Summary
Le protocole présenté ici permet la fabrication automatisée de micropatterns qui normalisent la forme des cellules pour étudier les structures cytosquelettiques dans les cellules de mammifères. Cette technique conviviale peut être mise en place avec des systèmes d’imagerie disponibles dans le commerce et ne nécessite pas d’équipement spécialisé inaccessible aux laboratoires de biologie cellulaire standard.
Abstract
Le micropatterning est une technique établie dans la communauté de la biologie cellulaire utilisée pour étudier les liens entre la morphologie et la fonction des compartiments cellulaires tout en contournant les complications découlant des variations naturelles de cellule à cellule. Pour normaliser la forme des cellules, les cellules sont soit confinées dans des moules 3D, soit contrôlées pour la géométrie adhésive à travers des îlots adhésifs. Cependant, les techniques traditionnelles de micropatternage basées sur la photolithographie et la gravure uv profonde dépendent fortement des salles blanches ou de l’équipement spécialisé. Nous présentons ici une technique de micropatterning assistée par laser infrarouge (microphotopatterning) modifiée à partir de Doyle et al. qui peut être facilement configurée avec des systèmes d’imagerie disponibles dans le commerce. Dans ce protocole, nous utilisons un système d’imagerie Nikon A1R MP+ pour générer des micropatterns avec une précision de micron grâce à un laser infrarouge (IR) qui abrexage les régions prédéfinies sur des lamules recouvertes d’alcool poly vinylique. Nous utilisons un script personnalisé pour permettre la fabrication automatisée de motifs avec une efficacité et une précision élevées dans les systèmes non équipés d’une mise au point automatique matérielle. Nous montrons que ce protocole de micropatterning assisté par laser IR (microphotopatterning) se traduit par des motifs définis auxquels les cellules se fixent exclusivement et prennent la forme souhaitée. En outre, les données d’un grand nombre de cellules peuvent être moyennales en raison de la normalisation de la forme des cellules. Les modèles générés avec ce protocole, combinés à l’imagerie haute résolution et à l’analyse quantitative, peuvent être utilisés pour des écrans à débit relativement élevé afin d’identifier les lecteurs moléculaires médiant le lien entre la forme et la fonction.
Introduction
La forme cellulaire est un déterminant clé des processus biologiques fondamentaux tels que la morphogenèse tissulaire1,la migration cellulaire2,la prolifération cellulaire3et l’expressiongénique 4. Les changements de forme cellulaire sont entraînés par un équilibre complexe entre les réarrangements dynamiques du cytosquelette qui déforme la membrane plasmique et les facteurs extrinsèques tels que les forces externes exercées sur la cellule et la géométrie des adhérences cellule-cellule et cellule-matrice5. Les cellules mésenchymateuses migratrices, par exemple, polymérisent un réseau dense d’actine au bord d’attaque qui pousse la membrane plasmique vers l’avant et crée une large lamellipodie6,tandis que la contractilité de l’actomyosine rétracte le bord de fuite étroit de la cellule pour détacher la cellule de sa position actuelle7,8. Perturber les événements de signalisation qui donnent lieu à de telles structures cytosquelettiques spécialisées perturbe la forme et la polarité et ralentit la migration cellulaire9. En outre, la flexion de la feuille épithéliale pendant la gastrulation nécessite une constriction apicale à base d’actomyosine qui provoque la flexion des cellules et de leurs voisins en forme de coin10. Bien que ces études soulignent l’importance de la forme cellulaire, l’hétérogénéité inhérente à la forme cellulaire a entravé les efforts visant à identifier les mécanismes qui relient la morphologie à la fonction.
À cette fin, de nombreuses approches pour manipuler la forme des cellules ont été développées au cours des trois dernières décennies. Ces approches atteignent leur objectif soit en contraignant la cellule avec un moule tridimensionnel, soit en contrôlant la géométrie d’adhésion cellulaire par dépôt à motifs de protéines de matrice extracellulaire (ECM) sur une surface antisalissure, une technique appelée micropatterning11. Ici, nous allons passer en revue un certain nombre de techniques qui ont gagné en popularité au fil des ans.
À l’origine pionnière en tant qu’approche pour les applications microélectroniques, l’impression par microcontact à base de lithographie douce est devenue sans équivoque un favori culte12. Une plaquette maîtresse est d’abord fabriquée en exposant sélectivement des zones d’un substrat de silicium revêtu de photorésine à la photoirradiation, laissant derrière elle une surface à motifs13. Un élastomère, tel que PDMS, est ensuite versé sur la plaquette maîtresse pour générer un « tampon » doux qui transfère les protéines ECM vers un substrat désiré11,14. Une fois fabriquée, une plaquette maîtresse peut être utilisée pour couler de nombreux timbres PDMS qui donnent lieu à des micropatterns hautement reproductibles12. Cependant, les motifs ne peuvent pas être facilement ajustés en raison du long processus de photolithographie. Ce processus nécessite également un équipement hautement spécialisé et des salles blanches qui ne sont généralement pas disponibles dans les départements de biologie.
Plus récemment, il a été rapporté que l’impression directe à l’aide d’UV profonds contournait les limitations posées par les approches traditionnelles basées sur la lithographie. La lumière UV profonde est dirigée à travers un photomasque vers des zones sélectives d’une lamelle de verre recouverte de poly-L-lysine-greffé-polyéthylène glycol. Les groupes chimiques exposés aux UV profonds sont photoconvertis sans l’utilisation de linkers photosensibles pour permettre la liaison des protéines ECM15. L’absence de linkers photosensibles permet aux lamisses à motifs de rester stables à température ambiante pendant plus de sept mois15. Cette méthode évite l’utilisation de salles blanches et d’équipement de photolithographie et nécessite une formation moins spécialisée. Cependant, l’exigence de photomasques pose toujours un obstacle important pour les expériences qui nécessitent des changements facilement disponibles dans les modèles.
