Summary
这里提出的协议使微型模式能够自动制造，使细胞形状标准化，以研究哺乳动物细胞中的细胞骨结构。这种用户友好型技术可以与市售成像系统建立，不需要标准细胞生物学实验室无法使用的专用设备。
Abstract
微模式是细胞生物学界的一项既定技术，用于研究细胞隔间的形态和功能之间的联系，同时规避自然细胞与细胞变异引起的并发症。为了标准化细胞形状，细胞要么被限制在3D模具中，要么通过粘合岛控制粘合几何形状。然而，基于光刻和深紫外线蚀刻的传统微模式技术在很大程度上依赖于洁净室或专用设备。在这里，我们展示了一种红外激光辅助微模式技术（微光托邦），该技术由道尔等人修改，可通过市售成像系统方便设置。在此协议中，我们使用尼康 A1R MP+ 成像系统，通过红外 （IR） 激光器生成微缩精度的微模式，从而消融聚乙烯醇涂层盖片上的预设区域。我们采用自定义脚本，在未配备硬件自动对焦的系统中实现高效、准确的自动模式制造。我们表明，这种红外激光辅助微模式（微光托位）协议导致定义的模式，细胞只附加和采取所需的形状。此外，由于细胞形状的标准化，大量细胞的数据可以平均化。与此协议生成的模式，结合高分辨率成像和定量分析，可用于相对较高的吞吐量屏幕，以识别干扰形式和函数之间联系的分子玩家。
Introduction
细胞形状是组织形态形成1、细胞迁移2、细胞增殖3和基因表达4等基本生物过程的关键决定因素。细胞形状的变化是由细胞细胞的动态重新排列之间的复杂平衡驱动的，细胞体的动态重新排列使等离子膜变形，外在因素，如施加在细胞上的外力，以及细胞细胞和细胞基质粘附5的几何形状。例如，迁移间质细胞，在前沿聚合一个密集的活性蛋白网络，推动等离子膜向前推进，并创建一个宽的跛脚皮6，而活体肌素收缩性收回细胞的狭窄尾随边缘，以分离细胞从其当前位置7，8。破坏信号事件，导致这种特殊的细胞骨结构扰动形状和极性，并减缓细胞迁移9。此外，上皮板弯曲在胃结石需要基于肌素的阿皮收缩，导致细胞及其邻居成为楔形10。虽然这些研究强调了细胞形状的重要性，但细胞形状固有的异质性阻碍了确定将形态与功能联系起来的机制的努力。
为此，在过去三十年中，已经开发出许多操纵细胞形状的方法。这些方法通过用三维模具约束细胞或通过细胞外基质 （ECM） 蛋白质的图案沉积控制细胞几何学来达到他们的目标，这种技术称为微模式11。在这里，我们将回顾一些技术，已经获得了多年来的流行。
最初作为微电子应用的方法而开创，软光刻为基础的微接触印刷已明确成为崇拜者的最爱12。主晶圆首先通过选择性地将光层涂层硅基板的区域暴露在光照射下制造，留下图案表面13。然后，将弹性体（如 PDMS）倒入主晶圆上，生成一个软"标记"，将 ECM 蛋白质转移到所需的基板11、14上。一旦制造，主晶圆可用于铸造许多 PDMS 邮票，产生高可重复性的微模式12。然而，由于光刻过程冗长，这些模式无法轻易调整。这个过程还需要高度专业化的设备和清洁室，这些设备和洁净室通常不在生物学部门。
最近，据报道，使用深紫外线进行直接印刷是为了规避传统光刻方法带来的限制。深紫外线通过光罩定向到涂有聚L-lysine-嫁接-聚乙二醇的玻璃盖唇的选择性区域。暴露在深紫外线下的化学组在不使用感光连杆的情况下进行光转换，使 ECM 蛋白15具有结合性。缺乏感光链接器使图案盖片在室温下保持稳定超过7个月15。这种方法避免使用洁净室和光刻设备，需要较少的专业培训。然而，对光罩的要求仍然给需要随时可用的模式变化的实验带来了巨大的障碍。
除了通过在二维表面上控制 ECM 蛋白质沉积来操纵细胞几何的方法外，其他方法还试图通过将细胞限制在 3D 微结构中来控制细胞形状。许多研究已经调整了软石版印刷为基础的方法，以产生3D，而不是2D，PDMS室，以调查在胚胎，细菌，酵母和植物16，17，18，19的形状依赖生物过程。双光子聚合（2PP）还率先采用微晶硅技术，可制造出分辨率为20纳米的复杂3D水凝胶脚手架。2PP依赖于双光子吸附原理，即在股骨脉冲中交付的两个光子同时被分子（在此情况下的光启动器）吸收，从而实现光聚合物21的局部聚合。这项技术已被大量用于打印3D脚手架，模仿人体组织的原生ECM结构，并已被证明诱导低光化学损伤细胞22。
