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Bioengineering

इन्फ्रारेड लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटर्निंग के माध्यम से सेल ज्यामिति का नियंत्रण

Published: July 10, 2021 doi: 10.3791/62492
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Summary

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल माइक्रोपैटर्न के स्वचालित निर्माण को सक्षम बनाता है जो स्तनधारी कोशिकाओं के भीतर साइटोस्केलेटल संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए सेल आकार का मानकीकरण करता है। इस उपयोगकर्ता के अनुकूल तकनीक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सिस्टम के साथ स्थापित किया जा सकता है और मानक सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए दुर्गम विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है ।

Abstract

माइक्रोपैटर्निंग सेल बायोलॉजी समुदाय में एक स्थापित तकनीक है जो प्राकृतिक सेल-टू-सेल विविधताओं से उत्पन्न जटिलताओं को दरकिनार करते हुए सेलुलर डिब्बों के आकृति विज्ञान और कार्य के बीच कनेक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाती है। कोशिका आकार को मानकीकृत करने के लिए, कोशिकाएं या तो 3 डी मोल्डों में सीमित होती हैं या चिपकने वाले द्वीपों के माध्यम से चिपकने वाली ज्यामिति के लिए नियंत्रित होती हैं। हालांकि, फोटोलिथोग्राफी और डीप यूवी नक़्क़ाशी पर आधारित पारंपरिक माइक्रोपैटर्निंग तकनीक साफ कमरे या विशेष उपकरणों पर निर्भर करती है। यहां हम डॉयल एट अल से संशोधित एक अवरक्त लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटर्निंग तकनीक (माइक्रोफोटोपैटरिंग) पेश करते हैं जिसे आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सिस्टम के साथ स्थापित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक निकॉन A1R एमपी + इमेजिंग सिस्टम का उपयोग एक अवरक्त (आईआर) लेजर के माध्यम से माइक्रोपैटर्न के साथ माइक्रोपैटर्न उत्पन्न करने के लिए करते हैं जो पॉली-विनाइल अल्कोहल कोटेड कवर्लिप्स पर पूर्व निर्धारित क्षेत्रों को अलग करता है। हम हार्डवेयर ऑटोफोकस से लैस सिस्टम में उच्च दक्षता और सटीकता के साथ स्वचालित पैटर्न निर्माण को सक्षम करने के लिए एक कस्टम स्क्रिप्ट को नियोजित करते हैं। हम बताते हैं कि इस आईआर लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटरिंग (माइक्रोफोटोपैटरिंग) प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप परिभाषित पैटर्न होते हैं जो कोशिकाएं विशेष रूप से संलग्न होती हैं और वांछित आकार लेती हैं। इसके अलावा, कोशिकाओं के आकार के मानकीकरण के कारण बड़ी संख्या में कोशिकाओं से डेटा का औसत किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न पैटर्न, उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के साथ संयुक्त, अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट स्क्रीन के लिए उपयोग किया जा सकता है ताकि फॉर्म और फ़ंक्शन के बीच लिंक की मध्यस्थता करने वाले आणविक खिलाड़ियों की पहचान की जा सके।

