Summary
Vi demonstrerar en metod för att isolera svårodlande medlemmar av den nya bakteriella fylumen, Saccharibacteria, genom att filtrera tandplack och samkultur med värdbakterier.
Abstract
Många bakteriearter kan inte odlas i laboratoriet med hjälp av standardmetoder, vilket utgör ett betydande hinder för att studera majoriteten av mikrobiell mångfald på jorden. Nya metoder krävs för att odla dessa okulverterade bakterier så att utredarna effektivt kan studera sin fysiologi och livsstil med hjälp av de kraftfulla verktyg som finns tillgängliga i laboratoriet. Kandidaten Phyla Radiation (HLR) är en av de största grupperna av obrukade bakterier, som omfattar ~15% av den levande mångfalden på jorden. Det första isolatet av denna grupp var en medlem av Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' stam TM7x. TM7x är en ovanligt liten bakterie som lever som symbiont i direkt kontakt med en bakteriell värd, Schaalia odontolytica, stam XH001. Genom att dra nytta av den ovanligt lilla cellstorleken och dess livsstil som en symbiotisk organism utvecklade vi ett protokoll för att snabbt odla Saccharibacteria från tandplack. Detta protokoll kommer att visa hur man filtrerar en suspension av tandplack genom ett 0,2 μm filter, koncentrera sedan de insamlade Saccharibacteria-cellerna och infektera en kultur av värdorganismer. Den resulterande kokulturen kan passeras som alla normala bakteriekultur och infektion bekräftas av PCR. Den resulterande binära kulturen kan upprätthållas i laboratoriet och användas för framtida experiment. Medan förorening är en möjlighet, kan den binära kulturen renas genom antingen ytterligare filtrering och återinfektion av värd, eller genom plätering av binär kultur och screening för infekterade kolonier. Vi hoppas att detta protokoll kan utvidgas till andra provtyper och miljöer, vilket leder till odling av många fler arter i HLR.
Introduction
Genom att odla nya bakteriearter och föra in dem i laboratoriet kan kraftfulla experiment bättre förstå deras fysiologi och bredare interaktioner inom deras mikrobiella samhälle. Även om det finns kulturfria metoder för att förhöra dessa frågor (t.ex. "meta-omics"), gör de komplexa interaktionerna hos olika mikrobiella populationer det svårt att reta isär enskilda variabler och nå meningsfulla slutsatser. Medan odling av bakterier har många fördelar, finns det många potentiella hinder för att isolera en bakterie och odla den i ren kultur. Potentiella specifika tillväxtbehov inkluderar pH, syrespänning, vitaminer, tillväxtfaktorer, signalmolekyler eller till och med direkt cellkontakt för att framkalla tillväxt1. Man tror dock att specifika auxotroféer är det främsta avskräckande för odling av nya arter av bakterier. Standarda medieformuleringar saknar många näringsämnen som krävs av obrukade bakterier, såsom specifika vitaminer eller kolkällor. Dessa saknade molekyler kan vara nyckeln till de okulverterade bakteriernas fysiologi och tillhandahålls vanligtvis av antingen en annan organism i det mikrobiella samhället eller en värdorganism. Till exempel kan komplexa kolhydrater som muciner tillhandahållas av djurvärdar. Att lägga till dessa till media har gjort det möjligt att odla flera bakterier från djurinälvor, inklusive Akkermansia muciniphila och Mucinivorans hirudinis2,3,4. Många patogena bakterier har utvecklat förmågan att använda järn som är bundet till hemin i djurceller, inklusive den orala patogenen Porphyromonas gingivalis5. I laboratoriet kan tillväxten av Porphyromonas och andra organismer stimuleras genom tillsats av hemin6.
