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Developmental Biology

डेंटल स्टेम सेल के विनियमन का अध्ययन करने के लिए ट्रोवेल-टाइप ऑर्गन कल्चर का उपयोग

Published: July 8, 2021 doi: 10.3791/62462
Automatic Translation
*1,2, *1
1Research Program in Developmental Biology, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 2Department of Oral and Maxillofacial diseases, Faculty of Medicine, University of Helsinki
* These authors contributed equally

Summary

ट्रोवेल-प्रकार की अंग संस्कृति विधि का उपयोग जटिल सिग्नलिंग नेटवर्क को उजागर करने के लिए किया गया है जो दांत के विकास को नियंत्रित करते हैं और हाल ही में, लगातार बढ़ते माउस छेदक के स्टेम कोशिकाओं में शामिल विनियमन का अध्ययन करने के लिए। फ्लोरोसेंट-रिपोर्टर पशु मॉडल और लाइव-इमेजिंग विधियां दंत स्टेम कोशिकाओं और उनके विशिष्ट आला माइक्रोएन्वायरमेंट के गहन विश्लेषण की सुविधा प्रदान करती हैं।

Abstract

अंग विकास, कार्य और पुनर्जनन स्टेम कोशिकाओं पर निर्भर करते हैं, जो स्टेम सेल आला नामक असतत शारीरिक रिक्त स्थान के भीतर रहते हैं। लगातार बढ़ते माउस छेदक ऊतक-विशिष्ट स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है। छेदक के उपकला ऊतक-विशिष्ट स्टेम कोशिकाएं गर्भाशय ग्रीवा लूप नामक एक आला में दांत के समीपस्थ छोर पर स्थित होती हैं। वे दांत के आत्म-तेज सिरे के निरंतर घर्षण को संतुलित करने के लिए कोशिकाओं की निरंतर आमद प्रदान करते हैं। यहां प्रस्तुत माउस छेदक के समीपस्थ छोर के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जिसमें स्टेम सेल और उनके आला हैं। यह एक संशोधित ट्रोवेल-प्रकार का अंग संस्कृति प्रोटोकॉल है जो ऊतक के टुकड़ों (खोजों) के इन विट्रो कल्चर को सक्षम बनाता है, साथ ही धातु ग्रिड द्वारा समर्थित फिल्टर पर तरल / वायु इंटरफ़ेस पर मोटे ऊतक स्लाइस भी सक्षम बनाता है। यहां वर्णित अंग संस्कृति प्रोटोकॉल विवो में संभव नहीं ऊतक जोड़तोड़ को सक्षम बनाता है, और जब फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (ओं) के उपयोग के साथ जोड़ा जाता है, तो यह स्टेम कोशिकाओं सहित समय के साथ जीवित ऊतकों में असतत सेल आबादी की पहचान और ट्रैकिंग के लिए एक मंच प्रदान करता है। स्टेम कोशिकाओं और उनके आला पर उनके प्रभाव के लिए इस प्रणाली में विभिन्न नियामक अणुओं और औषधीय यौगिकों का परीक्षण किया जा सकता है। यह अंततः स्टेम सेल विनियमन और रखरखाव का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