10年前，微型磷酸盐的首次亮相让研究人员有机会制造微型模式，同时避免无法访问和专用的设备。微光托管通过使用红外激光23、24在活性玻璃表面涂上多乙烯醇（PVA）的选择性区域，在微米尺度上创建模式。ECM 蛋白仅附着在底层玻璃表面，而不是 PVA，然后作为生化线索，使控制扩散动力学和细胞形状。这种方法还具有优越的灵活性，因为模式可以随时实时更改。在这里，我们使用商用多光子成像系统提供微光托邦的分步协议。所述协议专为快速和自动地制造大型图案而设计。我们证明，这些模式通过限制细胞-ECM粘附的几何形状，有效地控制了细胞形状。最后，我们证明，描述的模式技术调节细胞的组织和动态。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 盖滑预处理
- 准备吱吱作响的干净盖片，如沃特曼-斯托勒，1998年25年描述。
- 准备 1% （3-氨基丙基） 三氧硅烷 （APTMS） 溶液，并在溶液中孵育盖片 10 分钟，轻轻搅拌。确保盖片在解决方案中自由移动。
- 用dH2O清洗两次盖片，每次5分钟。
- 准备 0.5% 谷氨酸 （GA） 溶液，并在摇床上将溶液中的盖片孵育 30 分钟。对于 25 个盖片，使用 50 mL 的谷氨酸醛溶液。确保盖片在解决方案中自由移动。
- 用 dH2O 清洗三次，每次 10 分钟。
- 使用定制的盖片微调器旋转 30s 的干盖片。封面滑动微调器的详细描述已于26 日发布 ，可在线（https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/）。激活的盖片可在带分隔线的盒子中以 +4 °C 的速度存储长达一个月，以便它们彼此分开。
2. PVA 涂层
- 将PVA（98%水解PVA，MW 98000）与dH2O混合，以制作5.6%的解决方案。
- 在 90 °C 的水浴中溶解混合物，并在加热时立即通过生物安全柜中的 0.2 μm 过滤器进行过滤。如果股票溶液沉淀，则再次过滤。PVA 溶液可在室温下存储 3 个月。
- 在 15 mL 管中，将一部分 HCl 添加到八个部分 PVA 中。小心地倒置管子几次混合。
- 将混合溶液的 2 mL 倒入 35 mm Petri 盘中，将干净、预处理的盖片浸入液体中，注意盖片不会粘在底部。在室温下在摇床上孵化5分钟。
- 小心地从溶液中删除盖片。使用盖片微调器旋转外套40s。同时，清洁钳子。将盖片转移到一个盒子上，并在 +4 °C 的夜间干燥。PVA 涂层盖片可存储在 +4 °C，最长达两周。
3. 配置多光子显微镜
注意：所述协议经过调整，可在直立或倒置的多光子成像系统上创建形状和大小所需的细胞粘合微模式，尤其是未配备硬件自动对焦的微观模式。因此，对于每个视场 （FOV），图案脚本消融了一个小区域，在盖片上创建一个受托标记，使用软件自动对焦将显微镜聚焦在盖片表面，并消融所需的图案。在相邻 FOV 的循环中运行此脚本可有力地创建大量微模式（5 x 5 mm 或更大），从而约束细胞形状并调节细胞内生物过程的活性。上述协议是为尼康 A1R MP+ 成像系统开发的，该系统由 NIS 元素软件控制。如果使用其他供应商的成像系统进行成型，则应根据制造商的说明调整光学配置和图案脚本。
- 打开显微镜软件。确保"Apo LWD 25X/1.10W DIC N2"目标安装在显微镜上。
注：此处描述的协议针对 25x/1.1 NA 浸入式目标进行了优化，但其他目标也可用于模式化。读者应该意识到，用高放大目标（例如，40倍和60倍）拍打需要更长的时间，因为它显著减少了每个FOV中消融的模式数量。低放大目标可用于图案，只要它们在整个 FOV 和激光功率上提供均匀的照明，足以消融 PVA 层。 - 在 A1+MP GUI窗口中，将激光线设置为 750 nm。
- 设置"图像"光学配置
