiner Bio-One 664160 Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipet Fisher 14955234 VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tips VWR 76322-154 Cell culture/cell line expansion
10XL filter tips VWR 76322-132 Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339650 Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710S Tissue and cell fixative
190 proof ethanol Decon 2801 Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesium Gibco 14190250 Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBS Fisher BP2944100 Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tips VWR 76322-134 Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanol Decon 2701 Deparaffinizing tissue samples
2-propanol Fisher A416P 4 Making collagen coated plates
5 mL serological pipet Fisher 14955233 VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dish GenClone 25-260 VEC isolation
6-well cell culture plate Corning 3516 Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacial Fisher BP2401 500 Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidin Invitrogen A12379 Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution Bridge to Life BUW0011L Tissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g Bioworld 220700233 VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody  Abcam ab46794 Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2) Cell Signaling 3528 Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ Dynabeads Invitrogen 11155D VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5 Cell Signaling 2500 Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm pores Corning 431751 VIC isolation
Collagen 1, rat tail protein Gibco A1048301 Making collagen coated plates
Collagenase II Worthington Biochemical Corporation LS004176 Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray Decon 4101 Disinfection
Countess II Automated Cell Counter Invitrogen A27977 Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslips Invitrogen 2026h Automated cell counter required slide cover
Coverslips Fisher 125485E Mounting valve samples
Cryogenic vials Olympus Plastics 24-202 Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula  Clorox N/A Disinfection
DMEM Gibco 10569044 Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 Lonza Walkersville CC3129 Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit Lonza Walkersville CC4176 Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL Microscope Life Technologies Model Number: AME3300 Fluorescent imaging
EVOS XL Microscope Life Technologies AMEX1000 Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium Select R&D Systems S11550 VIC expansion
Fine scissors Fine Science Tools 14088-10 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell Scrapers Fisher 08-100-241 VIC expansion
Fungizone Gibco 15290-026 Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Gentamicin Gibco 15710-064 Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slides Globe Scientific Inc 1358L mounting valve samples
Goat anti-Mouse 488 Invitrogen A11001 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594 Invitrogen A11005 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488 Invitrogen A11008 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594 Invitrogen A11012 Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide Invitrogen A25750 Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) Invitrogen R37606 Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells HyClone Laboratories, Inc. SR30002 Frozen cell storage
Mounting Medium Fisher Chemical Permount SP15-100 Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing container Nalgene 51000001 Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS Spray PromoCell PK-CC91-5051 Disinfection
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140163 Antibiotic. VIC expansion
Plasmocin Invivogen ANTMPT Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibody Abcam ab14106 Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissors Fine Science Tools 14001-14 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swab Puritan 25806 10WC VEC isolation
Swingsette human tissue cassette Simport Scientific M515-2 Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm) Fine Science Tools 11016-17 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061 cell counting solution
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604021 Splitting VIC/VECs
Von Kossa kit Polysciences 246331 Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibody Abcam ab68545 Primary antibody (VEC positive stain)
Xylenes Fisher Chemical X3S-4 Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibody Abcam ab7817 Primary antibody (VIC positive stain)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
  2. Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
  3. Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
  4. Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
  5. Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
  6. Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
  7. Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
  8. Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
  9. Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
  10. Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
  11. Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
  12. Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
  13. Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
  14. Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
  15. Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
  16. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
  17. Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
  18. Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
  19. Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
  20. Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
  21. Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
  22. Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
  23. Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
  24. Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
  25. Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
  26. Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
  27. Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
  28. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
  29. Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
  30. Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  32. Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
  33. Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
  34. St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
  35. Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).

Tags

Biologi utgave 170
Isolering av humane primære ventilceller for in vitro sykdomsmodellering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuevas, R. A., Chu, C. C., Moorhead… More

Cuevas, R. A., Chu, C. C., Moorhead III, W. J., Wong, R., Sultan, I., St. Hilaire, C. Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling. J. Vis. Exp. (170), e62439, doi:10.3791/62439 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter