Summary
トロウェル型臓器培養法は、歯の発達を支配する複雑なシグナル伝達ネットワークを解明するために使用され、最近では、継続的に成長するマウス切歯の幹細胞に関与する調節を研究するために使用されています。蛍光レポーター動物モデルとライブイメージング法は、歯科幹細胞とその特定のニッチ微小環境の詳細な分析を容易にします。
Abstract
臓器の発生、機能、および再生は、幹細胞ニッチと呼ばれる個別の解剖学的空間内に存在する幹細胞に依存しています。継続的に成長するマウス切歯は、組織特異的幹細胞を研究するための優れたモデルを提供します。切歯の上皮組織特異的幹細胞は、頸部ループと呼ばれるニッチの歯の近位端に位置しています。それらは、歯の自己研ぎ先端の絶え間ない摩耗を相殺するために細胞の連続的な流入を提供する。ここに提示されるのは、幹細胞とそのニッチを収容するマウス切歯の近位端の単離と培養のための詳細なプロトコルです。これは、組織片(外植片)の in vitro 培養を可能にする修正トロウェルタイプの臓器培養プロトコルであり、金属グリッドで支えられたフィルター上の液体/空気界面の厚い組織スライスを可能にします。ここで説明する臓器培養プロトコルは 、in vivoでは 不可能な組織操作を可能にし、蛍光レポーターの使用と組み合わせると、幹細胞を含む生きた組織中の離散的な細胞集団の経時的な識別と追跡のためのプラットフォームを提供します。このシステムでは、幹細胞とそのニッチに対する効果について、さまざまな調節分子や薬理学的化合物を試験することができます。これは最終的に幹細胞の調節と維持を研究するための貴重なツールを提供します。
Introduction
マウスの切歯は、歯の成分の絶え間ない生産をサポートする幹細胞(SC)の生涯保存により、継続的に成長します。これらには、エナメル質産生アメロブラストを生成する上皮SCや、象牙質産生歯芽細胞を生成する間葉系幹細胞(MSC)などが含まれます1。継続的に成長する切歯の上皮SCは、最初はラベル保持細胞として同定され2,3、その後、Sox24を含む多くのよく知られたステムネス遺伝子を発現することが示されています。これらの細胞は他の臓器の上皮SCと共通の特徴を共有し、切歯の唇側に位置する頸部ループと呼ばれるSCニッチ内に存在する。ニッチは、SC活性5を制御する細胞と細胞外マトリックスで構成される動的実体です。系統追跡研究は、Sox2+上皮SCが歯の上皮コンパートメント全体を再生することができ、それらが連続した歯の形成に重要であることを示しています6,7。象牙質修復または再生の可能性を有するMSCは、主に血管および神経を介して臓器外から募集されるため8、9、10、11、したがって、MSC集団の募集、移動、および住居を研究するための適切なモデルを提供します。
遺伝的および/または薬理学的操作の多くは臓器の恒常性に影響を与えたり、致命的な結果をもたらす可能性があるため、in vivoでSCを研究することは常に実行可能であるとは限りません。したがって、臓器培養は、in vitroでSCとそのニッチの調節を研究するための優れたツールを提供します。金属グリッドを利用する臓器培養システムは、当初、臓器発達を研究するためにTrowell12によって開発され、腎臓発達における誘導シグナルを研究するためにSaxen13によってさらに変更されました。それ以来、臓器の全部または一部を培養するこのin vitro法は、さまざまな分野でうまく適用されてきました。歯の発達の分野では、この方法は、歯の発達14と連続的な歯の形成15を支配する上皮間葉系相互作用の研究に広く使用されています。Thesleff研究室の研究は、歯の成長と形態形成の時間的分析、歯の成長に対するさまざまな分子と成長因子の影響の分析、および歯の発達のタイムラプスライブイメージングのためのこのシステムの有用性を実証しました16,17。最近では、この方法は、切歯SCおよびそれらのニッチ18,19の調節を研究するために利用されており、これはここで詳細に説明されている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この議定書には動物の使用が含まれ、すべての手順は、動物の使用と世話に関する倫理委員会とヘルシンキ大学の動物施設によって承認されました。
1. 臓器培養皿の調製
- すべての手順は層流フードで実行します。作業面を70%エタノールで洗浄し、オートクレーブ滅菌したガラス器具と溶液を使用します。はさみやその他の金属機器をガラスビーズ滅菌器で滅菌します。