注：NIS-Elements 为用户提供了多种工具（图形界面、获取工作流程构建器 JOBS、光学配置和宏）来控制显微镜硬件。在此协议中，大多数硬件控制都是通过各种光学配置以及 ND 获取和 ND 刺激模块实现的。- 在 校准 选项卡中，单击 "新光学配置"。将光学配置命名为"图像"。这是允许通过反射对盖滑进行成像的基线光学配置。将所有其他选项保留为默认选项，并选择适当的目标。
- 在 A1plus MP GUI 窗口中，单击 "设置" 按钮以配置此光学配置下的硬件设置。将 刺激激光 设置为 IR 刺激，将 光束分离器 （BS 20/80） 置于光路径中，将 扫描仪单元 设置为 加尔瓦诺 ，并选择合适的去扫描探测器。
- 在 A1+Compact GUI 窗口中，选择足以捕获盖单上小功能的扫描大小和停留时间（系统上分别为 1.1 毫秒和 1024 像素）。单击 "正常 "按钮，因此不执行线平均值或线集成。确保检查 使用 IR 激光 框。设置单向扫描以获得简单性。
注意：如果扫描速度值得关注，则可以使用双向扫描。 - 在同一窗口中，调整激光功率和探测器灵敏度，以获得覆盖滑面明亮但不饱和的图像。将激光功率设置为最大功率的 3 - 5%，将探测器灵敏度（"HV"滑块）设置为 15 V 是一个很好的起点。
- 在 A1+扫描区域 窗口中，将 变焦 设置为 1 以捕获整个 FOV。
- 保存光学配置。
- 设置"Print_Fudiciary_Marker"光学配置
- 复制"图像"光学配置并将其重命名为"Print_Fudiciary_Marker"。
- 在 A1+紧凑型 GUI 窗口中，选择最小的扫描大小和停留时间（系统上分别为 64 像素和 80.2 毫秒）。
- 由于此步骤不需要成像，将探测器灵敏度设置为 0，并将激光功率提高到 30%。更高的激光功率将热移除所需区域盖滑上的 PVA 层。
- 在 A1+扫描区域 窗口中，将 变焦 设置为最大值（系统为 15.87），并将扫描区域放置在 FOV 中间。
- 在 ND 采集 窗口中，设置 Z 栈实验。将 Z 位置的移动设置为 相对 ，并选择适当的 Z 设备。将步幅大小设置为 2 μm，将堆栈深度设置为上下 10 μm，以考虑显微镜阶段或相邻 FOV 之间的 PVA 表面的任何不均匀性。
- 设置"自动对焦"光学配置
- 复制"图像"光学配置并将其重命名为"自动对焦"。
- 在 A1+扫描区域 窗口中，降低 缩放 因子，使 FOV 略大于受托标记。这可确保盖上的其他小功能不会干扰自动对焦。
- 在 设备 菜单中，选择 "自动对焦设置"。将扫描厚度设置为 Z 堆栈实验中的 Z 堆栈厚度（参见步骤 3.5.5）。显微镜将扫描这个范围，并找到最好的焦点平面使用信托标记。将步幅保留为默认值。
- 设置"Load_ROI"光学配置
- 复制"图像"光学配置并将其重命名为"Load_ROI"。
- 在 A1+紧凑型 GUI 窗口中，设置扫描大小与投资回报率面膜相同的扫描大小。此光学配置将用于捕获加载 ROI 面膜的图像。我们使用 2048 像素实现了分辨率和速度之间的最佳平衡。
注：此捕获的图像大小必须与投资回报率面膜相同。
- 设置"微模式"光学配置
- 复制"Print_Fiduciary_Marker"光学配置并将其重命名为"微型模式"。
- 将 缩放 因子设置为一个。
- 在 A1plus MP GUI 窗口中，增加刺激激光功率以消融 PVA，并在实验中选择适当的扫描速度（分别为 40% 和 32 s/帧）。
- 在 ND刺激 窗口中，设置ND刺激实验。在 时间表 中添加几个阶段，并将每个阶段设置为 刺激。确保 刺激区域 和 持续时间 正确。
注：相数可根据PVA层的厚度和平滑度以及此光学配置中使用的激光功率进行调整。 - 在同一窗口中，在每个阶段之前启用StgMoveMainZ（-1.000，1）功能。这再次解释了 Z 方向的任何偏差。
注：可根据PVA层的厚度和平滑度调整目标移动的距离和方向。
- 设置"Label_Surface"光学配置