En plus des méthodes qui manipulent la géométrie cellulaire par le dépôt contrôlé de protéines ECM sur une surface 2D, d’autres cherchent à contrôler la forme des cellules en enfermant les cellules dans des microstructures 3D. De nombreuses études ont adapté l’approche basée sur la lithographie douce décrite ci-dessus pour générer des chambres PDMS 3D, plutôt que 2D, afin d’étudier les processus biologiques dépendant de la forme chez les embryons, les bactéries, les levures et les plantes16,17,18,19. La polymérisation à deux photons (2PP) a également pris les devants en tant que technique de microfabrication qui peut créer des échafaudages d’hydrogel 3D complexes avec une résolution nanométriquede 20. 2PP s’appuie sur les principes de l’adsorption à deux photons, où deux photons délivrés en impulsions femtosecondes sont absorbés simultanément par une molécule - photoinitiateur dans ce cas - qui permet la polymérisation locale des photopolymères21. Cette technique a été fortement utilisée pour imprimer des échafaudages 3D qui imitent les structures ECM natives du tissu humain et a été montré pour induire de faibles dommages photochimiques aux cellules22.
Les débuts du microphotopatterning il y a 10 ans ont donné aux chercheurs l’occasion de fabriquer des micropatterns tout en évitant les équipements inaccessibles et spécialisés. Le microphotopatterning crée des motifs à l’échelle du micron en éliminant thermiquement les régions sélectives d’alcool poly-vinylique (PVA) recouvertes de surfaces en verre activées à l’aide d’un laser infrarouge23,24. Les protéines ECM qui ne fixent que la surface du verre sous-jacent et non le PVA servent alors de repères biochimiques pour permettre une dynamique de propagation contrôlée et la forme des cellules. Cette méthode offre également une flexibilité supérieure car les modèles peuvent être facilement modifiés en temps réel. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape de microphotopatterning en utilisant un système d’imagerie multi-photons commercial. Le protocole décrit est conçu pour la fabrication rapide et automatisée de grands motifs. Nous avons démontré que ces modèles contrôlent efficacement la forme des cellules en limitant la géométrie des adhérences cellule-ECM. En conclusion, nous démontrons que la technique de modelage décrite module l’organisation et la dynamique du cytosquelette d’actine.
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Protocol
1. Prétraitement de coverslip
- Préparer des lamelle de couverture propre et grinçante comme décrit dans Waterman-Storer, 199825.
- Préparer la solution à 1% de (3-aminopropyl)triméthoxysilane (APTMS) et incuber les lamaux dans la solution pendant 10 min avec une agitation douce. Assurez-vous que les lamelle se déplacent librement dans la solution.
- Laver les lamelle deux fois avec dH2O pendant 5 min chacune.
- Préparer une solution de glutaraldéhyde (GA) à 0,5 % et incuber les lamaux de couverture dans la solution pendant 30 min sur un agitateur. Pour 25 lamaux de couverture, utilisez 50 mL de solution de glutaraldéhyde. Assurez-vous que les lamelle se déplacent librement dans la solution.
- Laver les lamaux trois fois avec dH2O pendant 10 min chacun.
- Faites tourner des lamisses sèches pendant 30 s à l’aide d’une fileuse à lattes de couverture sur mesure. Une description détaillée de la toupie de la lamelle a été publiée26 et est disponible en ligne (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Les lamures de couverture activées peuvent être conservées jusqu’à un mois à +4 °C dans une boîte avec des diviseurs afin qu’elles se distinguent les unes des autres.
2. Revêtement PVA
- Mélanger PVA (98% PVA hydrolysé, MW 98000) avec dH2O pour faire une solution à 5,6%.
- Solubilisez le mélange dans un bain-marie à 90 °C et filtrez immédiatement à travers un filtre de 0,2 μm dans une armoire de biosécurité à chaud. Filtrez à nouveau la solution mère si elle précipite. La solution de PVA peut être conservée à température ambiante pendant 3 mois.
- Dans un tube de 15 mL, ajouter une partie HCl à huit parties PVA. Inversez soigneusement le tube quelques fois pour mélanger.
- Versez 2 mL de la solution mélangée dans une boîte de Petri de 35 mm et plongez une lamelle de couverture propre et prétraitée dans le liquide, en prenant soin que les lamelle de couverture ne collent pas au fond. Incuber à température ambiante pendant 5 min sur un agitateur.
- Retirez soigneusement les lamaux de couverture de la solution. Utilisez la fileuse de lamelle de couverture pour faire tourner la couche pendant 40 s. En attendant, nettoyez la pince à épiler. Transférer la lamelle dans une boîte et sécher à +4 °C pendant la nuit. Les lamelle recouvertes de PVA peuvent être conservées à +4 °C jusqu’à deux semaines.