- 通常70%エタノールで保存されるフィルターを1x PBSで3回洗浄してエタノールを除去して準備します(図1)。フィルターを長方形(3 x 3-5 x 5 mm)にカットします。
注:洗浄されたフィルターピースは、4°Cで1x PBSで数日間保存できます。 - 培養培地を調製します(1:1 DMEM:F12に、0.85%NaCl、10%[v/v] FBS、150 μg/mLアスコルビン酸、0.2%[v/v]ペニシリン[10,000 IU/mL]およびストレプトマイシン[10,000 μg/mL]中の1% [v/v] 200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを添加した)。4°Cで保存してください。
- 30 mmの金属グリッド(組織のイメージングを可能にする直径1〜2 mmの穴付き)を35 mmのペトリ皿に入れます。気泡を発生させずにグリッド表面に到達するのに十分なメディアを追加します。組織が単離されて培養の準備ができるまで、準備した培養皿を37°Cで予熱します(5%CO2 および90%〜95%湿度の標準的なインキュベーター内)。
2.切歯の解剖と近位端の分離
- 承認された動物飼育プロトコルに従って動物を犠牲にしてください。
- マウスを斬首し、下顎骨を解剖します。これを行うには、まず皮膚を取り除いて下顎骨を露出させ、咬筋を切り開いて上顎と頭の残りの部分から分離します。
- 下顎骨が分離されたら、舌とできるだけ多くの軟部組織を取り除きます。
- すべての下顎骨を収集し、氷上のPBSを含むペトリ皿に保管してください。
- 1つの下顎骨をガラスのペトリ皿に移し、使い捨ての20/26 G皮下注射針を使用して、実体顕微鏡下で切歯を解剖します。正中線で下顎骨を分割し、結合を切り裂きます。軟組織と筋肉組織を骨表面からきれいにして、視覚化を改善します。
注:ガラスのペトリ皿は、針を鈍くしないため、不可欠です。 - 10日未満の動物から得られた下顎骨はより柔らかく、より壊れやすいため、使い捨ての20/26 G皮下注射針を使用して下顎骨の各半分を縦方向に開き、切歯を露出させます。10日以上経過したマウスの場合は、ピンセットを使用して下顎骨をつかみ、骨を折って歯を露出させます。
- 切歯を周囲の骨からそっと外し、頸部ループを含む近位端を切り取ります。
- 近位端を切断し、石灰化したエナメル質と象牙質マトリックスを取り除きます。
- 培養の準備ができるまで、収集した近位端をダルベッコのPBSに氷上に置いておきます。
3.文化
- あらかじめ温めた培養皿のグリッドの上部にフィルター長方形を慎重に置きます。
- 実体顕微鏡を使用して、組織片を適切に方向付けます。
- 5%のCO2 および90%〜95%の湿度で37°Cの標準的なインキュベーターに入れる。
- 一日おきに培地を交換し、気泡の形成を慎重に避けて、新しい培地と交換してください。組織の成長を監視し、実体顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して毎日写真を撮ります。
4.培養物に可溶性因子を加える
- 培養液に可溶性因子と目的の分子を補給して、SCの調節に対するそれらの効果を調べます。
注:任意の分子(成長因子、シグナル伝達分子、ブロッキング抗体、阻害剤または活性化剤などの薬理学的化合物、ベクターなど)の投与プロトコルは、その半減期および溶解度に依存する。これらのパラメーターは、使用する適切なコントロールも決定します。
5. 分子・組織学的解析
- 培地を取り出します。
- フィルターからの剥離を防ぐために、氷冷メタノールをティッシュに注意深く追加します。
- メタノールを5分間放置します。
- 組織外植片を運ぶフィルターをサンプリングチューブに移します。
- 外植片をPBS中の4%パラホルムアルデヒドに4°Cで10〜24時間固定します。
- 組織学的処理(パラフィン、凍結など)または免疫染色のための確立されたプロトコルに進みます。
6.組織スライスの培養
注:このプロトコルにはいくつかのバリエーションがあり、それらはすべて等しく成功し、ユーザーの速度とスキルに応じて個人的な選択の問題です。これらは、組織の生存率を収集して維持するために使用されるバッファーを指します。この目的のために、クレブス緩衝液、2%グルコースおよび抗生物質を添加したPBS、またはPBSを使用することができる。クレブス緩衝液を使用する場合は、1日前に作成し、4°Cに保つ必要があります。
- 実験の前に、2〜2.5 gの低融点アガロースを50 mLの沸騰2%グルコース/ PBSに溶解して4%〜5%の低融点アガロースを調製し、その後、溶液を45°Cの水浴に入れます。
