Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontrol af cellegeometri gennem infrarød laserassisteret mikromaling

Published: July 10, 2021 doi: 10.3791/62492
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Summary

Den protokol, der præsenteres her, muliggør automatiseret fremstilling af mikropatterner, der standardiserer celleformen for at studere cytoskeletale strukturer i pattedyrsceller. Denne brugervenlige teknik kan sættes op med kommercielt tilgængelige billedbehandlingssystemer og kræver ikke specialiseret udstyr utilgængeligt for standard cellebiologiske laboratorier.

Abstract

Micropatterning er en etableret teknik i cellebiologi samfund, der anvendes til at studere forbindelser mellem morfologi og funktion af cellulære rum og samtidig omgå komplikationer som følge af naturlige celle-til-celle variationer. For at standardisere celleformen er cellerne enten begrænset i 3D-forme eller kontrolleret for klæbende geometri gennem klæbende øer. Men traditionelle mikromalingsteknikker baseret på fotolitografi og dyb UV-ætsning afhænger i høj grad af rene rum eller specialiseret udstyr. Her præsenterer vi en infrarød laser assisteret micropatterning teknik (microphotopatterning) modificeret fra Doyle et al., der kan bekvemt sættes op med kommercielt tilgængelige billedbehandlingssystemer. I denne protokol bruger vi et Nikon A1R MP+ billedsystem til at generere mikropatterner med mikronpræcision gennem en infrarød (IR) laser, der brænder forudindstillede områder på poly-vinyl alkoholbelagte coverslips. Vi anvender et brugerdefineret script til at muliggøre automatiseret mønsterfremstilling med høj effektivitet og nøjagtighed i systemer, der ikke er udstyret med en hardware autofokus. Vi viser, at denne IR laser assisteret micropatterning (microphotopatterning) protokol resulterer i definerede mønstre, som cellerne tillægger udelukkende og tage den ønskede form. Desuden kan data fra et stort antal celler beregnes som et gennemsnit på grund af standardiseringen af celleformen. Mønstre genereret med denne protokol, kombineret med høj opløsning billeddannelse og kvantitative analyser, kan bruges til relativt høje gennemløb skærme til at identificere molekylære spillere formidle forbindelsen mellem form og funktion.

Introduction

Celleform er en vigtig determinant for grundlæggende biologiske processer somf.eks. Ændringer i celleformen er drevet af en indviklet balance mellem dynamiske omlejringer af cytoskelet, der deformerer plasmamembranen og ydre faktorer som eksterne kræfter, der udøves på cellen, og geometrien af cellecelle- og cellematrix vedhæftninger5. Migrerende mesenchymale celler, for eksempel, polymerisere en tæt actin netværk på forkant, der skubber plasmamembranen fremad og skaber en bred lamellipodia6, mens actomyosin kontraktilitet trækker cellens smalle bagkant at løsne cellen fra sin nuværende position7,8. Afbrydelse af signalhændelser, der giver anledning til sådanne specialiserede cytoskeletale strukturer, forstyrrer form og polaritet og bremser cellemigration9. Derudover kræver epitelpladebøjning under gastrulation actomyosin-baseret apical indsnævring, der får celler og deres naboer til at blive kileformede10. Selv om disse undersøgelser fremhæver betydningen af celleform, den iboende heterogenitet i celleform har belastet bestræbelser på at identificere mekanismer, der forbinder morfologi til at fungere.

Til dette formål er der udviklet adskillige tilgange til at manipulere celleform i løbet af de sidste tre årtier. Disse tilgange nå deres mål ved enten at begrænse cellen med en tre-dimensionel skimmel eller kontrollere cellulære vedhæftning geometri gennem mønstret deposition af ekstracellulære matrix (ECM) proteiner på en antifouling overflade, en teknik kaldet micropatterning11. Her vil vi gennemgå en række teknikker, der har vundet popularitet gennem årene.

Oprindeligt banebrydende som en tilgang til mikroelektroniske applikationer, blød litografi-baseret microcontact udskrivning er utvetydigt blevet en kult favorit12. En master wafer fremstilles først ved selektivt at udsætte områder af et fotoresistbelagt siliciumsubstrat til fotoirradiation, hvilket efterlader en mønstret overflade13. En elastomer, såsom PDMS, hældes derefter på master wafer for at generere et blødt "stempel", der overfører ECM-proteiner til et ønsket substrat11,14. Når den er fremstillet, kan en master wafer bruges til at kaste mange PDMS-frimærker, der giver anledning til meget reproducerbare mikropatterns12. Mønstrene kan dog ikke let justeres på grund af den langvarige fotolitografiproces. Denne proces kræver også højt specialiseret udstyr og renrum, der ikke typisk er tilgængelige i biologiafdelinger.

På det seneste er direkte udskrivning ved hjælp af dyb UV blevet rapporteret for at omgå begrænsninger, der er forbundet med traditionelle litografibaserede tilgange. Dybt UV-lys ledes gennem en fotomaske til selektive områder af en glasovertrækslip belagt med poly-L-lysin-podet -polyethylen glycol. Kemiske grupper, der udsættes for dyb UV, fotokonverteres uden brug af lysfølsomme linkere for at muliggøre binding af ECM-proteiner15. Manglen på lysfølsomme linkere gør det muligt for mønstrede coverlips at forblive stabile ved stuetemperatur i over syv måneder15. Denne metode undgår brug af renrum og fotolitografiudstyr og kræver mindre specialiseret træning. Kravet om fotomasker udgør dog stadig en væsentlig hindring for eksperimenter, der kræver lettilgængelige ændringer i mønstre.

Ud over metoder, der manipulerer cellegeometri gennem kontrolleret deposition af ECM-proteiner på en 2D-overflade, søger andre at kontrollere celleformen ved at begrænse celler i 3D-mikrostrukturer. Mange undersøgelser har tilpasset den bløde litografi-baserede tilgang, der er beskrevet ovenfor for at generere 3D, snarere end 2D, PDMS kamre til at undersøge form-afhængige biologiske processer i embryoner, bakterier, gær og planter16,17,18,19. To-foton polymerisering (2PP) har også taget føringen som en mikrofabrikationsteknik, der kan skabe komplekse 3D hydrogel stilladser med nanometeropløsning20. 2PP bygger på principperne om to-foton adsorption, hvor to fotoner leveret i femtosecond pulser absorberes samtidigt af et molekyle - fotoinitiator i dette tilfælde - der muliggør lokal polymerisering af fotopolymerer21. Denne teknik har været stærkt anvendt til at udskrive 3D stilladser, der efterligner de oprindelige ECM strukturer af humant væv og har vist sig at fremkalde lav fotokemisk skade på celler22.

Debuten af microphotopatterning for 10 år siden gav forskere mulighed for at fremstille mikropatterner og samtidig undgå utilgængeligt og specialiseret udstyr. Mikrofotomaling skaber mønstre på mikronskalaen ved termisk at fjerne selektive områder af poly-vinylalkohol (PVA) belagt på aktiverede glasoverflader ved hjælp af en infrarød laser23,24. ECM-proteiner, der kun fastgør den underliggende glasoverflade og ikke PVA, tjener derefter som biokemiske signaler for at muliggøre kontrolleret spredningsdynamik og celleform. Denne metode giver også overlegen fleksibilitet, da mønstre let kan ændres i realtid. Her leverer vi en trinvis protokol for mikrofotomaling ved hjælp af et kommercielt multifoton-billedsystem. Den beskrevne protokol er designet til hurtig og automatiseret fremstilling af store mønstre. Vi viste, at disse mønstre effektivt styrer celleformen ved at begrænse geometrien af celle-ECM-vedhæftninger. Endelig viser vi, at den beskrevne mønsterteknik modulerer organisationen og dynamikken i actin cytoskeleton.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbehandling af coverslip

  1. Forbered knirkende rene coverslips som beskrevet i Waterman-Storer, 199825.
  2. Forbered 1% (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS) opløsning og inkuber coverlips i opløsningen i 10 minutter med blid agitation. Sørg for, at coverslips bevæger sig frit i opløsningen.
  3. Vask coverslips to gange med dH2O i 5 min hver.
  4. Forbered 0,5% glutaraldehyd (GA) opløsning og inkuber coverlips i opløsningen i 30 minutter på en shaker. Til 25 coverslips anvendes 50 ml glutaraldehydopløsning. Sørg for, at coverslips bevæger sig frit i opløsningen.
  5. Vask coverslips tre gange med dH2O i 10 min hver.
  6. Spin tørre coverslips til 30 s ved hjælp af en specialbygget coverslip spinner. En detaljeret beskrivelse af coverslip spinner er blevet offentliggjort26 og er tilgængelig online (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Aktiverede coverlips kan opbevares i op til en måned ved +4 °C i en kasse med skillevægge, så de skiller sig ud fra hinanden.

2. PVA-belægning

  1. Bland PVA (98% hydrolyseret PVA, MW 98000) med dH2O for at lave en 5,6% opløsning.
  2. Blandingen opløses i et 90 °C vandbad, og der filtreres straks gennem et 0,2 μm filter i et biosikkerhedsskab, mens det er varmt. Lageropløsningen filtreres igen, hvis den udfældes. PVA-opløsning kan opbevares ved stuetemperatur i 3 måneder.
  3. I et 15 mL rør tilsættes en del HCl til otte dele PVA. Vend røret forsigtigt et par gange for at blande.
  4. Hæld 2 ml af den blandede opløsning i en 35 mm petriskål og nedsænke en ren, forbehandlet coverslip i væsken, idet man sørger for, at coverslips ikke klæber til bunden. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter på en shaker.
  5. Fjern forsigtigt dækslet fra opløsningen. Brug coverslip spinner til at spinde pels i 40 s. I mellemtiden skal du rense pincet. Dækslet overføres til en kasse og tørres ved +4 °C natten over. PVA-coatede coverslips kan opbevares ved +4 °C i op til to uger.

3. Konfiguration af multifoton mikroskop

BEMÆRK: Den beskrevne protokol er indstillet til at skabe celleklæbende mikropatterner af den ønskede form og størrelse på opretstående eller inverterede multifoton billedbehandlingssystemer, især dem, der ikke er udstyret med en hardware autofokus. Således for hvert synsfelt (FOV), den mønstrende script flammer et lille område for at skabe en betroet markør på coverlip, bruger en software autofokus til at fokusere mikroskopet på coverlip overflade, og flammer det ønskede mønster. Hvis du kører dette script i en løkke for tilstødende FOV'er, oprettes der et stort udvalg af mikropatterner (5 x 5 mm eller derover), som begrænser celleformen og modulerer aktiviteten af intracellulære biologiske processer. Den beskrevne protokol blev udviklet til Nikon A1R MP + billedbehandlingssystem, der kontrolleres af NIS-Elements software. Hvis et billedsystem fra en anden leverandør bruges til mønster, skal de optiske konfigurationer og mønsterscriptet justeres i overensstemmelse med producentens anvisninger.