På senare tid har många genombrott i odling av nya isolat av bakterier kommit genom samodling, med hjälp av en "feeder" organism för att ge specifika faktorer till okulturerade bakterier som är nödvändiga för deras tillväxt. En elegant studie av Vartoukian och kollegor visade att siderophores, järnbindande molekyler producerade av bakterier, stimulerade tillväxten av flera nya orala isolat. Pyoverdines, en typ av siderophore produceras av pseudomonadarter, visade sig avsevärt underlätta tillväxten av en ny Prevotella art7. I samma studie odlades det första orala isolatet för fylumkloroflexi, även med F. nucleatum som hjälpare för att tillhandahålla några ännu okända förening7. Mer nyligen isolerades en bakterie från släktet Ruminococcaceae med Bacteroides fragilis som hjälparorganism8. det visades senare att gamma aminosmörsyra (GABA), en hämmande signalsubstans, krävdes för tillväxt på laboratoriemedier. Att använda matarorganismer har visat sig vara en viktig strategi för att efterlikna specifika mikromiljöer där obrukade bakterier växer, och är effektivare än att kontinuerligt omformulera tillväxtmedier med olika tillsatser i olika koncentrationer.
En av de största grupperna av okulturerade bakterier finns i "Candidate Phyla Radiation" (HLR), en monofyletisk grupp av flera kandidatbakterier phyla9,10. Från och med detta skrivande har endast medlemmar av Saccharibacteria fylum inom HLR framgångsrikt odlats i laboratoriet. Det första isolatet," Nanosynbacter lyticus stam TM7x, isolerades med hjälp av antibiotikumet streptomycin, som hade förutspåtts berika för den obrukade TM711,12. En viktig upptäckt av detta arbete var att det nya isolatet växte som en parasit som växer i direkt kontakt med en bakteriell värd, Schaalia odontolytica, och mikroskopi visade att dessa parasiter var ultrasmå bakterier.
Med hjälp av dessa ledtrådar utformade vi en metod för att snabbt etablera binära kokulturer av Saccharibacteria med sina partners genom att filtrera tandplack och andra orala prover genom ett 0,2 μm-filter, samla celler i filtratet genom centrifugation och använda dem för att infektera kulturer av kandidatvärdbakterier. Denna metod har fördelen att undvika anrikningskulturer, som kan överväldigas av snabbväxande organismer. Det undviker också användningen av antibiotika, vilket kan stoppa tillväxten av antingen den riktade Saccharibacteria-arten eller deras värdar. Med hjälp av metoden som demonstreras här har vi framgångsrikt odlat 32 isolat från Saccharibacteria fylum.
Protocol
Vid utarbetandet av detta protokoll söktes och godkändes IRB-godkännande (#14-10) och informerat samtycke erhölls från alla ämnen.
1. Förberedelse
- När du arbetar med människor, få nödvändigt IRB-godkännande och informerat samtycke.
- Starta kulturer av värdbakterier med tillräckligt med tid för att växa till tidig stationär fas. Till exempel inokulera 2-5 ml tryptika sojabuljong med 0,1% jästextrakt tillsatt (TSBY) med Arachnia propionica och inkubera vid 37 °C i 24 timmar.
- Montera filterhållare med spåretsat filtermembran på 0,2 μm. Linda in enheten i folie och sterilisera genom autoklavering.
- Sterilisera centrifugrör och lockenheter.
2. Ta prover av orala bakterier
OBS: Medan många orala prover innehåller Saccharibacteria (t.ex. saliv, svabbprover av tonsiller, tungaskrapningar) är tandplack rutinmässigt den mest framgångsrika.
- Ta en plackskrapning med en steril papperspunkt, Gracey curette, eller, om du självprovar, använd en steril tandpetare eller pipettspets. Överför plack till en lämplig buffert, såsom maximal återhämtningsspädning (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% pepton) eller PBS. Om provet inte bearbetas omedelbart, håll provet på is tills det är klart att fortsätta.
- Återanvänd tandplack kraftigt i MRD-buffert med en kombination av virvel och pipetting med en liten rörspets.
- Tillsätt återanvändda plackprover till ytterligare 9 ml MRD-buffert.
3. Förbered filtrate från oralt prov
- Använd aseptisk teknik och packa upp en steril filterenhet. Lossa en kvarts varv och sätt tillbaka filterhållaren för att vara säker på att gängorna är ordentligt inkopplade och att apparaten är ordentligt stängd. Tvätta membranet med en spruta genom att skicka 10 ml MRD-buffert genom apparaten. Felaktig montering avslöjas i detta steg genom att vätska läcker ut ur filterhållaren. Om läckage uppstår, skaffa en annan steril filterenhet och upprepa tvättsteget.
