نمذجة آثار الإجهاد الدموي على الخلايا السرطانية المتداولة باستخدام حقنة وإبرة
Summary
هنا نظهر طريقة لتطبيق إجهاد القص السائل على الخلايا السرطانية المعلقة لنمذجة آثار الإجهاد الدموي على الخلايا السرطانية المتداولة.
Abstract
أثناء الانبثاث ، والخلايا السرطانية من الأنسجة الصلبة ، بما في ذلك الظهارة ، والوصول إلى الدورة الدموية اللمفاوية والهيماتوجينية حيث يتعرضون للإجهاد الميكانيكي بسبب تدفق الدم. واحدة من هذه الضغوط أن الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) تجربة الإجهاد القص السوائل (FSS). في حين أن الخلايا السرطانية قد تواجه مستويات منخفضة من FSS داخل الورم بسبب التدفق الخلالي ، تتعرض CTCs ، دون ارتباط مصفوفة خارج الخلية ، لمستويات أعلى بكثير من FSS. من الناحية الفسيولوجية ، يتراوح FSS على 3-4 أوامر من الحجم ، مع مستويات منخفضة موجودة في اللمفاويات (<1 dyne / cm2)وأعلى المستويات موجودة لفترة وجيزة مع مرور الخلايا عبر القلب وحول صمامات القلب (>500 dynes / cm2). هناك عدد قليل من النماذج في المختبر مصممة لنموذج نطاقات مختلفة من الإجهاد القص الفسيولوجية على أطر زمنية مختلفة. تصف هذه الورقة نموذجا للتحقيق في عواقب نبضات قصيرة (مللي ثانية) من FSS عالية المستوى على بيولوجيا الخلايا السرطانية باستخدام حقنة بسيطة ونظام إبرة.
Introduction
الانبثاث ، أو انتشار السرطان خارج موقع الورم الأولي ، هو عامل رئيسي وراء وفيات السرطان1. خلال الانبثاث ، تستخدم الخلايا السرطانية نظام الدورة الدموية كطريق سريع لنشره في المواقع البعيدة في جميع أنحاء الجسم2،3. بينما في الطريق إلى هذه المواقع, الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) موجودة داخل البيئة الدقيقة السائل الديناميكي على عكس ذلك من الورم الأساسي الأصلي3,4,5. وقد اقترح أن هذه البيئة الدقيقة السائل هو واحد من العديد من الحواجز التي تحول دون الانبثاث4. هناك اتفاق واسع في مفهوم عدم الكفاءة النقيلي، أي أن معظم CTCs دخول الدورة الدموية إما يهلك أو لا تشكل مستعمرات النقيليالمنتجة 6،7،8. غير أن السبب في عدم كفاءة الانبثاث من منظور فرادى لجنة مكافحة الإرهاب أقل يقينا ولا يزال مجالا نشطا للتحقيق. يتم فصل CTCs من مصفوفة خارج الخلية ، وحرمانها من عوامل النمو القابلة للذوبان والبقاء على قيد الحياة التي قد تكون موجودة في الورم الأساسي ، وتتعرض للجهاز المناعي والقوى الدموية بطريقة مختلفة كثيرا عن الورم الأساسي4. وقد يسهم كل عامل من هذه العوامل في ضعف بقاء البلدان المحوسبة، ولكن مساهماتها النسبية غير واضحة. تتناول هذه الورقة مسألة كيفية تأثير القوى الديناميكية الدموية على مركبات الكربون الكلورية فلورية.