  1. Tænd for mikroskopsoftwaren. Sørg for, at målet "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" er monteret på mikroskopet.
    BEMÆRK: Den her beskrevne protokol er optimeret til et 25x/1.1 NA vand nedsænkningsmål, men andre mål kan også bruges til mønstre. Læserne skal være opmærksomme på, at pattering med en høj forstørrelse mål(f.eks40x og 60x) tager længere tid, da det væsentligt reducerer antallet af mønstre ablated i hver FOV. Lav forstørrelse mål kan bruges til at mønstre, så længe de giver ensartet belysning på tværs af FOV og laser magt tilstrækkelig til at ablate PVA lag.
  2. I A1plus MP GUI-vinduet skal du indstille laserlinjen til 750 nm.
  3. Konfigurere den optiske konfiguration af "Image"
    BEMÆRK: NIS-Elements giver brugerne flere værktøjer (grafisk grænseflade, en anskaffelsesarbejdsgangsbygger JOBS, optiske konfigurationer og makroer) til at styre mikroskophardwaren. I denne protokol opnås det meste af hardwarestyringen gennem forskellige optiske konfigurationer samt ND Acquisition- og ND Stimulation-moduler.
    1. Klik på Ny optisk konfigurationunder fanen Kalibrering . Navngiv den optiske konfiguration "Billede". Dette er den grundlæggende optiske konfiguration, der gør det muligt at billedbehandling af coverlip gennem reflektion. Lad alle andre indstillinger være standard, og vælg den relevante målsætning.
    2. Klik på knappen Indstillinger i vinduet A1plus MP GUI for at konfigurere hardwareindstillingerne under denne optiske konfiguration. Indstil stimuleringslaseren til IR-stim, placer Beam Splitter (BS 20/80) i lysstien, indstil scannerenheden til Galvano, og vælg den relevante descanned detektor.
    3. I GUI-vinduet A1plus Compact skal du vælge en scanningsstørrelse og opholdstid, der er tilstrækkelig til at fange små funktioner på coverlip(henholdsvis 1,1 ms og 1024 pixels på vores system). Klik på knappen Normal, så der ikke udføres linjegennenit eller linjeintegration. Kontroller, at afkrydsningsfeltet Brug IR-laser er markeret. Konfigurer envejsscanning for at gøre det enkelt.
      BEMÆRK: Hvis scanningshastigheden giver anledning til bekymring, kan der anvendes tovejsscanning.
    4. I samme vindue skal du justere lasereffekten og detektorfølsomheden for at opnå et lyst, men ikke mættet billede af dækslets overflade. Indstilling af lasereffekt til 3 - 5% af den maksimale effekt- og detektorfølsomhed ("HV"-skyderen) til 15 V er et godt udgangspunkt.
    5. I vinduet A1plus-scanningsområde skal du indstille Zoom til 1 for at fange hele FOV.
    6. Gem den optiske konfiguration.
  4. Konfigurere den optiske konfiguration "Print_Fudiciary_Marker"
    1. Dupliker den optiske konfiguration "Billede", og omdøb den til "Print_Fudiciary_Marker".
    2. I vinduet A1plus Compact GUI skal du vælge den mindste scanningsstørrelse og opholdstid (henholdsvis 64 pixel og 80,2 ms på vores system).
    3. Da der ikke kræves billedbehandling i dette trin, skal du indstille detektorfølsomheden til 0 og øge lasereffekten til 30 %. Højere lasereffekt vil termisk fjerne PVA-laget på coverlipet i de ønskede områder.
    4. I vinduet A1plus Scan Area skal du indstille Zoom til maksimum (15,87 for vores system) og placere scanningsområdet midt i FOV.
    5. Opret et Z-stack-eksperiment i vinduet Anskaffelse af ND. Indstil bevægelse i Z-positionen til Relativ, og vælg den relevante Z-enhed. Trinstørrelsen indstilles til 2 μm og stakdybden til 10 μm over og under for at tage højde for eventuelle ujævnheder i mikroskopstadiet eller PVA-overfladen mellem tilstødende FOV'er.
  5. Konfigurere den optiske konfiguration "Autofokus"
    1. Dupliker den optiske konfiguration "Billede" og omdøb den til "Autofokus".
    2. I vinduet A1plus-scanningsområde skal du reducere Zoom-faktoren, så FOV er lidt større end tillidsmarkøren. Dette sikrer, at andre små funktioner på coverlip ikke forstyrrer autofokusering.
    3. Vælg Autofokus Konfigureri menuen Enheder . Indstil scanningstykkelsen til Z-stakken i Z-stakeksperimentet (se trin 3.5.5). Mikroskopet scanner gennem dette område og finder det bedste brændplan ved hjælp af tillidsmarkøren. Lad trinstørrelsen være som standard.
  6. Konfigurere den optiske konfiguration "Load_ROI"
    1. Dupliker den optiske konfiguration "Billede" og omdøb den til "Load_ROI".
    2. Angiv scanningsstørrelsen i vinduet A1plus Compact på samme størrelse som roi-masken. Denne optiske konfiguration bruges til at tage et billede, som ROI-masken indlæses på. Vi brugte 2048 pixels til at opnå en optimal balance mellem opløsning og hastighed.
      BEMÆRK: Det er vigtigt, at dette optagne billede er identisk med ROI-masken.
  7. Opsætning af den optiske konfiguration "Micropattern"
    1. Dupliker den optiske konfiguration "Print_Fiduciary_Marker" og omdøb den til "Micropattern".
    2. Angiv zoomfaktoren til én.
    3. I A1plus MP GUI-vinduet skal du øge stimuleringslasereffekten for at ablate PVA og vælge en passende scanningshastighed (henholdsvis 40% og 32 s / ramme i vores eksperimenter).
    4. I ND Stimulation vinduet, oprette en ND stimulation eksperiment. Føj et par faser til tidsplanen, og angiv dem som Stimulering. Sørg for, at stimuleringsområdet og varigheden er korrekt.
      BEMÆRK: Antallet af faser kan justeres i henhold til tykkelsen og glatheden af PVA-laget samt den lasereffekt, der bruges i denne optiske konfiguration.
    5. I samme vindue skal du aktivere funktionen StgMoveMainZ(-1.000,1) før hver fase. Dette forklarer igen eventuelle afvigelser i Z-retningen.
      BEMÆRK: Den afstand og retning, hvori målet bevæger sig, kan justeres i henhold til PVA-lagets tykkelse og glathed.
  8. Konfigurere den optiske konfiguration "Label_Surface"
    1. Dupliker den optiske konfiguration "Print_Fudiciary_Marker" og omdøb den til "Label_Surface".
    2. I GUI-vinduet A1plus Compact skal du øge lasereffekten betydeligt og indstille Zoom til én. Høj laserkraft, der anvendes her, vil fysisk skade glasovertræksdækslet og producere en etiket, der er synlig for det blotte øje. Dette hjælper med at lokalisere mønstrene i yderligere eksperimenter.