- Applicera provet på det tvättade filtret. Ta bort kolven från en spruta och fäst den på filterapparaten. Häll det spridda tandprovet, nu i 10 ml MRD-buffert, i en spruta och ladda det på filtret.
- Placera ett sterilt centrifugeringsrör under filterapparaten för att fånga filtratet och tryck sedan på kolven för att trycka provet genom filtret.
- Upprepa proceduren med ytterligare 10 ml MRD-buffert för att tvätta membranet och samla in genomflödet i samma rör som det filtrerade provet. Kapa röret aseptiskt.
4. Koncentrera Saccharibacteria celler genom centrifugation
- Gör ett orienteringsmärke på röret och locket och placera röret i en höghastighetscentrifug med märket på ovansidan. Pelleten som bildas av centrifugation är vanligtvis osynlig. Märkningen hjälper till att avgöra var pelleten av Saccharibacteria-celler är placerad när centrifugering är klar och röret avlägsnas från centrifugen.
- Centrifugera proverna vid 60 000 x g i 1 timme vid 4 °C.
OBS: Denna kraft och tid är tillräcklig för att pelleta alla Saccharibacteria celler. Saccharibacteria celler kan dock åtminstone delvis pelleteras genom centrifugering i så lite som 20 min vid 20,000 x g. - Ta försiktigt bort rören från centrifug. Häll ut vätskan från röret och håll pelleten på rörets övre sida.
- Återanvänd den vanligtvis osynliga pelleten i 1-2 ml MRD-buffert genom kraftig virvel.
5. Infektera värdkulturer med Saccharibacteria-berikat filtrat
- Förbered odlingsrör genom att alikvotera 2 ml lämpligt tillväxtmedier (t.ex. TSBY, BHI osv.) i rör.
- Tillsätt 200 μL över natten kultur av värdorganismer till varje rör. Tillsätt 100-200 μL återanvänd, filtrerat prov till varje rör.
- Inkubera kombinerade prover som är lämpliga för värdorganismen (t.ex. 37 °C, i en aerob atmosfär för A. propionica).
- Passage cellerna varannan till var tredje dag genom att överföra 200 μL binär kultur till 2 ml färskt tillväxtmedium i ett nytt rör. Om det verkar som om de passagede kulturerna inte visar någon tillväxt (dvs. kulturens grumlighet / optiska densitet ökar inte efter passage i färska medier) kan Saccharibacteria vara överväldigande eller döda alla värdorganismer. För att åtgärda detta, tillsätt 200 μL oinfekterad värdkultur när du passar cellerna. Upprepa i minst 5 passager.
6. Bekräfta infektion med PCR
- Efter 5 passager, bekräfta infektion med PCR. Fem passager kommer att säkerställa att än någon icke-växande Saccharibacteria celler har utarmats utöver detektionsgränsen med hjälp av 25 cykler pcr.
- Förbered en PCR mastermix. Ett föreslaget recept som använder är följande, för varje rör som behövs, förbereda 12,5 μL 2x PCR-buffert, 0,75 μL 10 μM Framåtprimer (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 0 Reverse primer (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 och 9 μL vatten. Blanda genom att virvla.
- Aliquot 24 μL mastermix i ett 0,2 ml PCR-rör. Tillsätt 1 μL saccharibacteria-infekterad kultur till PCR-reaktionen. Placera röret i en termocyklist och utför följande protokoll: Initial denaturation 95 °C i 5 min, 25 cykler på 95 °C för 30 s, 60 °C för 30 s, 72 °C för 30 s, slutlig förlängning vid 72 °C i 2 min och sedan slutligt håll vid 4 °C.
- Ladda och kör PCR-produkterna i en 1% agarose gel. Ett band med ~600 baser indikerar närvaron av Saccharibacteria.
7. Kontrollera renheten och avlägsna förorenande organismer
- Bekräfta renheten hos positiva kulturer genom att plätera kokulturen av Saccharibacteria på näringsagar som är tillräcklig för värdorganismens tillväxt. Utför en 10-faldig seriell utspädning av kulturen i steril buffert (t.ex. MRD eller PBS) och sprid 100 μL på en agarplatta. Utför utspädningar så att det kommer att finnas cirka 20-200 kolonier som växer på agarplattan.