- 复制"Print_Fudiciary_Marker"光学配置并将其重命名为"Label_Surface"。
- 在 A1+紧凑型 GUI 窗口中，显著增加激光功率并将 缩放 设置为一个。此处使用的高激光功率会对玻璃盖滑点造成物理损坏，并产生肉眼可见的标签。这有助于在进一步实验中定位模式。
4. 生成投资回报率面膜并设置宏
- 生成投资回报率面膜
- 使用 Adobe Photoshop 或其他可用软件生成 2048 × 2048 RGB 图像。图像对应于显微镜下的 FOV（即 532.48 × 532.48 微米，每像素 0.26 微米）。图像应具有黑色 （0，0，0） 背景。
注：许多商业和免费图像编辑器可用于生成用于激光辅助微模式的投资回报率面罩。虽然我们使用Adobe照片店生成口罩，但GIMMP和图像J/斐济也可以作为替代免费选项。 - 在黑色背景上绘制 8 - 12 个白色（255，255，255）图案。模式大小因细胞类型而异（直径约 200 像素）。在图像中心留下 500 × 500 空白区域，用于自动对焦。在相邻模式（>200像素）和 FOV 的寄宿者之间留出足够的空间，以实现最佳的消融和单元格连接。本协议中提出的模式可在 Github（https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）上找到。
- 使用 Adobe Photoshop 或其他可用软件生成 2048 × 2048 RGB 图像。图像对应于显微镜下的 FOV（即 532.48 × 532.48 微米，每像素 0.26 微米）。图像应具有黑色 （0，0，0） 背景。
- 设置宏
- 单击 宏 菜单并选择 "新宏"。
- 将 Github（https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）上的"Pattern_Stimulation"代码导入新宏 窗口。将此代码保存到适当的文件夹。
- 打开另一个新宏窗口，导入 Github（http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）上的"Stage_Movement"代码。确保本代码中的"Stage_Movement"工作目录与步骤 4.2.2 中的目录相同。将"Stage_Movement"代码保存到步骤 4.2.2 中的同一文件夹。
5. 使用照片消融生成微模式
- 打开显微镜及其配件。确保红新月激光在此之前已经充分预热。
- 将 PVA 涂层盖盖滑移到支架上。对于直立显微镜，请确保 PVA 表面向下消融。
- 将水添加到角落，以稳定盖片，并将支架安装到显微镜舞台上。
- 降低目标，将水添加到盖滑上。
注：此处描述的协议针对 25x/1.1 NA 浸入目标进行了优化。如果使用干燥或油浸入目标，水应替换为适当的浸入介质。当水浸入目标用于生成大型微模式阵列时，蒸发可能会成为一个问题。如果是这样的话，水应该换成GenTeal，一种从药店获得的非处方眼润滑剂。 - 在显微镜软件中，打开 A1+MP GUI窗口中的 IR 激光快门。单击 自动对齐 按钮，在图案调整之前对齐激光。
注意：在每个模式会话的开始时执行激光自对齐至关重要，因为激光路径上的小偏差将显著影响模式的质量。 - 切换到"图像"光学配置。在 A1+紧凑型 GUI 窗口中，单击 扫描 扫描 FOV，同时缓慢地将目标移近盖滑。
- 仔细监控图像。起初，图像将显得极其暗淡。将目标移近盖滑，直到图像亮度增加。这是面向目标的盖滑表面。继续移动目标，直到亮度降低并再次增加。这是要图案的 PVA 表面。专注于此表面上的任何小功能（覆盖滑动缺陷、灰尘 等），并在 Z 驱动器上设置为零。对焦后始终设置为零。
注意：虽然盖片的两个表面都涂有 PVA，但玻璃的光学特性不会因 PVA 涂层而显著改变。我们经常用干燥、水和油浸入目标对此类盖片进行成像，并且没有发现非图案的 PVA 表面干扰成像。 - 切换到"Label_Surface"光学配置。点击 捕获。返回"成像"光学配置并扫描。玻璃表面应损坏，并出现无定形。受损区域肉眼可见，指示图案在进一步实验中的位置。