स्टेम कोशिकाओं (एससी) के जीवन भर के संरक्षण के कारण माउस छेदक लगातार बढ़ते हैं जो दांत घटकों के निरंतर उत्पादन का समर्थन करते हैं। इनमें उपकला एससी शामिल हैं, जो तामचीनी-उत्पादक एमेलोब्लास्ट उत्पन्न करते हैं, और मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी), जोअन्य कोशिकाओं के बीच डेंटिन-उत्पादक ओडोंटोब्लास्ट उत्पन्न करते हैं। लगातार बढ़ते छेदकों में उपकला एससी को शुरू में लेबल-रिटेनिंग कोशिकाओं 2,3 के रूप में पहचाना गया था और तब से सोक्स 24 सहित कई प्रसिद्ध स्टेमनेस जीन व्यक्त करने के लिए दिखाया गया है। ये कोशिकाएं अन्य अंगों में उपकला एससी के साथ सामान्य विशेषताओं को साझा करती हैं और एससी आला के भीतर रहती हैं जिसे छेदक के लैबियल साइड पर स्थित ग्रीवा लूप कहा जाता है। आला कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स से बना एक गतिशील इकाई है जो एससी गतिविधि5 को नियंत्रित करता है। वंश-अनुरेखण अध्ययनों से पता चला है कि सॉक्स 2 + उपकला एससी दांत के पूरे उपकला डिब्बे को पुनर्जीवित कर सकते हैं और वे उत्तराधिकार दांत गठन 6,7 के लिए महत्वपूर्ण हैं। डेंटिन रिपैरेटिव या पुनर्योजी क्षमता वाले एमएससी को बड़े पैमाने पर रक्त वाहिकाओं और नसों 8,9,10,11 के माध्यम से अंग के बाहर से भर्ती किया जाता है, इसलिए, एमएससी आबादी की भर्ती, प्रवास और आवास का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रदान करता है।

विवो में एससी का अध्ययन करना हमेशा संभव नहीं होता है, क्योंकि कई आनुवंशिक और / या औषधीय जोड़तोड़ अंग होमियोस्टैसिस को प्रभावित कर सकते हैं और / या घातक परिणाम हो सकते हैं। इसलिए, अंग संस्कृति एससी और उनके आला के विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करती है। धातु ग्रिड का उपयोग करने वाली अंग संस्कृति प्रणाली को शुरू में अंग विकास का अध्ययन करने के लिए ट्रोवेल12 द्वारा विकसित किया गया था और गुर्दे के विकास में प्रेरक संकेतों का अध्ययन करने के लिए सक्सेन13 द्वारा आगे संशोधित किया गया है। तब से, अंग के पूरे या हिस्से को संवर्धन करने की इस इन विट्रो विधि को विभिन्न क्षेत्रों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। दांतों के विकास के क्षेत्र में, इस विधि का व्यापक रूप से उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है जो दांत के विकास को नियंत्रित करता है14 और उत्तराधिकार दांत गठन15। थेस्लेफ प्रयोगशाला के काम ने दांतों के विकास और मोर्फोजेनेसिस के अस्थायी विश्लेषण के लिए, दांत के विकास पर विभिन्न अणुओं और विकास कारकों के प्रभाव के विश्लेषण के लिए, और दांतोंके विकास की टाइम-लैप्स लाइव इमेजिंग के लिए इस प्रणाली की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है। हाल ही में, इस विधि का उपयोग छेदक एससी और उनके आला18,19 के विनियमन का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जिसे यहां विस्तार से वर्णित किया गया है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में जानवरों का उपयोग शामिल है और सभी प्रक्रियाओं को हेलसिंकी विश्वविद्यालय में जानवरों और पशु सुविधा के उपयोग और देखभाल पर नैतिक समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. अंग संस्कृति पकवान की तैयारी

  1. सभी प्रक्रियाओं को एक लामिनार प्रवाह हुड में करें। 70% इथेनॉल के साथ सतहों को साफ करें और आटोक्लेव ग्लास उपकरणों और समाधानों का उपयोग करें। कांच-मोती स्टरलाइज़र में कैंची और अन्य धातु उपकरणों को निष्फल करें।
  2. इथेनॉल को हटाने के लिए 1x PBS में तीन बार धोकर सामान्य रूप से 70% इथेनॉल में संग्रहीत फिल्टर तैयार करें (चित्रा 1)। फिल्टर को आयताकार टुकड़ों (3 x 3-5 x 5 मिमी) में काटें।
    नोट: धुले हुए फिल्टर टुकड़े 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS में कई दिनों तक संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  3. संस्कृति माध्यम तैयार करें (1: 1 डीएमईएम: एफ 12 1% [v/v] 200 mM L-alanyl-L-Glutamine डाइपेप्टाइड के साथ 0.85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/mL एस्कॉर्बिक एसिड, और 0.2% [v/v] पेनिसिलिन [10,000 I.U./mL] और स्ट्रेप्टोमाइसिन [10,000 μg/mL])। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 35 मिमी पेट्री डिश में 30 मिमी धातु ग्रिड (1-2 मिमी व्यास छेद के साथ जो ऊतक इमेजिंग को सक्षम करता है) रखें। हवा के बुलबुले का उत्पादन किए बिना ग्रिड की सतह तक पहुंचने के लिए पर्याप्त मीडिया जोड़ें। तैयार कल्चर डिश को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्म करें जब तक कि ऊतक अलग न हो जाए और संस्कृति के लिए तैयार न हो जाए (5% सीओ2 और 90% -95% आर्द्रता के साथ एक मानक इनक्यूबेटर में)।