- Inkubera kulturen under lämpliga tillväxtförhållanden och observera för förorenande organismer.
OBS: Axenic Saccharibacteria kolonier har aldrig observerats, så endast värdorganismen observeras växa på dessa plattor. Mer än en kolonityp indikerar vanligtvis förorening. Om kontaminering skulle inträffa bör kulturen filtreras om för att avlägsna de oönskade föroreningarna och återinokeras till färsk värd. - Ibland uppstår en dubbel infektion, där två Saccharibacteria-arter infekterar samma värd. För att separera saccharibacteria-arten, återanvänd enskilda kolonier i 20 μL steril PBS och använd 1 μL suspension i en PCR-reaktion för att upptäcka kolonier med Saccharibacteria-infektioner.
- Överför suspensionerna som gav ett positivt resultat till tillväxtmedium för att starta en binär kultur. Framgångsgraden beror på titern för varje Saccharibacteria-art i kulturen. Det kan vara nödvändigt att screena mer än 50 kolonier för att hitta en infekterad för spridning.
8. Lagring av kulturer
- Odla en binär kultur med tillräcklig volym (10-50 ml) över natten.
- Pelletsceller genom centrifugering (4 000 x g i 10 min).
OBS: Höghastighetscentrifugation är inte nödvändig här eftersom Saccharibacteria-celler kommer att fästas på de större, tyngre cellerna i värden och kommer att pelletsa med dem. - Återanvänd celler i kryoprotectant. Tillväxtmedier kompletterade med antingen 5% DMSO eller 20% glycerol är vanligtvis tillräckligt. Se till att värdorganismen är kompatibel med kryoprotektiva medier (t.ex. tillväxt av A. propionica hämmas av glycerol och frysta lager kanske inte återupplivas). Testa livskraften hos en oinfekterad värdkultur med kryoprotekter för att säkerställa att bestånden kan överleva frysning.
- Återanvänd cellpellet i samma kulturvolym (10-50 ml). Alikvot 0,5 ml i märkta kryovialer. Frys cellkulturer vid -80 °C.
Representative Results
PCR för påvisande av Saccharibacteria kan verka negativt (dvs. ingen produkt sett) i inledande infektion kulturer på grund av ett lågt antal Saccharibacteria symbionter. Men efter några passager bör en stark PCR-produkt visas som visar att en stabil infektion har inträffat (figur 1A). Omvänt kommer vissa infektioner initialt att verka positiva av PCR, men minska till oidentifierbara efter 1-4 passager (visas inte). Detta indikerar att en stor mängd Saccharibacteria celler var närvarande i den ursprungliga filtrate men späddes ut genom passage och ingen kunde gå in i en stabil symbios med värdkulturen. Testning av flera värdarter med samma Saccharibacteria-filtrat från munhålan kommer vanligtvis att ha en låg framgångsgrad (figur 1B) eftersom symbiont-värdinteraktionen är mycket specifik. En forskare kan också testa samma värd med filtrates från flera olika ämnen. Om en bra värdorganism (som Arachnia propionica eller Schaalia odontolytica) används, kan en framgångsgrad på 50% förväntas.
Testning av PCR är avgörande. Erfarna forskare har försökt bekräfta infektion genom mikroskopi, bara för att rapportera falska positiva. Saccharibacteria cellerna är små och svåra att skilja mellan blåsor eller oregelbundna cell kuvert utbuktningar. En PCR-signal stabil genom flera passager är nyckeln till att bekräfta en framgångsrik infektion.
När de infekterade kulturerna växer bör normal grumlig tillväxt förekomma. När symbiosen etablerar sig kommer infekterade kulturer att verka mindre grumliga än kulturer av oinfekterade värdorganismer (Figur 2A). I vissa fall kan infekterade kulturer verka sluta växa helt och inte bli grumliga alls. Detta kan bero på en infektion där Saccharibacteria cellerna överväldigar värdorganismen. Att lägga till "färsk" (oinfekterad) värd till dessa kulturer bör ge en tillräcklig värdpopulation för att stödja den fortsatta tillväxten av Saccharibacteria parasiter.