注意：要增加可见标签的大小，请在多个相邻的 FOV 中重复步骤 5.8。 - 再次检查目标大致位于盖滑的中心。确保目标与盖滑之间有足够的水。将舞台移动 1 到 2 个 FOV，以避免玻璃颗粒和扫描以确认。
- 在 设备 菜单中，打开 Stage_Movement 宏。检查 Pattern_Stimulation 工作目录是否正确：如果没有，刺激不会发生。将变量"模式长"和"模式海特"设置为将要图案的 FOV 所需的数量。保存并运行宏。
- 图案完成后，切换到"成像"光学配置。再次检查 IR 激光快门是否在 A1+MP GUI 窗口中打开。
- 移动舞台查看模式。扫描这些模式以检查其质量。
- 将盖片传输到网格框，并朝上模式。
- 在使用前一周内，在 +4 °C 下存储图案盖片。
6. 纤维素吸附
- 使新鲜的1 M纳布4 在1 M NaOH解决方案。以 1：100 的比例添加到含有 0.2 M 乙醇胺的 pH 8.0 磷酸盐缓冲器。
- 将图案盖片转移到 35 毫米组织培养盘上。用上面1mL的溶液孵化每个盖片8分钟，以淬灭自动荧光，然后用PBS冲洗3次。
- PBS 中的稀释纤维素 （FN） 最终浓度为 10μg/mL。在 FN 中孵化盖唇 1 小时，±37 °C。
注：如果观察到ECM蛋白与基板的实质性非特异性结合，FN可以在含有0.1%的Pluronic F-12724的PBS中稀释。 - 用PBS清洗盖子2次。如果不立即使用，请在 PBS 中存储在 +4 °C 过夜。
7. 细胞附件
注：以下协议针对主要人类金银成纤维细胞进行了优化。
- 培养一个10厘米的细胞盘到70%的汇流。
- 在 +37 °C 水浴中加热细胞培养介质、PBS 和 0.05% 的肌氨脂。
注意：对于弱附着在基板上的细胞，与经文（0.48 mM EDTA）或专有无酶缓冲器的非蛋白分离可能会增加细胞对模式的依恋，应予以考虑。 - 在播种细胞之前，将图案盖片移到含有 1 mL 暖 PBS 的干净 35 mm 组织培养盘上。
- 从 10 厘米的组织培养盘中吸气细胞培养介质，然后用 PBS 清洗一次。
- 将 700 μL 的 0.05% trypsin/EDTA 添加到菜中，并在 +37 °C 中孵化细胞，在 1 分钟内加入 5% CO2 孵化器。
- 同时，吸气 PBS 覆盖图案盖滑，并添加 1 mL 的细胞培养介质。
- 确认细胞已分离。然后用10mL的细胞培养介质恢复尝试型细胞，并在图案盖唇中加入1mL。
- 培养细胞在孵化器中2-3小时，并检查是否有足够的细胞连接到模式。如果是这样，更改媒体一次，以删除未连接的单元格。这最大限度地减少了多个细胞落在同一模式上的机会。
注意：附件时间可能因细胞类型而异。 - 再过3-4小时，或者当足够数量的细胞在模式上扩散时，细胞已经准备好进行进一步实验。不要等待太久以避免细胞分裂。
8. 数据获取
- 在细胞球菌缓冲器中用 4% PFA 修复细胞， 在室温下 10 分钟。
- 遵循为感兴趣的蛋白质建立的免疫荧光协议。PVA 涂层盖片与任何免疫荧光协议配合良好。
- 使用适当的显微镜获取细胞图像。根据实验目标，每个 FOV 映像一个或多个单元格。
9. 图像分析
注：以下协议允许用户从显微镜图像的 Z 堆中获取感兴趣的蛋白质对大量细胞的平均荧光信号。
- 打开 NIS 元素中获取的图像并裁剪图像。确保每个图像只包含一个分布良好的单元格。有关图像处理的详细说明，可以在下面的脚本中找到。
- 安装蟒蛇，并通过阿纳康达导航器发射间谍。
注：.py脚本可以在任何环境中运行，并具有要求中标识的相应包.txt。我们推荐 Anaconda，因为它包含以下代码所需的大多数包。 - 从 Github（https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）下载脚本，并在 Spyder 中打开（"Pattern_Averaging_3Channels.py"或"Pattern_Averaging_4Channels.py"，分别用于具有 3 个频道或 4 个频道的图像）。