3. Configuration du microscope multiphotonique
REMARQUE: Le protocole décrit est réglé pour créer des micropatterns adhésifs cellulaires de la forme et de la taille souhaitées sur les systèmes d’imagerie multi-photons droits ou inversés, en particulier ceux qui ne sont pas équipés d’une mise au point automatique matérielle. Ainsi, pour chaque champ de vision (FOV), le script de motif abrége une petite zone pour créer un marqueur fiduciaire sur la lame de couverture, utilise une mise au point automatique logicielle pour concentrer le microscope sur la surface de la lame de couverture et alate le motif souhaité. L’exécution de ce script dans une boucle pour les FOVs adjacents crée de manière robuste un large éventail de micropatterns (5 x 5 mm ou plus) qui contraignent la forme des cellules et modulent l’activité des processus biologiques intracellulaires. Le protocole décrit a été développé pour le système d’imagerie Nikon A1R MP+ contrôlé par le logiciel NIS-Elements. Si un système d’imagerie d’un autre fournisseur est utilisé pour la répétition, les configurations optiques et le script de modelage doivent être ajustés conformément aux instructions du fabricant.
- Allumez le logiciel du microscope. Assurez-vous que l’objectif « Apo LWD 25X/1.10W DIC N2 » est monté sur le microscope.
REMARQUE: Le protocole décrit ici est optimisé pour un objectif d’immersion dans l’eau 25x / 1,1 NA, mais d’autres objectifs peuvent également être utilisés pour le modelage. Les lecteurs doivent être conscients que le tapotement avec un objectif à fort grossissement(par exemple,40x et 60x) prend plus de temps car il diminue considérablement le nombre de motifs ablés dans chaque champ de vision. Les objectifs à faible grossissement peuvent être utilisés pour le modelage tant qu’ils fournissent un éclairage uniforme à travers le champ de vision et une puissance laser suffisante pour abréger la couche PVA. - Dans la fenêtre graphique A1plus MP, définissez la ligne laser sur 750 nm.
- Configuration de la configuration optique « Image »
REMARQUE: NIS-Elements fournit aux utilisateurs plusieurs outils (interface graphique, un générateur de flux de travail d’acquisition JOBS, configurations optiques et macros) pour contrôler le matériel du microscope. Dans ce protocole, la plupart du contrôle matériel est réalisé grâce à diverses configurations optiques ainsi qu’à des modules d’acquisition ND et de stimulation ND.- Dans l’onglet Étalonnage, cliquez sur Nouvelle configuration optique. Nommez la configuration optique « Image ». Il s’agit de la configuration optique de base qui permet l’imagerie de la lamelle de couverture par réflectance. Laissez toutes les autres options par défaut et sélectionnez l’objectif approprié.
- Dans la fenêtre gui d’A1plus MP, cliquez sur en fonction le bouton de configurations pour configurer les configurations matérielles sous cette configuration optique. Réglez le laser de stimulation sur IR stim, placez le séparateur de faisceau (BS 20/80) dans le chemin de la lumière, réglez l’unité de scanner sur Galvano et sélectionnez le détecteur descanned approprié.
- Dans la fenêtre de l’interface graphique A1plus Compact, sélectionnez une taille de numérisation et un temps d’arrêt suffisants pour capturer de petites fonctionnalités sur la lame de couverture (1,1 ms et 1024 pixels sur notre système, respectivement). Cliquez sur le bouton Normal pour qu’aucune moyenne de ligne ou intégration de ligne ne soit effectuée. Assurez-vous que la case Utiliser le laser IR est cochée. Configurez la numérisation unidirectionnelle pour plus de simplicité.
Remarque : Si la vitesse d’analyse est préoccupante, l’analyse bidirectionnelle peut être utilisée. - Dans la même fenêtre, ajustez la puissance laser et la sensibilité du détecteur pour obtenir une image lumineuse mais non saturée de la surface de la lame de couverture. Régler la puissance laser à 3 - 5% de la puissance maximale et la sensibilité du détecteur (curseur « HV ») à 15 V est un bon point de départ.
- Dans la fenêtre Zone de balayage A1plus, définissez Zoom sur 1 pour capturer l’intégralité du fichier FOV.
- Enregistrez la configuration optique.
- Configuration de la configuration optique « Print_Fudiciary_Marker »
- Dupliquez la configuration optique « Image » et renommez-la « Print_Fudiciary_Marker ».
- Dans la fenêtre de l’interface graphique A1plus Compact, sélectionnez la plus petite taille de numérisation et le temps d’arrêt (64 pixels et 80,2 ms sur notre système, respectivement).
- Étant donné qu’aucune imagerie n’est requise dans cette étape, réglez la sensibilité du détecteur sur 0 et augmentez la puissance du laser à 30%. Une puissance laser plus élevée éliminera thermiquement la couche PVA sur la lamelle de couverture dans les régions souhaitées.
- Dans la fenêtre Zone de balayage A1plus, réglez Zoom au maximum (15,87 pour notre système) et placez la zone de balayage au milieu du champ de vision.
- Dans la fenêtre Acquisition ND, configurez une expérience de pile Z. Définissez le mouvement en position Z sur Relatif et sélectionnez le périphérique Z approprié. Réglez la taille de l’étape à 2 μm et la profondeur de la cheminée à 10 μm au-dessus et au-dessous pour tenir compte de toute inégalité dans l’étape du microscope ou la surface de l’AVP entre les FOVs adjacents.
- Configuration de la configuration optique « Autofocus »
- Dupliquez la configuration optique « Image » et renommez-la « Autofocus ».
- Dans la fenêtre Zone de balayage A1plus, diminuez le facteur de zoom afin que le FOV soit légèrement plus grand que le marqueur fiduciaire. Cela garantit que d’autres petites fonctionnalités sur la lamelle de couverture n’interféreront pas avec la mise au point automatique.