Introduction

कोशिका का आकार ऊतक मॉर्फोजेनेसिस1, सेल माइग्रेशन2, सेल प्रसार 3 और जीन अभिव्यक्ति4जैसी मौलिक जैविक प्रक्रियाओं का एक प्रमुख निर्धारक है । कोशिका के आकार में परिवर्तन साइटोस्केलेटन के गतिशील पुनर्व्यवस्थाओं के बीच एक जटिल संतुलन से प्रेरित होते हैं जो प्लाज्मा झिल्ली और बाह्य कारकों जैसे कोशिका पर लगाए गए बाहरी बलों और सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स आसंजन5की ज्यामिति को विकृत करता है। उदाहरण के लिए, मेसेंचिमल कोशिकाओं को माइग्रेट करना, अग्रणी किनारे पर एक घने ऐक्टिन नेटवर्क को पॉलीमराइज करें जो प्लाज्मा झिल्ली को आगे बढ़ाता है और एक विस्तृत लैमेलिपोडिया6बनाता है, जबकि एक्टोमायोसिन अनुबंध कोशिका के संकीर्ण पीछे की धार को अपनी वर्तमान स्थिति7, 8से कोशिका को अलग करने के लिए वापस लेजाताहै। इस तरह की विशेष साइटोस्केलेल संरचनाओं को जन्म देने वाली संकेत घटनाओं को बाधित करना आकार और ध्रुवीयता को बढ़ाता है और सेल माइग्रेशन9को धीमा कर देता है । इसके अलावा, गैस्ट्रुलेशन के दौरान एपिथेलियल शीट झुकने के लिए एक्टोमायोसिन-आधारित एपिकल संकीर्तन की आवश्यकता होती है जो कोशिकाओं और उनके पड़ोसियों को कील के आकारके 10बनने का कारण बनती है। यद्यपि ये अध्ययन कोशिका आकार के महत्व को उजागर करते हैं, लेकिन कोशिका के आकार में अंतर्निहित विषमता ने उन तंत्रों की पहचान करने के प्रयासों को भारग्रस्त कर दिया है जो आकृति विज्ञान को कार्य करने के लिए जोड़ते हैं।

इस उद्देश्य के लिए, पिछले तीन दशकों में सेल आकार में हेरफेर करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। ये दृष्टिकोण या तो कोशिका को त्रि-आयामी मोल्ड के साथ बाधित करके या एक एंटीफाउलिंग सतह पर बाहित जमाव के माध्यम से सेलुलर आसंजन ज्यामिति को नियंत्रित करके अपने लक्ष्य को प्राप्त करते हैं, एक तकनीक जिसे माइक्रोपैटर्निंग11कहा जाता है। यहां हम कई तकनीकों की समीक्षा करेंगे जिन्होंने वर्षों में लोकप्रियता हासिल की है।

मूल रूप से माइक्रोइलेक्ट्रॉनिक अनुप्रयोगों के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में बीड़ा उठाया गया है, नरम लिथोग्राफी-आधारित माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग स्पष्ट रूप से एक पंथ पसंदीदा12बन गया है। एक मास्टर वेफर पहले एक फोटोरेसिस्ट-लेपित सिलिकॉन सब्सट्रेट के क्षेत्रों को फोटोनिरेडेशन के लिए चुनिंदा रूप से उजागर करके निर्मित किया जाता है, जो एक नमूनों वाली सतह13को पीछे छोड़ देता है। पीडीएमएस जैसे एक इलास्टोमर को एक नरम "स्टांप" उत्पन्न करने के लिए मास्टर वेफर पर डाला जाता है जो ईसीएम प्रोटीन को वांछित सब्सट्रेट11,14में स्थानांतरित करता है। एक बार गढ़े जाने के बाद, एक मास्टर वेफर का उपयोग कई पीडीएमएस टिकटों को कास्ट करने के लिए किया जा सकता है जो अत्यधिक प्रजनन योग्य माइक्रोपैटर्न12को जन्म देते हैं। हालांकि, लंबी फोटोलिथोग्राफी प्रक्रिया के कारण पैटर्न को आसानी से समायोजित नहीं किया जा सकता है। इस प्रक्रिया के लिए अत्यधिक विशिष्ट उपकरण और क्लीनरूम की भी आवश्यकता होती है जो आमतौर पर जीव विज्ञान विभागों में उपलब्ध नहीं होते हैं।

हाल ही में, पारंपरिक लिथोग्राफी-आधारित दृष्टिकोणों द्वारा उत्पन्न सीमाओं को दरकिनार करने के लिए डीप यूवी का उपयोग करके प्रत्यक्ष मुद्रण की सूचना दी गई है। डीप यूवी लाइट को फोटोमास्क के माध्यम से पॉली-एल-लिसिन-ग्राफ्टेड -पॉलीथीन ग्लाइकोल के साथ लेपित ग्लास कवरलिप के चुनिंदा क्षेत्रों मेंनिर्देशित किया जाताहै। गहरी यूवी के संपर्क में आने वाले रासायनिक समूहों को फोटोयुक्त लिंकर्स के उपयोग के बिना फोटोयुक्त किया जाता है ताकि ईसीएम प्रोटीन15को बाध्यकारी बनाया जा सके । फोटोसेंसिटिव लिंकर्स की कमी पैटर्न वाले कवर्लिप को सात महीनेसेअधिक समय तक कमरे के तापमान पर स्थिर रहने में सक्षम बनाती है । यह विधि क्लीनरूम और फोटोलिथोग्राफी उपकरणों के उपयोग से बचती है और कम विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। हालांकि, फोटोमास्क के लिए आवश्यकता अभी भी प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बन गई है जिसके लिए पैटर्न में आसानी से उपलब्ध परिवर्तनों की आवश्यकता होती है।