2. समीपस्थ छोर का छेदक विच्छेदन और अलगाव

  1. एक अनुमोदित पशु देखभाल प्रोटोकॉल का पालन करते हुए जानवरों की बलि दें।
  2. माउस का सिर काट दें और जबड़े को चीर दें। ऐसा करने के लिए, पहले जबड़े को उजागर करने के लिए त्वचा को हटा दें और इसे मैक्सिला और सिर के बाकी हिस्सों से अलग करने के लिए मालिश की मांसपेशियों को काट लें।
  3. एक बार जबड़ा अलग हो जाने के बाद, जीभ और जितना संभव हो उतना नरम ऊतक हटा दें।
  4. सभी जबड़े इकट्ठा करें और उन्हें बर्फ पर पीबीएस युक्त पेट्री डिश में रखें, क्योंकि यह ऊतकों की व्यवहार्यता को बढ़ाता है।
  5. एक जबड़े को ग्लास पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत छेदक को विच्छेदित करने के लिए डिस्पोजेबल 20/26 जी हाइपोडर्मिक सुइयों का उपयोग करें। जबड़े को मध्य रेखा पर विभाजित करें, सिम्फिसिस को काटें। बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए हड्डी की सतह से नरम और मांसपेशियों के ऊतकों को साफ करें।
    नोट: एक ग्लास पेट्री डिश आवश्यक है, क्योंकि यह सुइयों को कुंद नहीं करेगा।
  6. 10 दिनों से कम उम्र के जानवरों से प्राप्त जबड़ा नरम और अधिक नाजुक होते हैं, इसलिए, छेदक दांत को उजागर करने के लिए जबड़े के प्रत्येक आधे हिस्से को खोलने के लिए डिस्पोजेबल 20/26 जी हाइपोडर्मिक सुइयों का उपयोग करें। 10 दिनों से अधिक उम्र के चूहों के लिए, जबड़े को पकड़ने के लिए चिमटी का उपयोग करें और दांत को उजागर करने के लिए हड्डी को तोड़ दें।
  7. धीरे से छेदक को आसपास की हड्डी से अलग करें और समीपस्थ छोर को काट दें, जिसमें ग्रीवा लूप होता है।
  8. समीपस्थ छोर को काटें और खनिज युक्त तामचीनी और डेंटिन मैट्रिक्स को हटा दें।
  9. डलबेको के पीबीएस में एकत्रित समीपस्थ सिरों को बर्फ पर रखें जब तक कि संस्कृति के लिए तैयार न हो।

3. संस्कृति

  1. सावधानी से एक फिल्टर आयत को पूर्व-गर्म संस्कृति डिश में ग्रिड के शीर्ष पर रखें।
  2. ऊतक के टुकड़ों को ठीक से उन्मुख करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  3. 5% CO2 और 90% -95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक इनक्यूबेटर में रखें।
  4. हर दूसरे दिन माध्यम को बदलें और हवा के बुलबुले के गठन से सावधानीपूर्वक बचते हुए, ताजा माध्यम से बदलें। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे का उपयोग करके रोजाना ऊतक वृद्धि और तस्वीर की निगरानी करें।