إن دراسة آثار القوى الديناميكية الدموية على مركبات الكربون الكلورية فلورية أمر صعب للغاية. حاليا، لا توجد أنظمة هندسية في المختبر التي يمكن أن تكرر كامل ديناميات الصدغية (القلب إلى الشعيرات الدموية) والخصائص الريولوجية للنظام الأوعية الدموية البشرية. وعلاوة على ذلك، فإن كيفية تجربة أجهزة مكافحة الإرهاب لنظام الدورة الدموية ليست واضحة تماما. تشير الأدلة التجريبية إلى أن معظم الخلايا السرطانية لا تدور باستمرار مثل خلايا الدم. بدلا من ذلك ، نظرا لحجمها الكبير نسبيا (10-20 ميكرومتر في القطر) ، تصبح معظم CTCs محاصرة في أسرة شعرية (قطرها 6-8 ميكرومتر) لأطوال زمنية متغيرة (ق إلى أيام) حيث قد تموت أو تتغلغل أو يتم إزاحتها إلى السرير الشعري التالي8و9و 10و11. ومع ذلك، هناك بعض الأدلة على أن حجم لجنة مكافحة الإرهاب قد يكون أكثر تغايرا في الجسم الحي، وأن أصغر CTCs يمكن الكشف عنها12. لذلك ، استنادا إلى المسافة وسرعة تدفق الدم ، قد تدور CTCs بحرية فقط لبضع ثوان بين فترات الفخ هذه ، على الرغم من أن الوصف الكمي لهذا السلوك يفتقر إلى13.
وعلاوة على ذلك، اعتمادا على المكان الذي تدخل فيه CTCs الدورة الدموية، فإنها قد تمر عبر أسرة شعرية متعددة في الرئة وغيرها من المواقع الطرفية وعبر القلب الأيمن والأيساري قبل الوصول إلى وجهتها النهائية. على طول الطريق، تتعرض CTCs لضغوط ديناميكية دموية مختلفة بما في ذلك إجهاد القص السائل (FSS)، والقوى الضاغطة أثناء فخها في الدوران الدقيق، وربما، قوى الجر في ظل ظروف قد تظهر فيها مثل الكريات البيض المتداول على طول جدران الأوعية الدموية14. وبالتالي، فإن القدرة على نمذجة الدورة الدموية وفهم سلوك لجنة مكافحة الإرهاب على غرار محدودة. وبسبب هذا عدم اليقين، ينبغي التحقق من صحة أي نتائج من أنظمة النموذج المختبري في كائن فقري تجريبي، وفي نهاية المطاف، في مرضى السرطان.
مع المحاذير المذكورة أعلاه، توضح هذه الورقة نموذجا بسيطا نسبيا لتطبيق FSS على الخلايا المعلقة للتحقيق في آثار FSS على CTCs الموصوفة لأول مرة في عام 201215. تنتج FSS عن احتكاك تدفق الدم ضد جدار السفينة ، والذي ينتج تدرج سرعة مكافئة في ظل ظروف تدفق صفح في الأوعية الأكبر. تواجه الخلايا مستويات أعلى من FSS بالقرب من جدران الأوعية ومستويات أقل بالقرب من مركز الأوعية الدموية. تؤثر لزوجة السوائل ومعدل التدفق وأبعاد القناة التي يحدث من خلالها التدفق على FSS ، كما هو موضح في معادلة Hagen-Poiseuille. وهذا ينطبق على تدفق الدم يتصرف سوائل النيوتونية، ولكن لا يحمل لميكروسيرانج. يتراوح FSS الفسيولوجية على عدة أوامر من الحجم مع أدنى المستويات في اللمفاويات (<1 dyn/cm2)وأعلى في المناطق المحيطة صمامات القلب واللويحات تصلب الشرايين (>500 dyn/cm2)5. متوسط جدار القص الإجهاد في الشرايين هو 10-70 دين / سم2 و 1-6 dyn/cm2 في الأوردة16،17.