- Dans le menu Appareils, sélectionnez Configuration de l’autofocus. Définissez l’épaisseur de balayage sur celle de la pile Z dans l’expérience de pile Z (voir l’étape 3.5.5). Le microscope balaiera cette plage et trouvera le meilleur plan focal à l’aide du marqueur fiduciaire. Laissez la taille de l’étape par défaut.
- Configuration de la configuration optique « Load_ROI »
- Dupliquez la configuration optique « Image » et renommez-la « Load_ROI ».
- Dans la fenêtre de l’interface graphique A1plus Compact, définissez une taille d’analyse identique à celle du masque de retour sur investissement. Cette configuration optique sera utilisée pour capturer une image sur laquelle le masque roi sera chargé. Nous avons utilisé 2048 pixels pour atteindre un équilibre optimal entre la résolution et la vitesse.
REMARQUE: Il est essentiel que cette image capturée soit identique en taille au masque de retour sur investissement.
- Mise en place de la configuration optique « Micropattern »
- Dupliquez la configuration optique « Print_Fiduciary_Marker » et renommez-la « Micropattern ».
- Définissez le facteur zoom sur un.
- Dans la fenêtre graphique A1plus MP, augmentez la puissance du laser de stimulation pour abréger le PVA et sélectionnez une vitesse de balayage appropriée (40% et 32 s / trame dans nos expériences, respectivement).
- Dans la fenêtre Stimulation ND, configurez une expérience de stimulation ND. Ajoutez quelques phases à la planification temporelle et définissez chacune comme stimulation. Assurez-vous que la zone de stimulation et la durée sont correctes.
REMARQUE: Le nombre de phases peut être ajusté en fonction de l’épaisseur et de la douceur de la couche PVA ainsi que de la puissance laser utilisée dans cette configuration optique. - Dans la même fenêtre, activez la fonction StgMoveMainZ(-1.000,1) avant chaque phase. Cela tient compte à nouveau de tous les écarts dans la direction Z.
REMARQUE: La distance et la direction dans laquelle l’objectif se déplace peuvent être ajustées en fonction de l’épaisseur et de la douceur de la couche PVA.
- Configuration de la configuration optique « Label_Surface »
- Dupliquez la configuration optique « Print_Fudiciary_Marker » et renommez-la « Label_Surface ».
- Dans la fenêtre de l’interface graphique A1plus Compact, augmentez considérablement la puissance du laser et réglez Zoom sur un. Une puissance laser élevée utilisée ici endommagera physiquement la lamelle de couverture en verre et produira une étiquette visible à l’œil nu. Cela aide à localiser les modèles dans d’autres expériences.
4. Génération du masque de retour sur investissement et configuration de la macro
- Génération du masque de retour sur investissement
- Utilisez Adobe Photoshop ou un autre logiciel disponible pour générer une image RVB 2048 × 2048. L’image correspond à un champ de vision au microscope(c.-à-d. 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm par pixel). L’image doit avoir un arrière-plan noir (0, 0, 0).
REMARQUE: Un certain nombre d’éditeurs d’images commerciaux et gratuits peuvent être utilisés pour générer des masques de retour sur investissement pour le micropatterning assisté par laser. Bien que nous utilisions Adobe Photoshop pour générer les masques, GIMP et ImageJ / Fiji sont également disponibles en tant qu’options gratuites alternatives. - Dessinez 8 - 12 motifs blancs (255 255 255) sur fond noir. La taille du motif varie en fonction du type de cellule (~200 pixels de diamètre). Laissez une zone vide de 500 × 500 au centre de l’image pour la mise au point automatique. Laissez suffisamment d’espace entre les motifs adjacents (>200 pixels) et à la frontière du champ de vision pour une ablation et une fixation cellulaire optimales. Les modèles présentés dans ce protocole sont disponibles sur Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
- Utilisez Adobe Photoshop ou un autre logiciel disponible pour générer une image RVB 2048 × 2048. L’image correspond à un champ de vision au microscope(c.-à-d. 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm par pixel). L’image doit avoir un arrière-plan noir (0, 0, 0).
- Configuration de la macro
- Cliquez sur le menu Macro et sélectionnez Nouvelle macro.
- Importez le code « Pattern_Stimulation » disponible sur Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) dans la fenêtre Nouvelle macro. Enregistrez ce morceau de code dans un dossier approprié.
- Ouvrez une autre fenêtre Nouvelle macro et importez le code « Stage_Movement » disponible sur Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Assurez-vous que le répertoire de travail «Stage_Movement» dans ce code est identique à celui de l’étape 4.2.2. Enregistrez le code «Stage_Movement» dans le même dossier à l’étape 4.2.2.
5. Génération de micropatterns à l’aide de la photo-ablation
- Allumez le microscope et ses accessoires. Assurez-vous que le laser IR s’est suffisamment réchauffé avant cela.
- Transférer la lamelle recouverte de PVA sur un support. Pour un microscope vertical, assurez-vous que la surface de PVA doit être ablée face vers le bas.
- Ajoutez de l’eau aux coins pour stabiliser la lame de couverture et montez le support sur l’étage du microscope.
- Abaissez l’objectif et ajoutez de l’eau sur la lamelle de couverture.