4. Generering af roi-masken og opsætning af makroen

  1. Generering af ROI-masken
    1. Brug Adobe Photoshop eller anden tilgængelig software til at generere et 2048 × 2048 RGB-billede. Billedet svarer til en FOV under mikroskopet (dvs. 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm per pixel). Billedet skal have en sort (0, 0, 0) baggrund.
      BEMÆRK: En række kommercielle og gratis billedredaktører kan bruges til at generere ROI-masker til laserassisteret mikromaling. Selvom vi bruger Adobe Photoshop til at generere masker, er GIMP og ImageJ / Fiji også tilgængelige som alternative gratis muligheder.
    2. Tegn 8 - 12 hvide (255.255.255) mønstre på den sorte baggrund. Mønsterstørrelsen varierer afhængigt af celletypen (~200 pixel i diameter). Lad et tomt område på 500 × 500 være i midten af billedet til autofokusering. Der skal være tilstrækkelig plads mellem tilstødende mønstre (>200 pixel) og hos FOV's boarder for optimal ablation og celletilbehør. Mønstre præsenteret i denne protokol er tilgængelige på Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
  2. Opsætning af makroen
    1. Klik på makromenuen , og vælg Ny makro.
    2. Importer koden "Pattern_Stimulation", der er tilgængelig på Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning), til vinduet Ny makro. Gem denne kode i en passende mappe.
    3. Åbn et nyt makrovindue, og importer koden "Stage_Movement", der er tilgængelig på Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Kontroller, at arbejdsmappen "Stage_Movement" i denne kode er identisk med den, der blev 10.2.2. Gem koden "Stage_Movement" i den samme mappe i trin 4.2.2.