في القلب، قد تتعرض الخلايا لتدفقات مضطربة حول منشورات صمام حيث عالية المستوى جدا، ولكن قصيرة الأجل جدا FSS قد تكون من ذوي الخبرة18،19. على الرغم من أن مجال المعالجة الحيوية قد درس منذ فترة طويلة آثار FSS على خلايا الثدييات في التعليق ، قد تكون هذه المعلومات ذات قيمة محدودة لفهم آثار FSS على CTCs لأنها تركز بشكل عام على مستويات أقل بكثير من FSS المطبقة على مدى فترة طويلة20. كما هو موضح أدناه، وذلك باستخدام حقنة وإبرة، يمكن للمرء تطبيق عالية نسبيا (عشرات إلى آلاف dyn/cm2) FSS لمدة قصيرة نسبيا (مللي ثانية) إلى تعليق الخلية. منذ الوصف الأولي لهذا النموذج15, وقد استخدمت آخرين لدراسة آثار FSS على الخلايا السرطانية21,22,23. يمكن تطبيق “نبضات” متعددة من FSS على تعليق الخلايا في فترة قصيرة من الزمن لتسهيل التحليلات التجريبية في المصب. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذا النموذج لقياس قدرة الخلايا على مقاومة التدمير الميكانيكي من قبل FSS عن طريق قياس صلاحية الخلية كدالة لعدد البقول المطبقة. بدلا من ذلك، يمكن استكشاف آثار التعرض ل FSS على بيولوجيا الخلايا السرطانية عن طريق جمع الخلايا لمجموعة متنوعة من التحليلات المصب. الأهم من ذلك، يتم حجز جزء من تعليق الخلية كتحكم ثابت لمقارنة آثار FSS من تلك التي قد تكون مرتبطة بانفصال الخلية والوقت الذي يحتفظ به في التعليق.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه الورقة تطبيق FSS على الخلايا السرطانية المعلقة باستخدام حقنة وإبرة. باستخدام هذا النموذج، وقد ثبت أن الخلايا السرطانية لتكون أكثر مقاومة لنبضات وجيزة من FSS عالية المستوى بالنسبة للخلايا الظهارية غير المحولة15،22،24. وعلاوة على ذلك،…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم تطوير النموذج الذي تم إظهاره هنا من خلال منحة وزارة التنمية W81XWH-12-1-0163 ، وتمنح المعاهد القومية للصحة R21 CA179981 و R21 CA196202 ، وصندوق أبحاث Sato Metastasis.
Materials
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| 14 mL round bottom tubes | Falcon – Corning | 352059 | |
| 30 G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 96-well black bottom plate | Costar – Corning | 3915 | |
| Bioluminescence detector | AMI | AMI HTX | |
| BSA, Fraction V | Sigma | 10735086001 | |
| Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
| crystal violet | Sigma | C0775 | |
| D-luciferin | GoldBio | D-LUCK | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HT | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S2002 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3005 |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Strilic, B., Offermanns, S. Intravascular survival and extravasation of tumor cells. Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).
- Labelle, M., Hynes, R. O. The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination. Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Weiss, L. Metastatic inefficiency. Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).
- Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor. Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).
- Fidler, I. J. Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2′-deoxyuridine. Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Takagi, H., et al. Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types. International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).
- Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. Unifying metastasis–integrating intravasation, circulation and end-organ colonization. Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells. PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Brass, L. F., Diamond, S. L. Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).
- Stein, P. D., Sabbah, H. N. Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves. Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).
- Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis. The American Journal of Physiology. 265 (5), 1787-1796 (1993).
- Chalmers, J. J. Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about. Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).
- Vennin, C., et al. Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis. Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).
- Mitchell, M. J., et al. Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).
- Ortiz-Otero, N., et al. Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines. British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399 (1992).
- Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study. Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).
- Gensbittel, V., et al. Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis. Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).
- O’Leary, B. R., et al. Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism. Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).
- Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. Hemolysis near a transversely oscillating wire. Science. 169 (3948), 871-873 (1970).
- Rooney, J. A. Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble. Science. 169 (3948), 869-871 (1970).
- Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions. Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).
- Brooks, D. E. The biorheology of tumor cells. Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).
- Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition. Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).
- Fan, R., et al. Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells. Scientific Reports. 6, 27073 (2016).
- Fu, A., et al. High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin. Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).
- Li, S., et al. Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).
- Xin, Y., et al. Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow. Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).