Överväxt, eller alltför grumliga kulturer, kan tyda på kontaminering av antingen ett laboratorieföroreningsmedel eller en annan liten oral bakterie som kunde passera genom filtret på 0,2 μm. Campylobacter och Capnocytophaga spp. är typiska orala föroreningar av dessa experiment. Detta kan bekräftas genom att plätera kulturen och leta efter kolonier som är atypiska av värdorganismen följt av 16S rRNA-sekvensering. Om kontaminering ses är filtrering av dessa kulturer genom ett filter på 0,2 μm vanligtvis tillräckligt för att avlägsna föroreningarna. Saccharibacteria celler i filtratet kan koncentreras genom centrifugation och användas för att åter infektera en ren värdkultur.
Ett annat sätt att rena en förorenad kultur är genom att plocka infekterade kolonier från att plätera en infekterad kultur. Kolonier av infekterade värdar kan ibland identifieras med oregelbunden koloniform jämfört med oinfekterade kolonier (Figur 2B-D). Dessa oregelbundna kolonier är beroende av titern av Saccharibacteria i den binära kulturen och en mindre andel kolonier kommer att visas oregelbundna om titern är låg. Detta kan göra det enkelt att identifiera infekterade kolonier, som kan plockas och användas för att starta en ren binär kultur. Om inga oregelbundna kolonier ses på plätering från en Saccharibacteria infekterad kultur, är det möjligt att symbionten är vid en låg titer eller inte orsakar oregelbundet formade kolonier. I ett sådant fall kan PCR-screeningkolonier med normalt utseende visa infektion av Saccharibacteria, men i låg takt (2-10% av alla kolonier).
Figur 1: Typiska PCR-resultat av Saccharibacteriainfektioner hos värdkulturer. (A) En PCR-produkt som indikerar förekomst av Saccharibacteria kan inte förekomma med den första infektionen men kan förekomma och bli starkare i efterföljande passager när kokulturen etablerar sig. (B) De flesta värdar som smittats med Saccharibacteria-berikat filtrat kommer inte att stödja deras tillväxt på grund av symbiosens specificitet. I det här exemplet var endast A. propionica framgångsrikt smittade. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Tillväxtegenskaper hos saccharibacteriainfekterade kulturer. (A) Tillväxtkurvor av infekterade och oinfekterade kulturer i A. propionica som visar infekterad kultur kommer inte att växa till samma densitet som den oinfekterade kontrollen och verka mindre grumlig. (B-D) Plätering av kokulturer kan producera oregelbundna kolonier, orsakade av Saccharibateria-infektioner. Oregelbundna kolonier kommer att minska i proportion till titern av Saccharibacteria i kokulturen. B)Värd med hög saccharibacteria. C)10-faldig utspädd Sackaribacteria(D)Oinfekterad värdkultur. Vita pilar visar exempel på oregelbundna kolonier. Skalbar= 1 cm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Vår metod att filtrera plack och applicera den på rena kulturer av värdorganismer är till stor del baserad på tidigare observationer på den första odlade Saccharibacteria, "Nanosynbacter lyticus stam TM7x11,14,15. Med tanke på den lilla cellstorleken drog vi slutsatsen att de kunde separeras från tandplack med hjälp av ett filter och koncentreras med centrifugation. För det andra, eftersom dessa organismer lever som parasiter, skulle förutsatt att dessa celler rena kulturer av värdar skulle göra det möjligt för dem att gå in i en symbios och växa som binära kulturer.
En fördel med denna metod är att den inte kräver en anrikningskultur eller selektivt tryck. Nanosynbacter lyticus stam TM7x odlades från en anrikningskultur med streptomycin som selektivt medel, vilket sekvensering hade föreslagit skulle vara effektivt för berikning för Saccharibacteria. Slumpartat är värden för 'Nanosynbacter lyticus ' Schaalia odontolytica, känd för att vara resistent mot streptomycin16. Att använda antibiotika som selektivt medel skulle också kunna hindra värdorganismen från att växa, vilket i sin tur skulle förhindra tillväxten av Saccharibacteria.