5. Generering af mikropatterner ved hjælp af foto ablation

  1. Tænd mikroskopet og dets tilbehør. Sørg for, at IR-laseren er varmet tilstrækkeligt op inden dette.
  2. Overfør den PVA-belagte coverlip på en holder. For et opretstående mikroskop skal du sikre dig, at PVA-overfladen ablated vender nedad.
  3. Tilsæt vand til hjørnerne for at stabilisere coverlip og montere holderen på mikroskop fase.
  4. Sænk målet og tilsæt vand på coverlip.
    BEMÆRK: Den protokol, der er beskrevet her, er optimeret til et 25x/1.1 NA-vandsænkningsmål. Hvis der anvendes et tørt eller oliedybningsmål, skal vandet udskiftes med et passende nedsænkningsmedium. Når et mål for nedsænkning af vand bruges til at generere et stort mikropatternsystem, kan fordampning blive et problem. Hvis dette er tilfældet, skal vand udskiftes med GenTeal, et håndkøbssmøremiddel, der er tilgængeligt fra apoteker.
  5. I mikroskopsoftwaren skal du tænde for IR-laserskodden i A1plus MP GUI-vinduet. Klik på knappen Automatisk justering for at justere laseren før mønster.
    BEMÆRK: Det er afgørende at udføre laser autoalignering i begyndelsen af hver mønstersession, da små afvigelser i laserstien vil påvirke mønstrenes kvalitet betydeligt.
  6. Skift til den optiske konfiguration "Billede". I gui-vinduet A1plus Compact skal du klikke på Scan for at scanne FOV, mens du langsomt flytter målet tættere på coverlipet.
  7. Overvåg billedet omhyggeligt. I første omgang vises billedet ekstremt svagt. Flyt målet tættere på coverlip, indtil billedets lysstyrke øges. Dette er den coverlip overflade, der står over for målet. Fortsæt med at flytte målet, indtil lysstyrken falder og stiger igen. Dette er den PVA overflade, der skal mønstres. Fokuser på enhver lille funktion (coverslip ufuldkommenheder, støv osv.)på denne overflade og sæt nul på Z-drevet. Sæt altid nul efter fokusering.
    BEMÆRK: Selv om begge flader på coverlipet er belagt med PVA, ændres glassets optiske egenskaber ikke væsentligt af PVA-belægning. Vi rutinemæssigt billede sådanne coverslips med tør, vand-og olie-nedsænkning mål og fandt ikke den ikke-mønstrede PVA overflade til at forstyrre billeddannelse.
  8. Skift til den optiske konfiguration "Label_Surface". Klik på Hent. Vend tilbage til den optiske konfiguration og scanning af "billedbehandling". Glasoverfladen skal være beskadiget og fremstå amorf. Det beskadigede område er synligt for det blotte øje, hvilket angiver placeringen af mønstre i yderligere eksperimenter.
    BEMÆRK: For at øge størrelsen på den synlige etiket skal du gentage trin 5.8 i flere tilstødende FOV'er.
  9. Kontroller igen, at målet er nogenlunde i midten af coverslip. Sørg for, at der er tilstrækkeligt vand mellem målet og dækslet. Flyt scenen med 1 til 2 FOV'er for at undgå glaspartikler og scan for at bekræfte.
  10. Åbn makroen Stage_Movement i menuen Enheder. Kontroller, at Pattern_Stimulation arbejdsmappe er korrekt. Hvis ikke, vil stimulering ikke forekomme. Angiv variablerne "PatternLength" og "PatternHeight" til det ønskede antal FOV'er, der skal mønstres. Gem og afspil makroen.
  11. Når mønsteret er fuldført, skal du skifte til den optiske konfiguration "Imaging". Igen skal du kontrollere, at IR-laserskodden er åben i A1plus MP GUI-vinduet.
  12. Flyt scenen for at få vist mønstrene. Scan gennem mønstrene for at kontrollere deres kvalitet.
  13. Overfør coverlip til gitterboksen med mønstre vendt mod.
  14. Der opbevares mønstrede coverslips ved +4 °C i op til en uge før brug.

6. Fibronectin adsorption

  1. Lav frisk 1 M NaBH4 i 1 M NaOH opløsning. Tilsættes ved et forhold på 1:100 til pH 8,0 fosfatbuffer, der indeholder 0,2 M ethanolamin.
  2. Overfør mønstrede coverslips til en 35 mm vævskultur skål. Inkuber hver coverslip med 1 ml af opløsningen ovenfor i 8 minutter for at slukke autofluorescens, og skyl derefter 3 gange med PBS.
  3. Fibronectin (FN) fortyndes i PBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Dækslet inkuberes i FN i 1 time ved +37 °C.
    BEMÆRK: Hvis der observeres væsentlig uspecifik binding af ECM-protein til substratet, kan FN fortyndes i PBS, der indeholder 0,1% Pluronic F-12724.
  4. Vask coverslip 2 gange med PBS. Hvis den ikke anvendes med det samme, opbevares den i PBS ved +4 °C natten over.

7. Celle vedhæftet fil

BEMÆRK: Følgende protokol er optimeret til primære humane gingival fibroblaster.

  1. Kultur en 10 cm skål celler til 70% sammenløb.
  2. Varm op cellekultur medier, PBS og 0,05% trypsin i en +37 °C vandbad.
    BEMÆRK: For celler, der klæber svagt til substratet, kan ikke-proteolytisk dissociation med versene (0,48 mM EDTA) eller en proprietær enzymfri buffer øge celletilbehøret til mønstrene og bør overvejes.
  3. Før såningsceller flyttes den mønstrede coverlip til en ren 35 mm vævskultur skål indeholdende 1 mL varm PBS.
  4. Indsug cellekulturmedierne fra den 10 cm vævskulturske skål og vask en gang med PBS.
  5. Der tilsættes 700 μL på 0,05% trypsin/EDTA til skålen og inkubatceller i en +37 °C, 5% CO2 inkubator i 1 min.
  6. I mellemtiden kan du aspirere PBS, der dækker den mønstrede coverslip og tilføje 1 mL cellekultur medier.
  7. Bekræft, at cellerne er frakoblet. Derefter genbruges de trypsiniserede celler med 10 mL cellekulturmedier, og der tilsættes 1 mL til den mønstrede coverlip.
  8. Dyrkningsceller i inkubatoren i 2 - 3 timer og kontroller, om et tilstrækkeligt antal celler er knyttet til mønstrene. Hvis det er tilfældet, skal du ændre mediet én gang for at fjerne ikke-vedhæftede celler. Dette minimerer risikoen for, at flere celler lander på samme mønster.
    BEMÆRK: Fastgørelsestiden kan variere afhængigt af celletypen.
  9. Efter yderligere 3-4 timer, eller når et tilstrækkeligt antal celler har spredt sig på mønstre, er cellerne klar til yderligere eksperimenter. Vent ikke for længe for at undgå celledeling.

8. Erhvervelse af data

  1. Fix celler med 4% PFA i cytoskeleton buffer27 i 10 min ved stuetemperatur.
  2. Følg immunfluorescens protokoller etableret for proteiner af interesse. PVA-belagte coverslips fungerer godt med enhver immunfluorescens protokol.
  3. Anskaf billeder af celler ved hjælp af et passende mikroskop. Afhængigt af eksperimentets mål skal du afbilde enten en eller flere celler pr. FOV.