REMARQUE: Le protocole décrit ici est optimisé pour un objectif d’immersion dans l’eau 25x / 1,1 NA. Si un objectif d’immersion sèche ou à l’huile est utilisé, l’eau doit être remplacée par un milieu d’immersion approprié. Lorsqu’un objectif d’immersion dans l’eau est utilisé pour générer un grand réseau de micropatterns, l’évaporation peut devenir un problème. Si tel est le cas, l’eau doit être remplacée par GenTeal, un lubrifiant pour les yeux en vente libre disponible dans les pharmacies. - Dans le logiciel du microscope, allumez l’obturateur laser IR dans la fenêtre graphique A1plus MP. Cliquez sur le bouton Autoalignement pour aligner le laser avant le motif.
REMARQUE: Il est crucial d’effectuer l’auto-alignement laser au début de chaque session de modelage car de petites déviations dans le chemin laser affecteront de manière significative la qualité des motifs. - Passez à la configuration optique « Image ». Dans la fenêtre de l’interface graphique A1plus Compact, cliquez sur Numériser pour analyser le fichier FOV tout en rapprochant lentement l’objectif de la lamelle de couverture.
- Surveillez attentivement l’image. Au début, l’image apparaîtra extrêmement sombre. Rapprochez l’objectif de la lamelle jusqu’à ce que la luminosité de l’image augmente. Il s’agit de la surface de lamelle qui fait face à l’objectif. Continuez à déplacer l’objectif jusqu’à ce que la luminosité diminue et augmente à nouveau. Il s’agit de la surface PVA à modeler. Concentrez-vous sur n’importe quelle petite caractéristique (imperfections de la lamelle, poussière, etc.)sur cette surface et réglez zéro sur le lecteur Z. Toujours mettre zéro après la mise au point.
REMARQUE: Bien que les deux surfaces de la lamelle de couverture soient recouvertes de PVA, les propriétés optiques du verre ne sont pas modifiées de manière significative par le revêtement PVA. Nous élicanions régulièrement de telles lamelle avec des objectifs secs, d’immersion dans l’eau et dans l’huile et nous n’avons pas trouvé la surface non modelée de PVA pour interférer avec l’imagerie. - Passez à la configuration optique « Label_Surface ». Cliquez sur Capturer. Revenez à la configuration optique « imagerie » et au balayage. La surface du verre doit être endommagée et sembler amorphe. La zone endommagée est visible à l’œil nu, indiquant l’emplacement des motifs dans d’autres expériences.
Remarque : Pour augmenter la taille de l’étiquette visible, répétez l’étape 5.8 dans plusieurs FOVs adjacents. - Vérifiez à nouveau que l’objectif est à peu près au centre de la lamelle. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’eau entre l’objectif et la lamelle. Déplacez l’étape de 1 à 2 FOVs pour éviter les particules de verre et scannez pour confirmer.
- Dans le menu Périphériques, ouvrez la macro Stage_Movement. Vérifiez que le répertoire de travail Pattern_Stimulation est correct ; sinon, la stimulation ne se produira pas. Définissez les variables « PatternLength » et « PatternHeight » sur le nombre souhaité de FOVs qui seront modelés. Enregistrez et exécutez la macro.
- Une fois le patterning terminé, passez à la configuration optique « Imaging ». Encore une fois, vérifiez que l’obturateur laser IR est ouvert dans la fenêtre graphique A1plus MP.
- Déplacez la scène pour afficher les motifs. Parcourez les motifs pour vérifier leur qualité.
- Transférez la lamelle sur la boîte de grille, avec des motifs orientés vers le haut.
- Conserver les lamaux à motifs à +4 °C jusqu’à une semaine avant utilisation.
6. Adsorption de la fibronectine
- Faire frais 1 M NaBH4 dans une solution de NaOH 1 M. Ajouter à un rapport de 1:100 par rapport au tampon phosphate de pH 8,0 contenant de l’éthanolamine de 0,2 M.
- Transférer les lamaux à motifs dans un plat de culture de tissu de 35 mm. Incuber chaque lamelle avec 1 mL de la solution ci-dessus pendant 8 min pour éteindre l’autofluorescence, puis rincer 3 fois avec du PBS.
- Diluer la fibronectine (FN) dans le PBS jusqu’à une concentration finale de 10 μg/mL. Incuber la lamelle dans FN pendant 1 h à +37 °C.
REMARQUE: Si une liaison non spécifique substantielle de la protéine ECM au substrat est observée, fn peut être dilué dans pbs contenant 0,1% Pluronic F-12724. - Lavez la lamelle 2 fois avec du PBS. S’il n’est pas utilisé immédiatement, conserver dans un PBS à +4 °C pendant la nuit.
7. Attachement de cellule
REMARQUE: Le protocole suivant est optimisé pour les fibroblastes gingivaux humains primaires.
- Culture d’un plat de 10 cm de cellules à 70% de confluence.
- Réchauffer les milieux de culture cellulaire, le PBS et la trypsine à 0,05 % dans un bain-marie à +37 °C.
REMARQUE: Pour les cellules qui adhèrent faiblement au substrat, la dissociation non protéolytique avec le versène (EDTA de 0,48 mM) ou un tampon exclusif sans enzymes peut augmenter la fixation cellulaire aux motifs et doit être envisagée. - Avant d’ensemencer les cellules, déplacez la lamelle à motifs dans une boîte de culture tissulaire propre de 35 mm contenant 1 mL de PBS chaud.
- Aspirer le milieu de culture cellulaire à partir de la parabole de culture tissulaire de 10 cm et laver une fois avec du PBS.