2डी सतह पर ईसीएम प्रोटीन के नियंत्रित जमाव के माध्यम से सेल ज्यामिति में हेरफेर करने वाले तरीकों के अलावा, अन्य 3 डी माइक्रोस्ट्रक्चर में कोशिकाओं को सीमित करके सेल आकार को नियंत्रित करना चाहते हैं। कई अध्ययनों ने भ्रूण, बैक्टीरिया, खमीर और पौधों में आकार पर निर्भर जैविक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए 2डी, पीडीएमएस कक्षों के बजाय 3 डी उत्पन्न करने के लिए ऊपर वर्णित नरम लिथोग्राफी-आधारित दृष्टिकोण को अनुकूलित किया है16,17,18,19। दो फोटॉन पॉलीमराइजेशन (2PP) ने माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीक के रूप में भी नेतृत्व किया है जो नैनोमीटर रेजोल्यूशन20के साथ जटिल 3डी हाइड्रोजेल मचान बना सकता है । 2PP दो फोटॉन सोखने के सिद्धांतों पर निर्भर करता है, जहां फेमटोसेकंड दालों में दिए गए दो फोटॉन इस मामले में एक अणु-फोटोनिइटिएटर द्वारा एक साथ अवशोषित होते हैं- जो फोटोपॉलिमर21के स्थानीय बहुलकीकरण को सक्षम बनाता है। इस तकनीक को 3डी मचानों को मुद्रित करने के लिए भारी नियोजित किया गया है जो मानव ऊतक की देशी ईसीएम संरचनाओं की नकल करते हैं और22कोशिकाओं को कम फोटोकेमिकल क्षति पहुंचाने के लिए दिखाए गए हैं।

10 साल पहले माइक्रोफोटोपैटर्निंग की शुरुआत ने शोधकर्ताओं को दुर्गम और विशेष उपकरणों से बचने के दौरान माइक्रोपैटर्न बनाने का अवसर दिया । माइक्रोफोटोपैटर्निंग एक अवरक्त लेजर23,24का उपयोग करके सक्रिय कांच की सतहों पर लेपित पॉली-विनाइल अल्कोहल (पीएफए) के चुनिंदा क्षेत्रों को थर्मल रूप से हटाकर माइक्रोन पैमाने पर पैटर्न बनाता है। ईसीएम प्रोटीन जो केवल अंतर्निहित कांच की सतह को संलग्न करते हैं और पीवीए नहीं करते हैं, फिर नियंत्रित प्रसार गतिशीलता और कोशिका आकार को सक्षम करने के लिए जैव रासायनिक संकेतों के रूप में काम करते हैं। यह विधि बेहतर लचीलापन भी प्रदान करती है क्योंकि वास्तविक समय में पैटर्न को आसानी से बदला जा सकता है। यहां, हम एक वाणिज्यिक मल्टी-फोटॉन इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके माइक्रोफोटोपैटर्निंग का एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल बड़े पैटर्न के तेजी से और स्वचालित निर्माण के लिए डिज़ाइन किया गया है। हमने दिखाया कि ये पैटर्न सेल-ईसीएम आसंजन की ज्यामिति को बाधित करके सेल आकार को कुशलतापूर्वक नियंत्रित करते हैं। अंत में, हम प्रदर्शित करते हैं कि वर्णित पैटर्निंग तकनीक संगठन और ऐक्टिन साइटोस्केलेटन की गतिशीलता को संशोधित करती है।