9. Billedanalyse

BEMÆRK: Følgende protokol giver brugerne mulighed for at opnå det gennemsnitlige fluorescenssignal for det protein, der er af interesse for et stort antal celler fra Z-stakke af mikroskopbilleder.

  1. Åbn de erhvervede billeder i NIS Elements og beskære billederne. Sørg for, at hvert billede kun indeholder én velopderindet celle. Detaljerede instruktioner om billedbehandling kan findes i scriptet nedenfor.
  2. Installer Anaconda og start Spyder gennem Anaconda Navigator.
    BEMÆRK: De .py scripts kan køres i ethvert miljø med de relevante pakker identificeret i kravene.txt. Vi anbefaler Anaconda, fordi den indeholder de fleste af de nødvendige pakker til koderne nedenfor.
  3. Download manuskriptet fra Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) og åbn i Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py" eller "Pattern_Averaging_4Channels.py" for billeder med henholdsvis 3 kanaler eller 4 kanaler).
  4. Angiv parametre baseret på de erhvervede billeder. Se scriptet for at få detaljerede beskrivelser.
  5. Tryk på F5 for at køre scriptet. Status kan spores i konsolpanelet.
  6. Hent de outputfiler, der er gemt i den samme mappe. Outputbillederne er gennemsnittet af hver kanal for alle prøver. Excel-arket viser middelintensiteten for hver kanal i en prøvecelle, hvilket muliggør yderligere kvantitativ analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kvaliteten af de eksperimentelle data, der opnås ved mikromaling, afhænger i høj grad af mønstrenes kvalitet. For at bestemme kvaliteten af mønstre genereret med metoden ovenfor brugte vi først reflektionsmikroskopi til at vurdere formen og størrelsen af fotoafvaskede områder af coverlipet. Vi fandt ud af, at hvert enkelt mønster lignede ablationsmasken meget og viste klare boardere og en overflade, der reflekterede lys ensartet(figur 2B). En række forskellige former og størrelser kan udskrives afhængigt af den ønskede cytoskeletonarkitektur, men vi brugte armbrøstformen, der passer bedst til vores formål. Atomkraftmikroskopi (AFM) viste, at sådanne mønstre var ca. 140 nm i højden og havde en glat overflade med minimal topologisk variation overalt (Figur 2F). Suboptimale mønsterindstillinger, såsom lav lasereffekt og forkert brændplan, resulterede i ufuldstændig fjernelse af PVA-overfladen, der manifesterer sig som mørkere, delvise mønstre med ujævn topologi (Figur 2C). Indstilling laserkraft for høj resulterede i PVA "boblende", og når ekstreme, coverslip overfladeskader, der også er uønsket (Figur 2D).

I indledende eksperimenter forsøgte vi at øge mønsterområdet ved at aftage flere FOV'er på en enkelt coverlip. Vi fandt, at denne tilgang, selv om den fungerer i princippet, er upålidelig og kedelig på grund af Z-drift af mikroskopstanden og let hældning af coverlipet. For at opnå mønstre af høj kvalitet over et stort antal FOV'er på en automatiseret måde implementerede vi en tilpasset makro, der forbedrede præcisionen af mikroskopfoskop med fokus under mønsterprocessen. Multifotonmikroskopet anvender en pulslaser, der effektivt nedbryder PVA med høj effekt i et smalt brændplan, hvilket gør mønsterprocessen følsom over for ujævnheder eller hældninger i prøven. Som følge heraf er det vigtigt at identificere det nøjagtige brændplan i hver FOV. Dette er endnu mere problematisk for systemer, der mangler et perfekt fokusmodul, da afvigelser så lidt som en til to mikron kan gøre mønsterprocessen frugtesløs. For at løse dette problem mønstrer det tilpassede makroscript først en lille firkant i midten af hver ny FOV, der kun behøver at være nogenlunde i fokus ved at scanne gennem en relativt tyk Z-stak (≈20 μm). Mikroskopet scanner derefter hurtigt gennem stakken af billeder og bruger NIS Elements autofokusfunktion til at identificere det optimale brændplan. Mønstermasken indlæses derefter og indstilles som stimulerings-ROI, så der kan forekomme IR-stimulering. Scenen går efterfølgende videre til den næste FOV og gentager denne proces. Derudover sikrede den firkantede bølgeformede sti af mikroskopstadiets bevægelse minimal fejlakkumulering mellem sekventielle FOV'er. Ved at bruge denne protokol fremstiller vi rutinemæssigt mønstre bestående af 49 mikroskop FOV'er, der dækker 3,5 x 3,5 mm område af coverlipet på mindre end 3 timer.

For at teste, om mønstrede områder, ikke uforstyrret PVA, kunne adsorbere ECM-proteiner, belagt vi mønstrede coverslips med 10 μg/mL FN og farvede dem med anti-FN antistof. Ved hjælp af bred felt fluorescerende mikroskopi, fandt vi, at FN ensartet adsorberet til de mønstrede områder, hvor PVA var blevet fjernet ved laser ablation (Figur 2E).