- Ajouter 700 μL de trypsine/EDTA à 0,05 % dans la boîte et incuber les cellules dans un incubateur à +37 °C, 5 % deCO2 pendant 1 min.
- En attendant, aspirez le PBS couvrant la lamelle à motifs et ajoutez 1 mL de milieu de culture cellulaire.
- Vérifiez que les cellules se sont détachées. Puis ressusciter les cellules trypsinisées avec 10 mL de milieu de culture cellulaire et ajouter 1 mL à la lame de couverture à motifs.
- Cellules de culture dans l’incubateur pendant 2 - 3 h et vérifier si un nombre suffisant de cellules se sont attachées aux motifs. Si c’est le cas, modifiez le support une fois pour supprimer les cellules non attachées. Cela réduit le risque que plusieurs cellules atterrissent sur le même modèle.
Remarque : temps de pièce jointe peut varier selon le type de cellule. - Après encore 3-4 h, ou quand un nombre suffisant de cellules se sont propagées sur des modèles, les cellules sont prêtes pour d’autres expériences. N’attendez pas trop longtemps pour éviter la division cellulaire.
8. Acquisition de données
- Fixer les cellules avec 4% de PFA dans le tampon de cytosquelette27 pendant 10 min à température ambiante.
- Suivez les protocoles d’immunofluorescence établis pour les protéines d’intérêt. Les lamaux de couverture enduits de PVA fonctionnent bien avec n’importe quel protocole d’immunofluorescence.
- Acquérir des images de cellules à l’aide d’un microscope approprié. Selon l’objectif de l’expérience, imagez une ou plusieurs cellules par champ de vision.
9. Analyse d’image
REMARQUE: Le protocole suivant permet aux utilisateurs d’obtenir le signal de fluorescence moyen de la protéine d’intérêt sur un grand nombre de cellules à partir de piles Z d’images de microscope.
- Ouvrez les images acquises dans NIS Elements et recadrez les images. Assurez-vous que chaque image ne contient qu’une seule cellule bien répartie. Vous trouverez des instructions détaillées sur le traitement des images dans le script ci-dessous.
- Installez Anaconda et lancez Spyder via Anaconda Navigator.
Remarque : les scripts .py peuvent être exécutés dans n’importe quel environnement avec les packages appropriés identifiés dans les spécifications.txt. Nous recommandons Anaconda car il contient la plupart des packages requis pour les codes ci-dessous. - Téléchargez le script depuis Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) et ouvrez-le dans Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py" ou "Pattern_Averaging_4Channels.py " pourles images avec 3 canaux ou 4 canaux, respectivement).
- Définissez les paramètres en fonction des images acquises. Consultez le script pour obtenir des descriptions détaillées.
- Appuyez sur F5 pour exécuter le script. La progression peut être suivie dans le panneau Console.
- Récupérez les fichiers de sortie enregistrés dans le même dossier. Les images de sortie sont la moyenne de chaque canal pour tous les échantillons. La feuille Excel montre l’intensité moyenne de chaque canal dans une cellule d’échantillon, ce qui permet une analyse quantitative plus approfondie.
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Representative Results
La qualité des données expérimentales obtenues par micropatterning dépend en grande partie de la qualité des modèles. Pour déterminer la qualité des motifs générés avec la méthode ci-dessus, nous avons d’abord utilisé la microscopie à réflectance pour évaluer la forme et la taille des zones photo-ablées de la lame de couverture. Nous avons constaté que chaque motif individuel ressemblait beaucoup au masque d’ablation et présentait des pensionnaires clairs et une surface qui réfléchissait uniformément à la lumière(figure 2B). Une variété de formes et de tailles peuvent être imprimées en fonction de l’architecture de cytosquelette souhaitée, mais nous avons utilisé la forme d’arbalète qui convient le mieux à nos objectifs. La microscopie à force atomique (AFM) a révélé que de tels modèles étaient d’environ 140 nm de hauteur et avaient une surface lisse avec une variation topologique minimale tout au long(figure 2F). Les paramètres de modélisation sous-optimaux, tels qu’une faible puissance laser et un plan focal incorrect, ont entraîné une suppression incomplète de la surface PVA qui se manifeste par des motifs partiels plus sombres avec une topologie inégale(Figure 2C). Le réglage d’une puissance laser trop élevée a entraîné un « bouillonnement » de PVA et, lorsqu’il est extrême, des dommages à la surface de la lamelle qui sont également indésirables (Figure 2D).
Dans des expériences préliminaires, nous avons tenté d’augmenter la zone de modelage en réduisant plusieurs FOVs sur une seule lamelle de couverture. Nous avons constaté que cette approche, bien que fonctionne en principe, n’est pas fiable et fastidieuse en raison de la dérive en Z du support de microscope et de la légère inclinaison de la lame de couverture. Pour obtenir des modèles de haute qualité sur un grand nombre de FOVs de manière automatisée, nous avons mis en œuvre une macro personnalisée qui a amélioré la précision de la mise au point du microscope pendant le processus de modelage. Le microscope multiphotonique utilise un laser à impulsions qui dégrade efficacement le PVA avec une puissance élevée dans un plan focal étroit, ce qui rend le processus de modelage sensible à toute inégalité ou inclinaison dans l’échantillon. Par conséquent, il est important d’identifier le plan focal précis dans chaque champ de vision. Ceci est encore plus problématique pour les systèmes dépourvus d’un module de mise au point parfait, car des écarts aussi peu qu’un à deux microns peuvent rendre le processus de modelage infructuel. Pour résoudre ce problème, le script de macro personnalisé crée d’abord un petit carré au centre de chaque nouveau champ de vision qui doit uniquement être à peu près au point en balayant une pile Z relativement épaisse (≈20 μm). Le microscope balaye ensuite rapidement la pile d’images et utilise la fonction autofocus NIS Elements pour identifier le plan focal optimal. Le masque de motif est ensuite chargé et défini comme roi de stimulation pour que la stimulation IR se produise. L’étape passe ensuite au FOV suivant et répète ce processus. En outre, le chemin en forme d’onde carrée du mouvement de l’étage du microscope a assuré une accumulation minimale d’erreurs entre les FOVs séquentiels. En utilisant ce protocole, nous fabriquons par habitude des modèles composés de 49 FOVs de microscope couvrant 3.5 x 3.5 millimètres de la lame de couverture en moins de 3 h.