En större fråga om att använda anrikningskulturer är att snabbväxande organismer snabbt kommer att tränga undan organismer av intresse. I munhålan kan till exempel Streptococcus-arter växa snabbt och, om socker finns i tillväxtmediet, producera tillräckligt med syra för att försura mediet, ytterligare välja mot organismer av intresse. Genom att undvika en anrikningskultur och selektiv antibiotika ger vår metod en allmän strategi som kan tillämpas på ett bredare spektrum av Saccharibacteria och potentiella värdar utan komplikationer av dessa andra metoder.
Det finns vissa hinder för den metod som presenteras här. För det första förutsätter denna metod att Saccharibacteria lever i en binär kultur. Vi har inte testat kombinationer av trinary eller ternary kulturer för att mäta deras effektivitet, men det finns sannolikt Saccharibacteria som kräver tillväxtfaktorer som en enda värdorganism inte kan leverera. Att testa de stora kombinationerna av orala bakterier som kan stödja tillväxten av Saccharibacteria skulle vara en skrämmande uppgift. För det andra antar metoden att alla Saccharibacteria är tillräckligt små för att passera genom ett 0,2 μm-filter. Det kan vara så att andra Saccharibacteria är större än man trott och filtret väljer mot dessa organismer. Ett filter med större porstorlek skulle kunna användas, men detta riskerar att släppa in mer oönskade orala bakterier i den infekterade samkulturen. Slutligen är det mycket svårt att hitta värdarter utanför de som redan har publicerats. Hittills är de enda framgångsrika värdarna arter från släktena Actinomyces, Schaalia, Arachnia och Cellulosimicrobium, alla medlemmar av fylum actinobacteria15,17,18. Dessa värdar stöder dock bara tillväxten av specifika Saccharibacteria. För att odla fler arter av Saccharibacteria måste många fler värdar utforskas.
Vi hoppas att den metod som presenteras här kommer att bidra till framtida forskning av Saccharibacteria och andra HLR-organismer. Metagenomisk sekvensering tyder på att dessa organismer också har små genom och misstänks vara symbionter eller förlita sig på det lokala mikrobiella samhället för att leverera metaboliter och andra faktorer som är kritiska för deras överlevnad19. En liknande filtreringsstrategi skulle kunna användas för att isolera dessa organismer, förutsatt att de är tillräckligt små och att deras värdorganismer kan odlas. De metoder som beskrivs här är ett första steg för att föra laboratoriekulturens kraftfulla verktyg till denna stora och mångsidiga grupp bakterier.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He och Batbileg Bor för hjälpsamma diskussioner och för att de tillhandahåller bakteriestammar. Vi tackar Susan Yost och Jessica Woods för mikrobiell teknisk hjälp. Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av National Institute of Dental and Craniofacial Research vid National Institutes of Health under tilldelningsnummer R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) och T32 DE007327 (AJC). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
| Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
| Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
| Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
| MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
| Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
| O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
| Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
| P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
| P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
| P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
| P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
| P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
| PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
| PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Pipette tips - 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
| Pipette tips - 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
| Pipette tips - 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
| Pipette tips - 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
| Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
| Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Swin-Lok Filter - 47mm | Whatman | 4200400 | |
| SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Syringes - 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
| Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
| Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
| Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
| Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |
References
- Stewart, E. J.
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), 00012 (2011).
- Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, Pt 5 1469-1476 (2004).
- Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, Pt 3 990-995 (2015).
- Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis. PLoS One. 8 (9), 0073351 (2013).
- Martin, B., et al. New growth media for oral bacteria. Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).
- Vartoukian, S. R., et al. In vitro cultivation of 'unculturable' oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores. Plos One. 11 (1), 0146926 (2016).
- Strandwitz, P., et al. GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota. Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).
- Hug, L. A., et al. A new view of the tree of life. Nature Microbiology. 1, 16048 (2016).
- Castelle, C. J., Banfield, J. F. Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life. Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).
- He, X., et al. Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).
- Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives. Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).
- Brinig, M., Lepp, P. Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease. Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).
- Bor, B., et al. Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts. Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).
- Bor, B., et al. Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces. Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).
- Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. Dental plaque development on defined streptococcal surfaces. Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).
- Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts. Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666 (2020).
- Cross, K. L., et al. Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics. Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).
- Kantor, R., et al. Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla. MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).