For at afgøre, om cytoskeleton arkitektur og spænding distribution kunne ændres som forventet på de mønstre, vi seedet celler på mønstrede coverslips og visualiseret fordelingen af myosin lyskæde, en markør for kontraktilitet, gennem fluorescens mikroskopi. Efter den første såning, gradvist celler gravitated mod coverslip. Dem, der landede på mønstrede områder fastgjort og spredt i form af mønsteret over tid. Dem, der landede på PVA kun løst fastgjort og blev fjernet efter flere vaske og medier ændringer. Vi fandt, at cellerne spredes på mønstre vises fænotypiske fibroblast strukturer, herunder en actin-tæt kant af lamellipodia, tykke ventral stress fibre langs de to sider, og dorsale stress fibre stammer fra lamellipodia forbundet med tværgående buer(Figur 3A). Myosin lyskæde (MLC) sad bag den tætte lamellipodia fælg og viste en striated mønster langs actin bundter. Som det fremgår af gennemsnitlige billeder af mange celler, var denne fænotype konsistent på tværs af et stort antal mønstre (Figur 3B).

Figure 1
Figur 1. Skematisk over IR-laserassisteret mikromaling (mikrofotomaling). (A) Glasovertræk er kemisk konjugeret med APTMS, GA og PVA i den respektive rækkefølge. PVA-overfladen er ikke-klæbende til celler og proteiner. (B) PVA fjernes i forudindstillede mønstre af en IR-laser. (C) Mønstrede coverlips er belagt med et ECM-protein, der kun adsorberes til mønstrede områder. (D) Cellerne er belagt med overtræksplader, faste og immunostained for proteiner af interesse. Celler, der lander på mønstrede øer, spredes i form af det mønster, der giver anledning til karakteristiske cytoskeletale strukturer, mens de, der lander på PVA, forbliver sfæriske. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Mikropatternvalidering og karakterisering. (A) Opsætning af IR-laserassisteret mikromaling (mikrofotomaling) på et mikroskopstadium. IR-laseren brænder termisk for PVA i flere FOV'er. (B) Et billede af mikropatterner med tydelige papholdere og identiske med ROI-maskerne. (C) Et reflektionsmikroskopibillede af ufuldstændig fjernelse af PVA som følge af suboptimal lasereffekt. (D) Et reflektionsmikroskopibillede af PVA, der bobler som følge af overskydende lasereffekt. (E) Immunfluorescensbilleder af FN-belagte mønstrede coverlips med anti-FN primære antistoffer og fluorophorekonjugerede sekundære antistoffer. (F) En AFM-topologiscanningslinje og et repræsentativt AFM-billede af et armbrøstmønster. For at måle mikropatternens topologi blev kontakttilstandsbilleddannelse udført ved hjælp af en Bruker AFM-sonde (MLCT-B) monteret på et NanoWizard 4 atomkraftmikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Repræsentative billeder af celler belagt på mikropatterns. (A) Repræsentative billeder af en primær human gingival fibroblast belagt med armbrøst mønstre immunostained for actin og MLC. Billeder blev erhvervet med et konfokalt mikroskop udstyret med et 100x mål. (B) Gennemsnitlige immunfluorescens billeder af actin og MLC i celler belagt på armbrøst mønstre genereret af en brugerdefineret Python script. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Resultaterne ovenfor viser, at den beskrevne IR laser assisteret micropatterning (microphotopatterning) protokol giver reproducerbare vedhængende mønstre af forskellige former, der muliggør manipulation af celleform og cytoskeletal arkitektur. Selv om der er udviklet adskillige mikromalingsmetoder både før og efter debuten af mikrofotomaling, har denne metode flere fordele. For det første kræver det ikke specialiseret udstyr og renrum, der normalt kun findes inden for ingeniørafdelinger. Faktisk, som multiphoton mikroskoper bliver et mere almindeligt syn i Biologi afdelinger, mikrofotomaling udvider anvendelsen af multiphoton mikroskop og tilføjer til den potentielle pulje af brugere. Mønstre kan også ændres efter behov og udskrives med det samme, i stedet for at skulle fremstille en ny master wafer, der indebærer en langvarig litografi proces.

Sammenlignet med den allerede eksisterende mikrofotomalingsprotokol er en forbedring i vores protokol elimineringen af flere tidskrævende hærdningstrin under coverlip-forberedelse. Vi viser, at kvaliteten af PVA-coverslip vedhæftet fil forbliver uforstyrret, da mønstrene stadig var intakte og kunne binde celler selv to uger efter fabrikationen. Endnu vigtigere er det, at vi forbedrede automatiseringen af mønsterprocessen ved at eliminere behovet for at forudindstille placeringen af hver FOV24. I stedet implementerer vi en forståelig makro, der tillader mønster af et stort område, samtidig med at vi præcist identificerer det optimale brændplan for hver FOV.

Selvom makroerne i protokollen muliggør automatisering af mønstre på vores system, forstår vi, at ethvert kommercielt laserscanningsmikroskop leveres med deres egen proprietære software, der sjældent er kompatibel med andre, hvilket gør det vanskeligt at implementere vores nøjagtige protokol på andre systemer. Den overordnede arbejdsgang kan dog tilpasses andre kommercielle systemer for at lette automatiseret mikromaling, nemlig processen med at fokusere på hver enkelt FOV, indlæse masken, ablating PVA og flytte mikroskopstadiet til en ny FOV.