4. संस्कृति में घुलनशील कारकों को जोड़ना

  1. एससी के विनियमन पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए घुलनशील कारकों और रुचि के अणुओं के साथ संस्कृति माध्यम को पूरक करें।
    नोट: किसी भी अणु (विकास कारक, सिग्नलिंग अणु, अवरुद्ध एंटीबॉडी, औषधीय यौगिक जैसे अवरोधक या सक्रियकर्ता, वैक्टर, आदि) के लिए प्रशासन प्रोटोकॉल इसके आधे जीवन और घुलनशीलता पर निर्भर करता है। ये पैरामीटर उपयोग किए जाने वाले उपयुक्त नियंत्रण को भी निर्धारित करते हैं।

5. आणविक और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

  1. संस्कृति माध्यम को हटा दें।
  2. फिल्टर से अलगाव को रोकने के लिए ऊतकों में बर्फ-ठंडा मेथनॉल सावधानीपूर्वक जोड़ें।
  3. 5 मिनट के लिए मेथनॉल छोड़ दें।
  4. नमूना ट्यूबों में ऊतक खोजों को ले जाने वाले फिल्टर स्थानांतरित करें।
  5. पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-24 घंटे के लिए खोजों को ठीक करें।
  6. हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग (पैराफिन, जमे हुए, आदि) या इम्यूनोस्टेनिंग के लिए स्थापित प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।

6. ऊतक स्लाइस की संस्कृति

नोट: इस प्रोटोकॉल में कई भिन्नताएं हैं, जो सभी समान रूप से सफल हैं और उपयोगकर्ता की गति और कौशल के आधार पर व्यक्तिगत पसंद का मामला हैं। ये ऊतक व्यवहार्यता को इकट्ठा करने और बनाए रखने के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर को संदर्भित करते हैं। इस उद्देश्य के लिए, क्रेब्स बफर, पीबीएस 2% ग्लूकोज और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक, या पीबीएस का उपयोग किया जा सकता है। यदि क्रेब्स बफर का उपयोग किया जाता है, तो इसे 1 दिन पहले बनाया जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।

  1. प्रयोग से पहले, 2-2.5 ग्राम कम पिघलने वाले बिंदु अगारोस को 50 एमएल उबलते 2% ग्लूकोज / पीबीएस में घोलकर 4% -5% कम पिघलने बिंदु अग्रोस तैयार करें, जिसके बाद घोल को 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा जाना चाहिए।
  2. वाइब्रेटोम सेट करें, 70% इथेनॉल के साथ धोएं, और एंटीबायोटिक दवाओं (100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक बर्फ-ठंडा 2% ग्लूकोज / पीबीएस से भरें।
  3. छेदक के समीपस्थ सिरों को विच्छेदित करें और उन्हें एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक बर्फ-ठंडे 2% ग्लूकोज / पीबीएस में इकट्ठा करें।
  4. सांचे में छेदक के एक समीपस्थ छोर को रखें जिसमें 4% -5% कम पिघलने बिंदु अगारोस होता है। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, टुकड़े को वांछित दिशा में उन्मुख करें और अगारोस को कठोर होने के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
  5. कठोर अगारोस ब्लॉक को ट्रिम करें और इसे विब्राटोम में रखें। मोटी स्लाइस (150-300 μm) काटें।
  6. एक पेट्री डिश में स्लाइस इकट्ठा करें जिसमें बर्फ-ठंडा 2% ग्लूकोज / पीबीएस एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक होता है।
  7. खंड 1.3 के अनुसार तैयार किए गए पूर्व-गर्म ग्रिड पर रखे फिल्टर आयत पर मोटी स्लाइस को स्थानांतरित करने के लिए स्पैटुला का उपयोग करें।
  8. इनक्यूबेटर में मोटी स्लाइस को इनक्यूबेट करें और इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें (चित्रा 2)।