- 根据获得的图像设置参数。有关详细信息，请参阅脚本。
- 按 F5 运行脚本。可以在控制台面板中跟踪进度。
- 检索保存在同一文件夹中的输出文件。输出图像是所有样本每个通道的平均值。Excel 表显示了样本单元内每个通道的平均强度，从而能够进行进一步的定量分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
通过微观模式获得的实验数据的质量在很大程度上取决于模式的质量。为了确定使用上述方法生成的图案的质量，我们首先使用反射显微镜来评估盖唇照片消融区域的形状和大小。我们发现，每个图案看起来非常类似于消融面膜，并显示清晰的板和表面，反射光均匀 （图2B）.各种形状和尺寸可以打印取决于所需的细胞骨架构，但我们使用的十字弓形状，最适合我们的目的。原子力显微镜 （AFM） 显示，这种模式的高度约为 140 nm，表面光滑，整个（图 2F）的拓扑变化最小。劣质图案设置，如低激光功率和不正确的焦平面，导致PVA表面的不完全去除，表现为较暗的部分模式与不均匀的拓扑（图2C）。设置激光功率过高导致PVA"冒泡"，当极端时，覆盖滑动表面的损害也是不可取的（图2D）。
在初步实验中，我们试图通过减少单盖滑动上的多个 FOV 来增加图案面积。我们发现，这种方法虽然原则上有效，但由于显微镜支架的 Z 漂移和盖滑的轻微倾斜，是不可靠和乏味的。为了以自动化的方式实现大量 FOV 的优质模式，我们实现了定制宏，提高了显微镜聚焦在成型过程中的精度。多光子显微镜采用脉冲激光，在狭窄的焦平面上高效降解具有高功率的PVA，使图案过程对样品中的任何不均匀或倾斜都敏感。因此，确定每个 FOV 中的精确焦距非常重要。对于缺乏完美对焦模块的系统来说，这更成问题，因为只有一到两微米的偏差会使模式化过程无果而终。为了解决这个问题，自定义的宏脚本首先在每个新 FOV 的中心图案为一个小正方形，只需通过扫描相对较厚的 Z 栈（≈20 μm）大致对焦。然后，显微镜快速扫描图像堆栈，并使用 NIS 元素自动对焦功能识别最佳焦距平面。然后加载图案面膜并设置为刺激投资回报率，以便进行红十字刺激。该阶段随后移动到下一个 FOV 并重复此过程。此外，显微镜阶段运动的方波形路径确保了顺序 FOV 之间的最小误差积累。通过使用此协议，我们通常在不到 3 小时内制造出由 49 个显微镜 FOV 组成的图案，覆盖覆盖盖片 3.5 x 3.5 mm 区域。
为了测试图案区域（而不是不受干扰的 PVA）是否可以吸收 ECM 蛋白质，我们用 10μg/mL FN 涂上图案盖片，并用抗 FN 抗体染色。使用宽场荧光显微镜，我们发现FN均匀地吸收到通过激光消融（图2E）去除PVA的图案区域。
为了确定细胞骨质疏松架构和张力分布是否可以如预期的那样在图案上进行修改，我们在图案盖上播种细胞，并通过荧光显微镜可视化肌辛光链的分布，肌素光链是收缩性的标志。初始播种后，细胞逐渐向盖唇倾斜。那些降落在附着的图案区域，并随着时间的推移扩散到图案的形状。那些降落在PVA上只松散地连接，并在几次洗涤和媒体更改后被删除。我们发现，分布在图案上的细胞显示表型成纤维细胞结构，包括跛脚菌的密集边缘、两侧的厚腹压纤维以及由横弧连接的跛脚状应力纤维（图3A）。肌辛光链 （MLC） 坐在密集的跛脚皮皮亚边缘后面， 沿着 actin 捆绑显示条纹图案。正如许多细胞的平均图像所表明的，这种表型在很多模式（图3B）中是一致的。