Pour tester si les zones à motifs, non non perturbées PVA, pouvaient adsorber les protéines ECM, nous avons enrobé des lamtiques à motifs avec 10 μg / mL FN et les avons colorées avec de l’anticorps anti-FN. En utilisant la microscopie fluorescente à large champ, nous avons constaté que fn uniformément adsorbé aux zones à motifs où PVA avait été enlevé par ablation laser (Figure 2E).
Pour déterminer si l’architecture de cytosquelette et la distribution de tension pourraient être modifiées comme prévu sur les modèles, nous avons ensemencé des cellules sur des coverslips modelés et visualisé la distribution de la chaîne légère de myosine, un marqueur de contractilité, par microscopie de fluorescence. Après l’ensemencement initial, les cellules gravitent progressivement vers la lamelle de couverture. Ceux qui ont atterri sur des zones à motifs attachés et se sont répandus dans la forme du motif au fil du temps. Ceux qui ont atterri sur PVA seulement lâchement attachés et ont été enlevés après plusieurs lavages et changements de médias. Nous avons constaté que les cellules réparties sur des motifs présentaient des structures phénotypiques de fibroblastes, y compris un bord de lamellipodia dense en actine, des fibres de contrainte ventrale épaisses le long des deux côtés et des fibres de contrainte dorsale émanant des lamellipodia reliées par des arcs transversaux(figure 3A). La chaîne légère de myosine (MLC) s’est assise derrière la jante dense de lamellipodia et a montré un modèle strié le long des faisceaux d’actine. Comme l’indiquent les images moyenisées de nombreuses cellules, ce phénotype était cohérent sur un grand nombre de motifs(figure 3B).
Figure 1. Schéma du micropatterning assisté par laser IR (microphotopatterning). (A) Les lamônes de verre sont chimiquement conjuguées avec APTMS, GA et PVA, dans l’ordre respectif. La surface de PVA est non adhésive pour les cellules et les protéines. (B) PVA est supprimé dans des motifs prédéfinis par un laser IR. (C) Les lamelle à motifs sont recouvertes d’une protéine ECM qui ne s’adsorbera que sur les zones à motifs. (D) Les cellules sont plaquées sur des lamelle, fixes et immunostained pour les protéines d’intérêt. Les cellules qui atterrissent sur des îles à motifs se propagent dans la forme du motif qui donne lieu à des structures cytosquelettiques caractéristiques, tandis que celles qui atterrissent sur PVA restent sphériques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Validation et caractérisation des micropatterns. (A) Micropatterning assisté par laser IR (microphotopatterning) installation sur un étage de microscope. Le laser IR ablate thermiquement PVA dans plusieurs FOVs. (B) Une image de microscopie à réflectance de micropatterns qui ont des pensionnaires clairs et sont identiques aux masques roi. (C) Une image de microscopie de réflectance de l’élimination incomplète de PVA résultant de la puissance laser sous-optimale. (D) Image de microscopie à réflectance du bouillonnement de PVA résultant d’un excès de puissance laser. (E) Images d’immunofluorescence de lamônes à motifs enduits de FN colorées avec des anticorps primaires anti-FN et des anticorps secondaires conjugués au fluorophore. (F) Une ligne de balayage de topologie AFM et une image AFM représentative d’un motif d’arbalète. Pour mesurer la topologie du micropattern, l’imagerie en mode contact a été réalisée à l’aide d’une sonde Bruker AFM (MLCT-B) montée sur un microscope à force atomique NanoWizard 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Images représentatives de cellules plaquées sur des micropatterns. (A) Images représentatives d’un fibroblaste gingival humain primaire plaqué sur des modèles d’arbalète immunostained pour l’actine et le MLC. Des images ont été acquises avec un microscope confocal équipé d’un objectif 100x. (B) Images d’immunofluorescence moyen de l’actine et du MLC dans des cellules plaquées sur des motifs d’arbalète générés par un script Python personnalisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les résultats ci-dessus démontrent que le protocole de micropatterning (microphotopatterning) assisté par laser IR décrit fournit des modèles adhérents reproductibles de diverses formes qui permettent la manipulation de la forme cellulaire et de l’architecture cytosquelettique. Bien que de nombreuses méthodes de micropatterning aient été développées avant et après les débuts du microphotopatterning, cette méthode présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il ne nécessite pas d’équipement spécialisé et de salles blanches que l’on ne trouve généralement que dans les départements d’ingénierie. En fait, comme les microscopes multiphotoniques deviennent un spectacle plus courant dans les départements de biologie, le microphotopatterning élargit les applications du microscope multiphotonique et ajoute au bassin potentiel d’utilisateurs. Les motifs peuvent également être modifiés à la demande et imprimés immédiatement, au lieu d’avoir à fabriquer une nouvelle plaquette maîtresse qui implique un long processus de lithographie.