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Representative Results

उपकला एससी ग्रीवा लूप नामक एक आला में रहते हैं, जो छेदक के समीपस्थ छोर पर स्थित है (चित्रा 3 ए)। ग्रीवा लूप आंतरिक और बाहरी तामचीनी उपकला से बने रूपात्मक रूप से अलग-अलग संरचनाएं हैं जो स्टेलेट रेटिकुलम को घेरती हैं, जो शिथिल रूप से व्यवस्थित उपकला कोशिकाओं का एक कोर है (चित्रा 3 बी, सी)। प्रत्येक छेदक में दो ग्रीवा लूप होते हैं (चित्रा 3 ए), लेकिन केवल लैबियल ग्रीवा लूप में एससी होते हैं। उपकला एससी को ग्रीवा लूप20,21 के सिरे पर स्टेलेट रेटिकुलम और आसन्न तामचीनी उपकला के लिए स्थानीयकृत किया जाता है। वे एसएफआरपी 5 अभिव्यक्ति की विशेषता वाली संतान उत्पन्न करते हैं, जो अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव ट्रांजिट-एम्प्लीफाइंग कोशिकाओं में अंतर करते हैं जो तामचीनी-स्रावित एमेलोब्लास्ट्स 2,7 सहित विभिन्न कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। एससी से एमेलोब्लास्ट भेदभाव को यहां वर्णित अंग संस्कृति प्रणाली में पुन: परिभाषित किया जा सकताहै।

हाल के वर्षों में, रिपोर्टर चूहे जिसमें एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे जीएफपी) विशिष्ट जीन नियामक तत्वों के नियंत्रण में है, विभिन्न ऊतकों से कोशिकाओं की पहचान करने और उन्हें अलग करने और विवो और इन विट्रो22,23 में सेल भाग्य और वंश प्रगति का पालन करने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला उपकरण बन गया है। इन पशु मॉडलों का उपयोग विभिन्न नियामक अणुओं के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए फायदेमंद है, क्योंकि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अभिव्यक्ति की तीव्रता और पैटर्न का उपयोग अंतर्जात जीन गतिविधि के रीडआउट के रूप में, या प्रसार की स्थिति के रिपोर्टर के रूप में किया जा सकता है (यानी, फुची रिपोर्टर माउस मॉडल)।

सॉक्स 2-जीएफपी ट्रांसजेनिक रिपोर्टर माउस मॉडल24, जिसमें बढ़ी हुई जीएफपी (ईजीएफपी) अभिव्यक्ति एसओएक्स 2 प्रमोटर के अपस्ट्रीम नियामक तत्व के 5.5 केबी टुकड़े के नियंत्रण में है, सॉक्स 2-व्यक्त छेदक उपकला स्टेम कोशिकाओं की पहचान और विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है (चित्रा 4 ए-सी)। चूहों की पीढ़ी जो कई फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ले जाती है, एक से अधिक सेल आबादी की पहचान के लिए उपयोगी हो सकती है। उदाहरण के लिए, सॉक्स 2-जीएफपी से ग्रीवा लूप में; फुकी-एमकेओ ट्रांसजेनिक जानवर स्टेम सेल (जीएफपी +, हरा, चित्रा 4 डी) और गैर-प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं (फुकआई-एमकेओ +, लाल, चित्रा 4 डी) की पहचान की जा सकती है। इसके अलावा, विभिन्न अणुओं के प्रभाव का विश्लेषण करते समय सॉक्स 2-जीएफपी अभिव्यक्ति का उपयोग रिपोर्टर के रूप में किया जा सकता है। डब्ल्यूएनटी / β-कैटेनिन सिग्नलिंग एक्टिवेटर बायो के अलावा एसओएक्स 2-व्यक्त स्टेम कोशिकाओं और परिणामस्वरूप जीएफपी अभिव्यक्ति (चित्रा 4 ई) को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है।