图1。IR激光辅助微模式（微光托管）的示意图。 （A） 玻璃盖片按各自顺序与 APTMS、GA 和 PVA 化学结合。PVA表面对细胞和蛋白质不粘合。（B） PVA 通过 IR 激光以预设模式删除。（C） 图案盖片涂有 ECM 蛋白，只能吸食到图案区域。（D） 细胞被镀在盖片上，固定和免疫染色感兴趣的蛋白质。降落在图案岛屿上的细胞扩散成形成典型细胞骨结构的模式形状，而降落在PVA上的细胞细胞仍然是球形的。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。微模式验证和特征。 （A） 在显微镜舞台上设置 IR 激光辅助显微模式（显微图） 。IR 激光在多个 FOV 中热消融 PVA。（B） 显微模式的反光显微镜图像，具有清晰的板条，与投资回报率面罩相同。（C） 因激光功率不理想而导致PVA不完全去除的反射显微镜图像。（D） 过度激光功率导致PVA冒泡的反射显微镜图像。（E） FN 涂层图案盖片的免疫荧光图像，带有抗 FN 原抗体和氟磷共生的二次抗体。（F） AFM 拓扑扫描线和具有代表性的 AFM 图像的十字弓图案。为了测量微模式的拓扑学，使用安装在NanoWizard 4原子力显微镜上的布鲁克AFM探头（MLCT-B）进行接触模式成像。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3。镀在微图上的细胞的代表性图像。 （A） 一种主要人类金银细胞成纤维细胞的代表图像，镀在为行为素和MLC免疫的十字弓图案上。图像是用装有100倍目标的共聚焦显微镜获得的。（B） 在由自定义 Python 脚本生成的十字弓图案上镀的细胞中，平均作用素和 MLC 的免疫荧光图像。 请单击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
上述结果表明，所述的 IR 激光辅助微模式（微光托管）协议提供了各种形状的可重复粘附模式，能够操作细胞形状和细胞细胞结构。虽然在显微相位法出现之前和之后都开发出许多微模式方法，但这种方法具有若干优点。首先，它不需要专业设备和清洁室，通常只在工程部门内找到。事实上，随着多光子显微镜在生物学部门越来越常见，显微光学扩展了多光子显微镜的应用，并增加了潜在的用户群。模式也可以根据需要更改并立即打印，而不必制造需要冗长的石版画过程的新主晶圆。
与预先存在的微磷托邦协议相比，我们协议的一个改进是消除覆盖滑准备过程中几个耗时的固化步骤。我们表明，PVA盖唇附件的质量仍然不受干扰，因为图案仍然完好无损，甚至在制造两周后也能结合细胞。更重要的是，我们通过消除预设每个 FOV24位置的需要，提高了模式化过程的自动化程度。相反，我们实现了一个可以理解的宏，允许大面积的图案，同时精确识别每个 FOV 的最佳焦点平面。
虽然协议中的宏实现了系统模式的自动化，但我们明白，每个商用激光扫描显微镜都配备了自己的专有软件，很少与其他软件兼容，因此很难在其他系统上实施我们的确切协议。但是，总体工作流程可以很好地适应其他商业系统，从而促进自动微模式，即聚焦于每个 FOV、加载面膜、消融 PVA 以及将显微镜阶段移动到新的 FOV 的过程。
应非常小心地执行模式协议中的几个步骤，以确保有效的模式化。最关键的步骤是在生成模式之前优化刺激条件。在多光子显微镜中，两个或两个以上的光子必须几乎同时到达荧光分子，并结合其能量来激发荧光。此低概率事件创建一个极其薄的光学部分，可增加信号与噪声比率28。虽然对成像有用，但此功能使去除薄 PVA 涂层对样品的 Z 位置极为敏感。可以采取若干措施来对付这种情况。首先，应微调激光功率，以确保彻底去除PVA，而不会"煮"聚合物或损坏玻璃盖片。如果PVA去除始终不完整，我们建议检查激光对齐，因为这通常会增加激光功率。其次，应平定显微镜阶段以避免样品倾斜，这可能导致模式不完整。还应设置多个 Z 位置的红外刺激，以确保 PVA 层成为目标。或者，如果显微镜配备了一个完美的对焦模块，可以进行初步测试，以确定 PVA 定位 Z 位置的最佳偏移。另一个关键步骤是建立一个显微镜宏，允许模式刺激的自动化方式。宏应找到每个新 FOV 的焦点平面，以避免样品倾斜或表面不均匀引起的并发症。它还应允许舞台以 S 形从一行移动到另一行，类似于双向扫描的路径，以最大限度地减少连续 FOV 之间 Z 中的偏差。