Der bør gennemføres flere trin i mønsterprotokollen med stor omhu for at sikre et effektivt mønster. Det mest kritiske trin er at optimere stimuleringsbetingelserne, før der genereres mønstre. I multifotonmikroskopi skal to eller flere fotoner ankomme næsten samtidigt til et fluorescerende molekyle og kombinere deres energi for at ophidse fluorescens. Denne hændelse med lav sandsynlighed opretter en ekstremt tynd optisk sektion, der øger signal-til-støj-forholdet28. Selvom denne funktion er gavnlig for billedbehandling, gør den fjernelsen af den tynde PVA-belægning ekstremt følsom over for prøvens Z-position. Der kan gennemføres flere foranstaltninger for at imødegå dette. For det første skal lasereffekten finjusteres for at sikre grundig fjernelse af PVA uden at "koge" polymeren eller beskadige glasovertrækdet. Hvis PVA-fjernelse konsekvent er ufuldstændig, anbefaler vi, at du kontrollerer laserjusteringen, da dette normalt øger lasereffekten. For det andet bør mikroskopfasen udjævnes for at undgå prøvehældning, hvilket kan resultere i ufuldstændige mønstre. IR-stimuleringer i flere Z-positioner bør også sættes op for at sikre, at PVA-laget er målrettet. Alternativt, hvis mikroskopet er udstyret med et perfekt fokusmodul, kan der udføres indledende tests for at bestemme den optimale forskydning i Z-position for PVA-målretning. Et andet kritisk skridt er at oprette en mikroskopmakro, der tillader mønsterstimulation på en automatiseret måde. Makroen skal finde brændplanet for hver ny FOV for at undgå komplikationer fra prøvehældning eller ujævnheder på overfladen. Det bør også gøre det muligt for scenen at bevæge sig i en S-form fra række til række, svarende til den sti, der er taget i tovejsscanning, for at minimere afvigelser i Z mellem fortløbende FOV'er.

En begrænsning af den beskrevne protokol er den tid , det tager at producere et stort antal mønstrede coverslips , en enestående fordel, der tilbydes af litografibaseret mikrokontaktudskrivning29,30. Som følge heraf er denne protokol bedst egnet til eksperimenter, hvor der kræves et begrænset antal betingelser, eller dem, der kræver let tilgængelige justeringer i mønsterform og -størrelse. For systemer, der mangler et hardware autofokusmodul, integrerer vi desuden en række stimuleringshændelser i forskellige Z-fly for at sikre automatiseret og effektiv PVA-fjernelse. Da IR-stimulering er det mest tidskrævende trin, forlænger tilføjelsen af hver stimuleringshændelse (~30 sek.) mønsterprocessen betydeligt. Hvis tiden giver anledning til bekymring, foreslår vi finjustering autofokus ved at reducere trin størrelse. Dette letter identifikationen af det bedste brændplan, hvilket vil reducere antallet af IR-stimuleringshændelser, der kræves. I vores eksperimenter reducerer reduktionen af antallet af stimuleringshændelser fra fem til to tiden med halvdelen (1,5 timer).

Afslutningsvis kan den IR laserassisteret mikromaling (mikrofotomaling) protokol, vi beskriver, bruges i ethvert laboratorium, der har adgang til et IR laserudstyret mikroskop. Ud over at studere cytoskeletal arkitektur og signaleringsveje, der forbinder form til funktion, kan denne teknik også anvendes til lægemiddelscreening og andre applikationer, der er følsomme over for celle-til-celle-variabilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne afslører ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Connaught Fund New Investigator Award til S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (tilskud RGPIN-2015-05114 og RGPIN-2020-05881), University of Manchester og University of Toronto Joint Research Fund og University of Toronto XSeed Program. C.T. blev støttet af NSERC USRA stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane Aldrich 281778
10 cm Cell Culture Dish VWR 10062-880 Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective Nikon MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish VWR 10861-586 Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Thermo 62248 1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin BioShop ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Wisent 311-425-CL
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
Fibronectin Sigma-Aldrich FC010 1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody BD 610077 Mouse
Fiji ImageJ Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin Invitrogen A12380 568nm
Glass Coverslip VWR 16004-302 22 × 22 mm
Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16220 25% aqueous solution
Hydrochloric Acid Caledon 6025-1-29 37% aqueous solution
IR Laser Coherent Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α Gibco 12561-056
Mounting Medium Sigma F4680
Mouse Secondary Antibody Cell Signaling Technology 4408S Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope Nikon A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody Cell Signaling Technology 3672S Rabbit
NIS Elements Nikon Version 5.21.03
Nitric Acid Caledon 7525-1-29 70% aqueous solution
Photoshop Adobe Version 21.2.1
Pluronic F-127 Sigma P2443 Powder
Poly(vinyl alchohol) Aldrich 341584 MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody Cell Signaling Technology 4412S Goat, 488nm
Shaker VWR 10127-876 Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride Aldrich 452882 Powder
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium Phosphate Dibasic Sigma S5136 Powder
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S5011 Powder
Spyder Anaconda 4.1.4
Trypsin Wisent 325-042-CL 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
  2. Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
  3. Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
  4. Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
  5. Paluch, E., Heisenberg, C. -P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
  6. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
  9. Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
  10. Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
  11. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  12. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  13. Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
  14. Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
  15. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
  16. Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
  17. Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
  18. Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
  19. Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
  20. Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
  21. Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
  22. Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
  23. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
  24. Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
  25. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/Organelle Motility Assays. Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).
  26. Inoué, S., Spring, K. R. Video Microscopy: The Fundamentals. , Springer. US. (1997).
  27. Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
  28. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  29. Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
  30. Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0-14 (2013).

Tags

Bioengineering udgave 173
Kontrol af cellegeometri gennem infrarød laserassisteret mikromaling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, S., Tuo, C., Iu, E.,… More

Yang, S., Tuo, C., Iu, E., Plotnikov, S. V. Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning. J. Vis. Exp. (173), e62492, doi:10.3791/62492 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter