Summary
O método de cultura de órgãos do tipo Trowell tem sido usado para desvendar redes de sinalização complexas que governam o desenvolvimento dentário e, mais recentemente, para estudar a regulação envolvida nas células-tronco do incisivo de camundongos em crescimento contínuo. Modelos animais fluorescentes-repórteres e métodos de imagem ao vivo facilitam análises aprofundadas de células-tronco dentárias e seu microambiente de nicho específico.
Abstract
O desenvolvimento, a função e a regeneração dos órgãos dependem das células-tronco, que residem em espaços anatômicos discretos chamados nichos de células-tronco. O incisivo de camundongo em crescimento contínuo fornece um excelente modelo para estudar células-tronco específicas de tecidos. As células-tronco específicas do tecido epitelial do incisivo estão localizadas na extremidade proximal do dente em um nicho chamado alça cervical. Eles fornecem um influxo contínuo de células para contrabalançar a abrasão constante da ponta auto-afiada do dente. Apresenta-se aqui um protocolo detalhado para o isolamento e cultura da extremidade proximal do incisivo de camundongo que abriga células-tronco e seu nicho. Este é um protocolo de cultura de órgãos do tipo Trowell modificado que permite a cultura in vitro de pedaços de tecido (explantes), bem como as fatias de tecido espesso na interface líquido/ar em um filtro suportado por uma grade metálica. O protocolo de cultura de órgãos descrito aqui permite manipulações teciduais inviáveis in vivo e, quando combinado com o uso de um repórter fluorescente, fornece uma plataforma para a identificação e rastreamento de populações de células discretas em tecidos vivos ao longo do tempo, incluindo células-tronco. Várias moléculas reguladoras e compostos farmacológicos podem ser testados neste sistema quanto ao seu efeito sobre as células-tronco e seus nichos. Isso, em última análise, fornece uma ferramenta valiosa para estudar a regulação e a manutenção das células-tronco.
Introduction
Os incisivos de camundongos crescem continuamente devido à preservação ao longo da vida das células-tronco (SC) que suportam a produção incessante de componentes dentários. Estes incluem SCs epiteliais, que geram ameloblastos produtores de esmalte, e células-tronco mesenquimais (MSCs), que geram odontoblastos produtores de dentina, entre outras células1. Os SCs epiteliais nos incisivos de crescimento contínuo foram inicialmente identificados como células de retenção de rótulo2,3 e, desde então, demonstraram expressar uma série de genes de caule bem conhecidos, incluindo Sox24. Essas células compartilham características comuns com SCs epiteliais em outros órgãos e residem dentro do nicho SC chamado alça cervical localizado no lado labial do incisivo. O nicho é uma entidade dinâmica composta por células e matriz extracelular que controlam a atividade da SC5. Estudos de traçado de linhagem demonstraram que os SCs epiteliais Sox2+ podem regenerar todo o compartimento epitelial do dente e que são cruciais para a formação sucessional do dente 6,7. As CTMs com potencial reparador ou regenerativo dentinário são em grande parte recrutadas de fora do órgão através de vasos sanguíneos e nervos 8,9,10,11, fornecendo, portanto, um modelo adequado para estudar o recrutamento, a migração e o alojamento da população de CTM.
Estudar SCs in vivo nem sempre é viável, uma vez que muitas das manipulações genéticas e/ou farmacológicas podem afetar a homeostase dos órgãos e/ou ter consequências letais. Portanto, a cultura de órgãos fornece uma excelente ferramenta para estudar a regulação das SCs e seus nichos in vitro. O sistema de cultura de órgãos que utiliza uma grade de metal foi inicialmente desenvolvido por Trowell12 para estudar o desenvolvimento de órgãos e foi modificado por Saxen13 para estudar sinais indutivos no desenvolvimento renal. Desde então, este método in vitro de cultura da totalidade ou parte do órgão tem sido aplicado com sucesso em diferentes campos. No campo do desenvolvimento dentário, esse método tem sido amplamente utilizado para estudar as interações epitelial-mesenquimais que regem o desenvolvimento dentário14 e a formação sucessional dentária15. O trabalho do laboratório Thesleff demonstrou a utilidade desse sistema para a análise temporal do crescimento e morfogênese dentária, para a análise do efeito de várias moléculas e fatores de crescimento no crescimento dentário e para a imagem ao vivo em tempo de lapso temporal do desenvolvimento dentário16,17. Mais recentemente, esse método tem sido utilizado para estudar a regulação de SCs incisivos e seu nicho18,19, o que é descrito em detalhes aqui.