Par rapport au protocole de microphotopatterning préexistant, une amélioration de notre protocole est l’élimination de plusieurs étapes de durcissement chronophages lors de la préparation de la lamelle. Nous montrons que la qualité de la fixation PVA-coverslip reste imperturbable car les motifs étaient encore intacts et pouvaient lier les cellules même deux semaines après la fabrication. Plus important encore, nous avons amélioré l’automatisation du processus de modelage en éliminant la nécessité de prédéfinir la position de chaque FOV24. Au lieu de cela, nous mettons en œuvre une macro compréhensible qui permet de modeler une grande surface tout en identifiant avec précision le plan focal optimal de chaque FOV.
Bien que les macros du protocole permettent l’automatisation des motifs sur notre système, nous comprenons que chaque microscope à balayage laser commercial est livré avec son propre logiciel propriétaire qui est rarement compatible avec les autres, ce qui rend difficile la mise en œuvre de notre protocole exact sur d’autres systèmes. Cependant, le flux de travail global peut être bien adapté à d’autres systèmes commerciaux pour faciliter le micropatterning automatisé, à savoir le processus de concentration sur chaque champ de vision individuel, le chargement du masque, l’ablation du PVA et le déplacement de l’étape du microscope vers un nouveau champ de vision.
Plusieurs étapes du protocole de modelage doivent être entreprises avec le plus grand soin pour assurer une modelage efficace. L’étape la plus critique consiste à optimiser les conditions de stimulation avant de générer des modèles. En microscopie multi-photons, deux photons ou plus doivent arriver presque simultanément à une molécule fluorescente et combiner leur énergie pour exciter la fluorescence. Cet événement à faible probabilité crée une section optique extrêmement mince qui augmente le rapport signal/bruitde 28. Bien que bénéfique pour l’imagerie, cette caractéristique rend le retrait du revêtement mince de PVA extrêmement sensible à la position Z de l’échantillon. Plusieurs mesures peuvent être mises en œuvre pour contrer cela. Tout d’abord, la puissance laser doit être affinée pour assurer l’élimination complète de la PVA sans « faire bouillir » le polymère ou endommager la lame de couverture du verre. Si le retrait de PVA est constamment incomplet, nous vous recommandons de vérifier l’alignement laser car cela augmente généralement la puissance laser. Deuxièmement, l’étage du microscope doit être nivelé pour éviter l’inclinaison de l’échantillon, ce qui pourrait entraîner des motifs incomplets. Des stimulations IR dans plusieurs positions Z doivent également être mises en place pour s’assurer que la couche PVA est ciblée. Alternativement, si le microscope est équipé d’un module de mise au point parfait, des tests préliminaires peuvent être effectués pour déterminer le décalage optimal en position Z pour le ciblage PVA. Une autre étape critique consiste à mettre en place une macro microscope qui permet la stimulation des motifs de manière automatisée. La macro doit trouver le plan focal de chaque nouveau FOV pour éviter les complications de l’inclinaison de l’échantillon ou de l’inégalité de la surface. Il devrait également permettre à l’étape de se déplacer en forme de S d’une ligne à l’autre, analogue au chemin emprunté dans l’analyse bidirectionnelle, afin de minimiser les écarts en Z entre les FOVs consécutifs.
Une limitation du protocole décrit est le temps nécessaire pour produire un grand nombre de lamelle à motifs, un avantage inégalé offert par l’impression microcontact à base de lithographie29,30. Par conséquent, ce protocole est le mieux adapté aux expériences dans lesquelles un nombre limité de conditions sont requises, ou à celles qui nécessitent des ajustements facilement disponibles dans la forme et la taille du motif. De plus, pour les systèmes dépourvus d’un module autofocus matériel, nous intégrons une série d’événements de stimulation dans différents plans Z pour assurer une suppression automatisée et efficace de la PVA. Étant donné que la stimulation IR est l’étape la plus longue, l’ajout de chaque événement de stimulation (~ 30 secondes) allonge considérablement le processus de modelage. Si le temps est préoccupant, nous vous suggérons de peaufiner l’autofocus en diminuant la taille de l’étape. Cela facilite l’identification du meilleur plan focal qui diminuera le nombre d’événements de stimulation IR requis. Dans nos expériences, la diminution du nombre d’événements de stimulation de cinq à deux réduit le temps de moitié (1,5 h).
En conclusion, le protocole de micropatterning (microphotopatterning) assisté par laser IR que nous décrivons peut être utilisé dans n’importe quel laboratoire ayant accès à un microscope équipé d’un laser IR. En plus d’étudier l’architecture cytosquelettique et les voies de signalisation qui relient la forme à la fonction, cette technique peut également être appliquée au dépistage des médicaments et à d’autres applications sensibles à la variabilité de cellule à cellule.
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Disclosures
Les auteurs ne révèlent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont été appuyés par la Bourse de nouveau chercheur du Fonds Connaught à S.P., la Fondation canadienne pour l’innovation, le Programme de subventions à la découverte du CRSNG (subventions RGPIN-2015-05114 et RGPIN-2020-05881), le Fonds conjoint de recherche de l’Université de Manchester et de l’Université de Toronto et le programme XSeed de l’Université de Toronto. C.T. a été appuyé par une bourse de recherche de l’USRA du CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
References
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