所述协议的一个限制是生产大量图案盖片所需的时间，这是基于光刻的微接触打印29，30提供的无与伦比的优势。因此，此协议最适合需要有限数量条件的实验，或需要在模式形状和大小上随时可用的调整的实验。此外，对于缺少硬件自动对焦模块的系统，我们将一系列刺激事件集成到不同的 Z 平面中，以确保自动和有效的 PVA 去除。由于 IR 刺激是最耗时的步骤，每个刺激事件（约 30 秒）的添加显著延长了模式化过程。如果时间值得关注，我们建议通过缩小步幅来微调自动对焦。这有助于识别最佳焦距平面，从而减少所需的红十字刺激事件数量。在我们的实验中，将刺激事件的数量从5次减少到2次，将时间缩短一半（1.5小时）。
最后，我们描述的 IR 激光辅助显微模式（微光托管）协议可用于任何能够访问 IR 激光设备显微镜的实验室。除了研究细胞骨架构和信号通路，连接形式到功能，这种技术也可以应用于药物筛选和其他应用程序，对细胞对细胞的变化敏感。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有透露任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了康诺特基金新调查员奖、加拿大创新基金会、NSERC发现赠款计划（授予RGPIN-2015-05114和RGPIN-2020-05881）、曼彻斯特大学和多伦多大学联合研究基金和多伦多大学XSeed项目的支持。C.T. 得到了国家人权委员会USRA研究金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
References
- Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
- Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
- Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
- Paluch, E., Heisenberg, C. -P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
- Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
- Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
- Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
- Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
- Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
- Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
- Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
- Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
- Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
- Waterman-Storer, C. M.
- Inoué, S., Spring, K. R. Video Microscopy: The Fundamentals. , Springer. US. (1997).
- Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
- Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0-14 (2013).