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Protocol
Este protocolo envolve o uso de animais e todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês de Ética sobre o Uso e Cuidado de Animais e o Animal Facility da Universidade de Helsinque.
1. Preparação do prato de cultura de órgãos
- Realizar todos os procedimentos em um exaustor de fluxo laminar. Limpe as superfícies de trabalho com etanol a 70% e utilize instrumentos e soluções de vidro autoclavado. Esterilize tesouras e outros equipamentos de metal em um esterilizador de contas de vidro.
- Preparar filtros normalmente armazenados em etanol a 70%, lavando-os três vezes em 1x PBS para retirada do etanol (Figura 1). Corte os filtros em pedaços retangulares (3 x 3-5 x 5 mm).
NOTA: As peças de filtro lavadas podem ser armazenadas por vários dias em 1x PBS a 4 °C. - Preparar o meio de cultura (1:1 DMEM:F12 suplementado com 1% [v/v] 200 mM L-alanil-L-glutamina dipeptídeo em 0,85% de NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/mL de ácido ascórbico e 0,2% [v/v] de penicilina [10.000 UI/mL] e estreptomicina [10.000 μg/mL]). Conservar a 4 °C.
- Coloque as grades metálicas de 30 mm (com orifícios de 1-2 mm de diâmetro que permitam a imagem do tecido) em uma placa de Petri de 35 mm. Adicione meios suficientes para alcançar a superfície da grade sem produzir bolhas de ar. Pré-aqueça o prato de cultura preparado a 37 °C até que o tecido esteja isolado e pronto para a cultura (em incubadora padrão com 5% de CO2 e 90%-95% de umidade).
2. Dissecção do incisivo e isolamento da extremidade proximal
- Sacrificar os animais de acordo com um protocolo de cuidados com os animais aprovado.
- Decapitar o rato e dissecar a mandíbula. Para fazer isso, primeiro remova a pele para expor a mandíbula e corte os músculos masseteres para separá-la da maxila e do resto da cabeça.
- Uma vez que a mandíbula esteja isolada, remova a língua e o máximo de tecido mole possível.
- Colete todas as mandíbulas e mantenha-as em uma placa de Petri contendo PBS no gelo, pois isso aumenta a viabilidade dos tecidos.
- Transfira uma mandíbula para uma placa de Petri de vidro e use agulhas hipodérmicas descartáveis 20/26 G para dissecar o incisivo sob um estereomicroscópio. Divida a mandíbula na linha média, cortando a sínfise. Limpe o tecido mole e muscular longe da superfície óssea para uma melhor visualização.
NOTA: Uma placa de Petri de vidro é essencial, pois isso não embotará as agulhas. - As mandíbulas obtidas de animais com menos de 10 dias são mais macias e frágeis, portanto, use agulhas hipodérmicas descartáveis de 20/26 G para abrir cada metade da mandíbula longitudinalmente para expor o dente incisivo. Para ratos com mais de 10 dias, use uma pinça para segurar a mandíbula e quebrar o osso para expor o dente.
- Desprenda suavemente o incisivo do osso circundante e corte a extremidade proximal, que contém a alça cervical.
- Corte a extremidade proximal e remova o esmalte mineralizado e a matriz dentinária.
- Mantenha as extremidades proximais coletadas no PBS de Dulbecco no gelo até que estejam prontas para a cultura.
3. Cultura
- Coloque cuidadosamente um retângulo de filtro no topo de uma grade em um prato de cultura pré-aquecido.
- Use um estereomicroscópio para orientar adequadamente as peças de tecido.
- Colocar numa incubadora padrão a 37 °C com 5% de CO2 e 90%-95% de humidade.
- Troque o meio a cada dois dias e substitua por meio fresco, evitando cuidadosamente a formação de bolhas de ar. Monitore o crescimento do tecido e fotografe diariamente usando uma câmera conectada ao estereomicroscópio.
4. Adição de fatores solúveis à cultura
- Complementar o meio de cultura com fatores solúveis e moléculas de interesse para estudar seu efeito na regulação de SCs.
NOTA: O protocolo de administração para qualquer molécula (fatores de crescimento, moléculas de sinalização, anticorpos bloqueadores, compostos farmacológicos, como inibidores ou ativadores, vetores, etc.) depende de sua meia-vida e solubilidade. Esses parâmetros também determinam o controle apropriado a ser usado.
5. Análises moleculares e histológicas
- Remova o meio de cultura.
- Adicione cuidadosamente metanol gelado aos tecidos para evitar o descolamento dos filtros.
- Deixe metanol por 5 min.
- Filtros de transferência que transportam explantes de tecidos para tubos de amostragem.
- Fixar os explantes em paraformaldeído a 4% em PBS durante 10-24 h a 4 °C.
- Prossiga com protocolos estabelecidos para processamento histológico (parafina, congelado, etc.) ou imunocolorações.
6. Cultura de fatias de tecido
NOTA: Existem várias variações para este protocolo, que são todas igualmente bem sucedidas e são uma questão de escolha pessoal, dependendo da velocidade e da habilidade do usuário. Estes referem-se ao tampão usado para coletar e manter a viabilidade do tecido. Para este propósito, o tampão de Krebs, PBS suplementado com 2% de glicose e antibióticos, ou PBS pode ser usado. Se for utilizado tampão de Krebs, este deve ser fabricado com 1 dia de antecedência e mantido a 4 °C.
- Antes do experimento, preparar agarose de baixo ponto de fusão a 4%-5% dissolvendo 2-2,5 g de agarose de baixo ponto de fusão em 50 mL de glicose a 2% de ebulição/PBS, após o que a solução deve ser colocada em banho-maria de 45 °C.
- Configure o vibratome, lave com etanol a 70% e encha com 2% de glicose/PBS gelado suplementado com antibióticos (100 U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina).
- Dissecar as extremidades proximais do incisivo e coletá-las no gelado 2% de glicose/PBS suplementado com antibióticos.
- Coloque uma extremidade proximal do incisivo no molde contendo 4% a 5% de agarose de baixo ponto de fusão. Sob um estereomicroscópio, oriente a peça na direção desejada e deixe no gelo para que a agarose endureça.
- Apare o bloco de agarose endurecido e coloque-o no vibratome. Corte fatias grossas (150-300 μm).
- Colete as fatias em uma placa de Petri contendo 2% de glicose gelada / PBS suplementada com antibióticos.
- Utilizar uma espátula para transferir as fatias grossas num rectângulo de filtro colocado na grelha pré-aquecida preparada como no ponto 1.3.
- Incubar os cortes espessos na incubadora e proceder à imagem (Figura 2).
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Representative Results
Os SCs epiteliais residem em um nicho denominado alça cervical, que se localiza na extremidade proximal do incisivo (Figura 3A). As alças cervicais são estruturas morfologicamente distintas compostas de epitélio interno e externo do esmalte que envolvem o retículo estrelado, um núcleo de células epiteliais frouxamente dispostas (Figura 3B,C). Existem duas alças cervicais em cada incisivo (Figura 3A), mas apenas a alça cervical labial contém SCs. Os SCs epiteliais estão localizados no retículo estrelado e no epitélio do esmalte adjacente na ponta da alça cervical20,21. Eles geram progênie caracterizada pela expressão de Sfrp5, que se diferenciam em células amplificadoras de trânsito altamente proliferativas que produzem várias células, incluindo ameloblastos secretores de esmalte 2,7. A diferenciação de ameloblastos de SCs pode ser recapitulada no sistema de cultura de órgãos aqui descrito2.
Nos últimos anos, camundongos repórteres nos quais uma proteína fluorescente (como a GFP) está sob o controle de elementos reguladores genéticos específicos tornaram-se uma ferramenta amplamente utilizada para identificar e isolar células de vários tecidos e acompanhar o destino celular e a progressão da linhagem in vivo e in vitro22,23. O uso desses modelos animais é benéfico para analisar o efeito de várias moléculas reguladoras, uma vez que a intensidade e o padrão de expressão do repórter fluorescente podem ser usados como uma leitura da atividade gênica endógena, ou como um relator do status de proliferação (ou seja, modelo de camundongo repórter Fucci).
O modelo24 de camundongo repórter transgênico Sox2-GFP, no qual a expressão aumentada de GFP (EGFP) está sob o controle de um fragmento de 5,5 kb do elemento regulador a montante do promotor Sox2, permite a identificação e visualização de células-tronco epiteliais incisivas expressas de Sox2 (Figura 4A-C). A geração de camundongos que carregam vários repórteres fluorescentes pode ser útil para a identificação de mais de uma população celular. Por exemplo, em alças cervicais de Sox2-GFP; Células-tronco de animais transgênicos Fucci-mKO (GFP+, verde, Figura 4D) e células não proliferativas (Fucci-mKO+, vermelho, Figura 4D) podem ser identificadas. Além disso, a expressão de Sox2-GFP pode ser usada como um repórter ao analisar o efeito de várias moléculas. A adição do ativador de sinalização Wnt/β-catenina BIO afeta negativamente as células-tronco que expressam Sox2 e, consequentemente, a expressão de GFP (Figura 4E).
Figura 1: Preparação da câmara de cultura . (A) Lave o filtro em 1x PBS. (B) Corte o filtro em pedaços retangulares. (C) Prepare a mídia no capô e canalize-a através da grade. Evite a formação de bolhas de ar. (D) Pré-aqueça o prato de cultura pré-preparado a 37 °C antes de adicionar explantes de tecido num filtro colocado na grelha. (E) Representação de desenhos animados da câmara de cultura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cultivo de fatias de tecido. A extremidade proximal de um incisivo de camundongo pós-natal (2PN) de 2 dias foi dissecada e seccionada por vibratome. Cortes (150 μm de espessura) foram cultivados e a formação de tecido duro (setas) foi observada após uma cultura de 6 dias. Escala de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Alça cervical. (A) Extremidade proximal das alças cervicais labiais contendo incisivos (delineadas por linha tracejada preta) e lingual (delineada por linha tracejada cinzenta). (B) Secção histológica da alça cervical labial, que representa um nicho para as células-tronco epiteliais. (C) Representação cartunesca da alça cervical labial e seus componentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Uso de modelos fluorescentes de camundongos repórteres em um sistema de cultura de órgãos . (A) Brightfield, (B) fluorescente e (C) imagem de sobreposição da extremidade proximal do incisivo isolado de camundongos Sox2-GFP pós-natais de 2 dias. (D) Expressão de Sox2-GFP e Fucci-mKO na extremidade proximal do incisivo isolado de Sox2-GFP pós-natal de 2 dias; Ratos Fucci-mKO. (E) Efeito da BIO sobre as células-tronco que expressam Sox2-GFP e o nicho de células-tronco (alça cervical, delineada por linha tracejada amarela). Escala de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A cultura de órgãos in vitro tem sido amplamente utilizada para estudar o potencial indutivo e as interações epitelial-mesenquimais que governam o crescimento e a morfogênese dos órgãos. O laboratório Thesleff demonstrou como adaptar a modificação de Saxén da cultura de órgãos do tipo Trowell e usá-la para estudar o desenvolvimento dentário14. As condições reprodutíveis e os avanços nos repórteres fluorescentes tornaram este um método útil para monitorar a morfogênese dentária e as distintas populações celulares no interior. Este artigo descreveu como aplicar este protocolo para estudar as células-tronco epiteliais e o microambiente em que residem.
Uma técnica de isolamento da extremidade proximal do incisivo que contém o nicho SC de filhotes pós-natais e de animais mais velhos foi descrita aqui. O sucesso deste método depende do tempo de isolamento (que afeta diretamente a viabilidade do tecido) e da capacidade de isolar uma extremidade proximal não danificada com uma alça cervical labial intacta. Isso é particularmente desafiador em animais mais velhos com osso mineralizado. O protocolo mostra como utilizar a força mecânica controlada para quebrar o osso mineralizado e isolar tecidos moles totalmente intactos e viáveis em um tempo significativamente menor quando comparado a outros protocolos publicados25. Uma vez isolado, o tecido pode ser cultivado in vitro, como um todo ou como uma fatia grossa. A desvantagem do método de fatiamento de tecido espesso é que apenas uma parte da alça cervical está presente em cada fatia; assim, a obtenção de uma porção reprodutivelmente idêntica da alça cervical em diferentes cortes não é possível. A cultura de órgãos fornece um método fácil e reprodutível para estudar os mecanismos moleculares e celulares que regulam os SCs e seu nicho ao longo do tempo. No entanto, existem limitações para o período total de cultura, principalmente devido à perda progressiva de mesênquima após os 3-4 dias iniciais de cultura.
O tecido isolado também pode ser processado para obter uma suspensão unicelular enriquecida em SCs epiteliais incisivos26. A separação enzimática da alça cervical do resto da extremidade proximal e o uso de repórteres fluorescentes específicos permitem análises mais detalhadas de mRNA e proteínas (como qPCR, sequenciamento de RNA unicelular) e uma maior percepção de populações celulares específicas dentro do nicho.
A cultura in vitro fornece uma plataforma adequada para a triagem de várias manipulações genéticas e farmacológicas quanto ao seu efeito regulador sobre os SCs epiteliais dentários e seus nichos. Deve-se notar que o sucesso dos tratamentos farmacológicos depende das propriedades das moléculas testadas, como meia-vida, solubilidade, estabilidade metabólica, dosagem e toxicidade celular. Em combinação com um repórter fluorescente, o efeito regulador pode ser atribuído a uma população celular específica dentro de um tecido, fornecendo assim uma ferramenta poderosa para descobrir os mecanismos moleculares e celulares que regulam os SCs epiteliais dentários e seu nicho.
Com o uso de camundongos repórteres fluorescentes específicos, é possível identificar e acompanhar populações celulares específicas dentro de tecidos vivos ao longo do tempo. Recentemente, tem sido demonstrado que a cultura de órgãos in vitro pode ser utilizada para imagens vivas do desenvolvimento dentário16. Além disso, o comportamento celular pode ser fotografado em um curto período de tempo usando cultura in vitro de fatias de tecido espesso7. Como indicado anteriormente, apenas uma parte do nicho SC pode ser fotografada e a duração da imagem é breve. Idealmente, todo o nicho de SC deve ser fotografado. No entanto, a imagem de lapso de tempo 4D dessa estrutura é um desafio, principalmente devido à espessura do nicho e às limitações dos métodos de imagem atualmente disponíveis. No entanto, os avanços contínuos na tecnologia de imagem prometem um futuro empolgante no desvendamento de comportamentos celulares que constituem o nicho SC incisivo.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação Jane e Aatos Erkko.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
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