Figure 1
चित्र 1: संस्कृति कक्ष की तैयारी। (A) फ़िल्टर को 1x PBS में धोएं। (बी) फिल्टर को आयताकार टुकड़ों में काट लें। (सी) हुड में मीडिया तैयार करें और इसे ग्रिड के माध्यम से पाइप करें। एयर बबल बनने से बचें। (डी) ग्रिड पर रखे गए फिल्टर पर ऊतक खोजों को जोड़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-तैयार कल्चर डिश को प्रीवार्म करें। (ई) संस्कृति कक्ष का कार्टून प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ऊतक स्लाइस का संवर्धन। 2-दिन-प्रसवोत्तर (2पीएन) माउस छेदक के समीपस्थ छोर को विब्राटोम द्वारा विच्छेदित और विभाजित किया गया था। स्लाइस (150 μm मोटी) को सुसंस्कृत किया गया था और 6-दिवसीय संस्कृति के बाद कठोर ऊतक गठन (तीर) देखा गया था। स्केल 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: सर्वाइकल लूप ( ए) छेदक युक्त लैबियल का समीपस्थ छोर (काली डैश्ड लाइन द्वारा उल्लिखित) और भाषाई (ग्रे डैश्ड लाइन द्वारा उल्लिखित) ग्रीवा लूप। (बी) लैबियल ग्रीवा लूप का हिस्टोलॉजिकल खंड, जो उपकला स्टेम कोशिकाओं के लिए एक आला का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) लैबियल सर्वाइकल लूप और उसके घटकों का कार्टून प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एक अंग संस्कृति प्रणाली में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस मॉडल का उपयोग। (ए) ब्राइटफील्ड, (बी) फ्लोरोसेंट, और (सी) 2-दिवसीय प्रसवोत्तर सॉक्स 2-जीएफपी चूहों से अलग छेदक के समीपस्थ छोर की ओवरले छवि। (डी) 2-दिवसीय प्रसवोत्तर सॉक्स 2-जीएफपी से अलग छेदक के समीपस्थ छोर में सॉक्स 2-जीएफपी और फुकी-एमकेओ अभिव्यक्ति; फुकी-एमकेओ चूहे। (ई) सॉक्स 2-जीएफपी और स्टेम सेल आला (गर्भाशय ग्रीवा लूप, पीले डैश्ड लाइन द्वारा रेखांकित) को व्यक्त करने वाली स्टेम कोशिकाओं पर बायो का प्रभाव। स्केल 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इन विट्रो ऑर्गन कल्चर का उपयोग प्रेरक क्षमता और उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है जो अंग विकास और मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करते हैं। थेस्लेफ प्रयोगशाला ने प्रदर्शित किया है कि ट्रोवेल-प्रकार के अंग संस्कृति के सैक्सन संशोधन को कैसे अनुकूलित किया जाए और दांतों के विकास का अध्ययन करने के लिए इसका उपयोग कियाजाए। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थितियों और प्रगति ने इसे दांत मोर्फोजेनेसिस और अलग सेल आबादी की निगरानी के लिए एक उपयोगी तरीका बना दिया है। इस पेपर में बताया गया है कि उपकला स्टेम कोशिकाओं और माइक्रोएन्वायरमेंट का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को कैसे लागू किया जाए जिसमें वे रहते हैं।

छेदक के समीपस्थ छोर को अलग करने की एक तकनीक जिसमें प्रसवोत्तर पिल्ले और पुराने जानवरों से एससी आला शामिल है, यहां वर्णित किया गया था। इस विधि की सफलता अलगाव समय (जो सीधे ऊतक व्यवहार्यता को प्रभावित करती है) और एक अक्षुण्ण लैबियल ग्रीवा लूप के साथ एक क्षतिग्रस्त समीपस्थ छोर को अलग करने की क्षमता पर निर्भर करती है। यह खनिज हड्डी वाले पुराने जानवरों में विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है। प्रोटोकॉल दिखाता है कि खनिज युक्त हड्डी को तोड़ने के लिए नियंत्रित यांत्रिक बल का उपयोग कैसे करें और अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल25 की तुलना में काफी कम समय में पूरी तरह से बरकरार और व्यवहार्य नरम ऊतक को अलग करें। एक बार अलग होने के बाद, ऊतक को विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है, या तो पूरे के रूप में या एक मोटे टुकड़े के रूप में। मोटी ऊतक स्लाइसिंग विधि का नुकसान यह है कि प्रत्येक स्लाइस में ग्रीवा लूप का केवल एक हिस्सा मौजूद है; इस प्रकार, विभिन्न वर्गों में ग्रीवा लूप का एक समान हिस्सा प्राप्त करना संभव नहीं है। अंग संस्कृति आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करती है जो समय के साथ एससी और उनके आला को नियंत्रित करती है। हालांकि, कुल संस्कृति अवधि की सीमाएं हैं, मुख्य रूप से संस्कृति के शुरुआती 3-4 दिनों के बाद मेसेनकाइमल के प्रगतिशील नुकसान के कारण।