- ビブラトームをセットアップし、70%エタノールで洗浄し、抗生物質(100 U / mLペニシリン、100 mg / mLストレプトマイシン)を添加した氷冷2%グルコース/ PBSで満たします。
- 切歯の近位端を解剖し、抗生物質を添加した氷冷の2%グルコース/ PBSに集めます。
- 切歯の1つの近位端を、4%〜5%の低融点アガロースを含む型に入れます。実体顕微鏡下で、ピースを希望の方向に向け、アガロースが固まるまで氷上に置いておきます。
- 硬化したアガロースブロックをトリミングし、ビブラトームに入れます。厚いスライス(150〜300 μm)を切ります。
- 抗生物質を添加した氷冷2%グルコース/ PBSを含むペトリ皿にスライスを収集します。
- へらを使用して、セクション1.3のように準備された予熱されたグリッドに配置されたフィルター長方形に厚いスライスを転送します。
- インキュベーター内で厚いスライスをインキュベートし、イメージングに進みます(図2)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
上皮SCは、切歯の近位端に位置する頸部ループと呼ばれるニッチに存在します(図3A)。頸部ループは、緩く配置された上皮細胞のコアである星状網を包む内側と外側のエナメル質上皮で構成される形態学的に異なる構造です(図3B、C)。各切歯には2つの頸部ループがありますが(図3A)、唇頸部ループにのみSCが含まれています。上皮SCは、頸部ループ20,21の先端にある星状網および隣接するエナメル質上皮に局在する。それらはSfrp5発現を特徴とする子孫を生成し、エナメル質分泌アメロブラストを含むさまざまな細胞を産生する高度に増殖性の高いトランジット増幅細胞に分化します2,7。SCからのアメロブラスト分化は、ここ2に記載の臓器培養系で再現することができる。
近年、蛍光タンパク質(GFPなど)が特定の遺伝子調節要素の制御下にあるレポーターマウスは、さまざまな組織から細胞を同定および単離し、in vivoおよびin vitroで細胞の運命と系統の進行を追跡するために広く使用されるツールになっています22,23。これらの動物モデルの使用は、蛍光レポーター発現の強度およびパターンを内因性遺伝子活性の読み出しとして、または増殖状態のレポーターとして使用することができるので、様々な調節分子の効果を分析するのに有益である(すなわち、Fucciレポーターマウスモデル)。
Sox2プロモーターの上流調節エレメントの5.5 kbフラグメントの制御下で増強されたGFP(EGFP)発現が制御されているSox2-GFPトランスジェニックレポーターマウスモデル24は、Sox2発現切歯上皮幹細胞の同定と可視化を可能にします(図4A-C)。複数の蛍光レポーターを担持するマウスの作製は、複数の細胞集団の同定に有用であり得る。例えば、Sox2-GFPからの頸部ループにおいて;Fucci-mKOトランスジェニック動物幹細胞(GFP+、緑、図4D)および非増殖性細胞(Fucci-mKO+、赤、図4D)を同定することができる。さらに、Sox2-GFP発現は、様々な分子の効果を分析する際のレポーターとして使用することができる。Wnt/β-カテニンシグナル伝達活性化因子BIOの添加は、Sox2発現幹細胞に悪影響を及ぼし、その結果GFP発現に悪影響を及ぼします(図4E)。
図1:培養チャンバーの調製 。 (A)フィルターを1x PBSで洗浄します。(B)フィルターを長方形に切ります。(C)フード内のメディアを準備し、グリッドを通してピペッティングします。気泡の形成を避けてください。(d)予め調製した培養皿を37°Cで予熱してから、グリッド上に設置したフィルター上に組織外植片を加える。(E)文化室の漫画表現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:組織スライスの培養。 生後2日目(2PN)マウス切歯の近位端を解剖し、ビブラトームで切片化した。スライス(厚さ150μm)を培養し、6日間培養後に硬組織形成(矢印)を観察した。スケール100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:頸部ループ 。 (A)切歯を含む唇の近位端(黒い破線で輪郭が描かれている)および舌側(灰色の破線で輪郭が描かれている)頸部ループ。(B)上皮幹細胞のニッチを表す唇頸部ループの組織学的切片。