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Protocol

1. कवरस्लिप प्रीप्रोसेसिंग

  1. वाटरमैन-स्टोरर, 199825में वर्णित चीख़-साफ कवरस्लिप तैयार करें।
  2. 1% (3-अमीनोप्रोपिल) ट्राइमेथॉक्सीलेन (एपीटीएमएस) समाधान तैयार करें और कोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए समाधान में कवरस्लिप को इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि कवर्लिप समाधान में स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ते हैं।
  3. 5 मिनट प्रत्येक के लिए डीएच2ओ के साथ दो बार कवरस्लिप धोएं।
  4. 0.5% ग्लूटारल्डिहाइड (जीए) समाधान तैयार करें और एक शेकर पर 30 मिनट के लिए समाधान में कवरस्लिप को इनक्यूबेट करें। 25 कवर्लिप्स के लिए, ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान के 50 एमएल का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि कवर्लिप समाधान में स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ते हैं।
  5. 10 मिनट प्रत्येक के लिए डीएच2ओ के साथ तीन बार कवरस्लिप धोएं।
  6. कस्टम-निर्मित कवरस्लिप स्पिनर का उपयोग करके 30 एस के लिए स्पिन ड्राई कवरस्लिप। कवरस्लिप स्पिनर का विस्तृत विवरण26 प्रकाशित किया गया है और ऑनलाइन उपलब्ध है (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/) । सक्रिय कवर्लिप्स को डिवाइडर वाले बॉक्स में +4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है ताकि वे एक दूसरे से अलग खड़े हों।

2. पीवीए कोटिंग

  1. 5.6% समाधान बनाने के लिए डीएच2ओ के साथ पीवीए (98% हाइड्रोलिज्ड पीवीए, मेगावाट 98000) मिलाएं।
  2. मिश्रण को 90 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में घुलनशील करें और गर्म करते समय बायोसेफ्टी कैबिनेट में 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से तुरंत फ़िल्टर करें। यदि यह उपजी है तो स्टॉक समाधान को फिर से फ़िल्टर करें। PVA समाधान 3 महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. एक 15 एमएल ट्यूब में, एक भाग एचसीएल को आठ भागों में जोड़ें PVA। ट्यूब को कई बार मिश्रण करने के लिए ध्यान से उलटा करें।
  4. मिश्रित समाधान के 2 एमएल को 35 मिमी पेट्री डिश में डालें और तरल में एक साफ, प्रीप्रोसेस्ड कवरलिप को जलमग्न करें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि कवरस्लिप नीचे से चिपके नहीं हैं। एक शेखर पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  5. समाधान से कवर्लिप्स को सावधानी से हटा दें। 40 एस के लिए कोट स्पिन करने के लिए कवरस्लिप स्पिनर का उपयोग करें। इस दौरान चिमटी साफ करें। कवरलिप को एक बॉक्स में स्थानांतरित करें और रात भर +4 डिग्री सेल्सियस पर सूखा। पीवीए-लेपित कवरस्लिप को दो सप्ताह तक +4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोप को कॉन्फ़िगर करना

नोट: वर्णित प्रोटोकॉल को ईमानदार या उल्टे बहु-फोटॉन इमेजिंग सिस्टम पर वांछित आकार और आकार के सेल चिपकने वाले माइक्रोपैटर्न बनाने के लिए ट्यून किया गया है, खासकर वे जो हार्डवेयर ऑटोफोकस से लैस नहीं हैं। इस प्रकार, देखने के हर क्षेत्र (FOV) के लिए, पैटर्निंग स्क्रिप्ट कवरस्लिप पर एक प्रत्ययी मार्कर बनाने के लिए एक छोटे से क्षेत्र को अलग करती है, कवरस्लिप सतह पर माइक्रोस्कोप को केंद्रित करने के लिए एक सॉफ्टवेयर ऑटोफोकस का उपयोग करती है, और वांछित पैटर्न को अलग करती है। आसन्न FOVs के लिए एक लूप में इस स्क्रिप्ट को मजबूती से चलाने से माइक्रोपैटर्न (5 x 5 मिमी या उससे बड़ा) की एक बड़ी सरणी बनती है जो कोशिका के आकार को बाधित करती है और इंट्रासेलर जैविक प्रक्रियाओं की गतिविधि को संशोधित करती है। एनआईएस-एलिमेंट्स सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित निकॉन ए1आर एमपी + इमेजिंग सिस्टम के लिए वर्णित प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। यदि किसी अन्य विक्रेता से इमेजिंग सिस्टम का उपयोग पैटर्निंग के लिए किया जाता है, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन और पैटर्निंग स्क्रिप्ट को समायोजित किया जाना चाहिए।