पृथक ऊतक को छेदक उपकला एससी26 में समृद्ध एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है। समीपस्थ छोर के बाकी हिस्सों से ग्रीवा लूप का एंजाइमेटिक पृथक्करण और विशिष्ट फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग अधिक विस्तृत एमआरएनए और प्रोटीन विश्लेषण (जैसे क्यूपीसीआर, एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण) और आला के भीतर विशिष्ट सेल आबादी में अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

इन विट्रो कल्चर दांत उपकला एससी और उनके आला पर उनके नियामक प्रभाव के लिए विभिन्न आनुवंशिक और औषधीय जोड़तोड़ की जांच के लिए एक उपयुक्त मंच प्रदान करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि औषधीय उपचार की सफलता परीक्षण किए गए अणुओं के गुणों पर निर्भर करती है, जैसे कि आधा जीवन, घुलनशीलता, चयापचय स्थिरता, खुराक और सेल विषाक्तता। एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ संयोजन में, नियामक प्रभाव को एक ऊतक के भीतर एक विशिष्ट सेल आबादी को सौंपा जा सकता है, इस प्रकार आणविक और सेलुलर तंत्र को उजागर करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है जो दांत उपकला एससी और उनके आला को नियंत्रित करता है।

विशिष्ट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों के उपयोग के साथ, समय के साथ जीवित ऊतक के भीतर विशिष्ट सेल आबादी की पहचान और पालन करना संभव है। हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इन विट्रो अंग संस्कृति का उपयोग दांतों के विकास की लाइव इमेजिंग के लिए किया जा सकताहै। इसके अलावा, मोटी ऊतक स्लाइस 7 के इन विट्रो संस्कृति का उपयोग करके सेल व्यवहार को थोड़े समय में चित्रितकिया जा सकता है। जैसा कि पहले संकेत दिया गया है, एससी आला के केवल एक हिस्से को चित्रित किया जा सकता है और इमेजिंग अवधि संक्षिप्त है। आदर्श रूप से, पूरे एससी आला को चित्रित किया जाना चाहिए। हालांकि, इस संरचना की 4 डी टाइम-लैप्स इमेजिंग चुनौतीपूर्ण है, मुख्य रूप से आला की मोटाई और वर्तमान में उपलब्ध इमेजिंग विधियों की सीमाओं के कारण। फिर भी, इमेजिंग तकनीक में निरंतर प्रगति सेलुलर व्यवहारों को उजागर करने में एक रोमांचक भविष्य का वादा करती है जो छेदक एससी आला का गठन करते हैं।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जेन और एटोस एर्को फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles Terumo
DMEM Gibco 61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14287
Extra Fine Bonn Scissors F.S.T. 14084-08
F-12 Gibco 31765-027
FBS South American (CE) LifeTechn. 10270106 divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer Simon Keller Ltd 4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Gibco 35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter MerckMillipore VCTP02500 Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid Sigma A4544-25g diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose TopVision R0801
Metal grids Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps Medicon 07.60.03
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. Gibco 15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass DWK Life Sciences 9170442
Petridish 35 mm, with vent Duran 237554008
Petridish 90 mm, no vent classic Thermo Fisher 101RT/C
Small scissors

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References

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Juuri, E., Balic, A. Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells. J. Vis. Exp. (173), e62462, doi:10.3791/62462 (2021).

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