(C)唇頸部ループとその構成要素の漫画的表現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:臓器培養系における蛍光レポーターマウスモデルの使用 。 (A)明視野、(B)蛍光、および(C)生後2日目のSox2-GFPマウスから単離された切歯の近位端のオーバーレイ画像。(d)生後2日目のSox2-GFPから単離された切歯の近位端におけるSox2-GFPおよび Fucci-mKO発現; フッチ-mKOマウス。(E)Sox2-GFPを発現する幹細胞および幹細胞ニッチ(子宮頸管ループ、黄色の破線で囲まれた)に対するBIOの影響。スケール100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
in vitro 臓器培養は、臓器の成長と形態形成を支配する誘導電位と上皮間葉系相互作用を研究するために広く使用されています。Theslef研究室は、トロウェル型臓器培養のサクセン修飾を適応させ、それを使用して歯の発達を研究する方法を実証しました14。再現性のある条件と蛍光レポーターの進歩により、これは歯の形態形成とその中の明確な細胞集団をモニタリングするための有用な方法になりました。この論文では、このプロトコルを適用して上皮幹細胞とそれらが存在する微小環境を研究する方法について説明しました。
SCニッチを含む切歯の近位端を出生後の子犬および高齢の動物から分離するための技術がここで説明されました。この方法の成功は、分離時間(組織の生存率に直接影響する)と、損傷していない近位端を無傷の唇頸部ループで分離する能力に依存します。これは、石灰化した骨を持つ年配の動物では特に困難です。このプロトコルは、制御された機械的力を使用して石灰化した骨を破壊し、他の公開されたプロトコルと比較して有意に短い時間で完全に無傷で生存可能な軟組織を単離する方法を示しています25。単離されると、組織は全体として、または厚いスライスとしてin vitroで培養することができます。厚組織スライス法の欠点は、子宮頸部ループの一部のみが各スライスに存在することです。したがって、異なるセクションで頸部ループの再現性のある同一の部分を得ることは不可能である。臓器培養は、SCとそのニッチを経時的に調節する分子および細胞メカニズムを研究するための簡単で再現性のある方法を提供します。しかしながら、主に最初の培養3〜4日後の間葉が進行的に失われるため、全培養期間には制限がある。
単離された組織をさらに処理して、切歯上皮SCs26に富む単一細胞懸濁液を得ることもできる。子宮頸部ループを近位端の残りの部分から酵素的に分離し、特定の蛍光レポーターを使用することで、より詳細なmRNAおよびタンパク質分析(qPCR、シングルセルRNAシーケンシングなど)が可能になり、ニッチ内の特定の細胞集団に対するより深い洞察が可能になります。
in vitro 培養は、歯の上皮SCおよびそのニッチに対する調節効果について、さまざまな遺伝的および薬理学的操作をスクリーニングするための適切なプラットフォームを提供します。薬理学的処置の成功は、半減期、溶解度、代謝安定性、投与量、および細胞毒性などの試験分子の特性に依存することに留意すべきである。蛍光レポーターと組み合わせることで、調節効果を組織内の特定の細胞集団に割り当てることができるため、歯の上皮SCとそのニッチを調節する分子および細胞メカニズムを明らかにするための強力なツールが提供されます。
特定の蛍光レポーターマウスを使用することで、生きた組織内の特定の細胞集団を経時的に同定し、追跡することができます。最近、in vitro臓器培養が歯の発達のライブイメージングに使用できることが実証されました16。加えて、細胞挙動は、厚い組織切片7のインビトロ培養を用いて短期間にわたって画像化することができる。前に示したように、SCニッチの一部のみを画像化することができ、画像化期間は短い。理想的には、SCニッチ全体を画像化する必要があります。ただし、この構造の4Dタイムラプスイメージングは、主にニッチの厚さと現在利用可能なイメージング方法の限界のために、困難です。それにもかかわらず、イメージング技術の継続的な進歩は、切歯SCニッチを構成する細胞挙動を解明する上でエキサイティングな未来を約束します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、Jane and Aatos Erkko Foundationの支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