  1. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर चालू करें। सुनिश्चित करें कि "Apo LWD 25X/1.10WDIC N2" उद्देश्य माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की है ।
    नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल 25x/1.1 एनए जल विसर्जन उद्देश्य के लिए अनुकूलित है, लेकिन अन्य उद्देश्यों का उपयोग पैटर्निंग के लिए भी किया जा सकता है। पाठकों को पता होना चाहिए कि एक उच्च आवर्धन उद्देश्य(जैसे,40x और 60x) के साथ pattering अब समय लगता है क्योंकि यह काफी प्रत्येक FOV में ablated पैटर्न की संख्या कम हो जाती है । कम आवर्धन उद्देश्यों का उपयोग पैटर्निंग के लिए किया जा सकता है जब तक कि वे एफओवी में एक समान रोशनी प्रदान करते हैं और PVA परत को कम करने के लिए पर्याप्त लेजर शक्ति।
  2. A1plus MP जीयूआई विंडो में लेजर लाइन को 750 एनएम तक सेट करें।
  3. "छवि" ऑप्टिकल विन्यास की स्थापना
    नोट: एनआईएस-एलिमेंट्स उपयोगकर्ताओं को माइक्रोस्कोप हार्डवेयर को नियंत्रित करने के लिए कई उपकरण (ग्राफिकल इंटरफेस, एक अधिग्रहण वर्कफ्लो बिल्डर जॉब्स, ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन और मैक्रो) प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में, अधिकांश हार्डवेयर नियंत्रण विभिन्न ऑप्टिकल विन्यासों के साथ-साथ एनडी अधिग्रहण और एनडी स्टिमुलेशन मॉड्यूल के माध्यम से प्राप्त किया जाता है।
    1. अंशांकन टैब में, नई ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशनपर क्लिक करें। ऑप्टिकल विन्यास "छवि" का नाम दें। यह बेसलाइन ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन है जो रिफ्लेक्स के माध्यम से कवरस्लिप की इमेजिंग की अनुमति देता है। अन्य सभी विकल्पों को डिफ़ॉल्ट रूप में छोड़ दें और उचित उद्देश्य का चयन करें।
    2. A1plus MP GUI विंडो में, इस ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन के तहत हार्डवेयर सेटिंग्स को कॉन्फ़िगर करने के लिए सेटिंग्स बटन पर क्लिक करें। आईआर स्टिमके लिए उत्तेजना लेजर सेट करें, बीम स्प्लिटर (बीएस 20/80) को प्रकाश पथ में रखें, गैल्वानो में स्कैनर यूनिट सेट करें और उपयुक्त डेस्कैन्ड डिटेक्टर का चयन करें।
    3. A1plus कॉम्पैक्ट जीयूआई विंडो में, एक स्कैन आकार का चयन करें और समय का ध्यान रखें जो क्रमशः हमारे सिस्टम पर कवरस्लिप (1.1 एमएस और 1024 पिक्सल) पर छोटी सुविधाओं को कैप्चर करने के लिए पर्याप्त है। सामान्य बटन पर क्लिक करें तो कोई लाइन औसत या लाइन एकीकरण किया जाता है। सुनिश्चित करें कि उपयोग आईआर लेजर बॉक्स की जांच की जाती है। सादगी के लिए एकदिशात्मक स्कैनिंग सेट करें।
      नोट: यदि स्कैन गति चिंता का विषय है, तो द्विदिशात्मक स्कैनिंग का उपयोग किया जा सकता है।
    4. एक ही खिड़की में, कवरस्लिप सतह की उज्ज्वल लेकिन संतृप्त छवि प्राप्त करने के लिए लेजर शक्ति और डिटेक्टर संवेदनशीलता को समायोजित करें। 15 वी के लिए अधिकतम शक्ति और डिटेक्टर संवेदनशीलता ("एचवी" स्लाइडर) का 5% लेजर पावर सेट करना एक अच्छा शुरुआती बिंदु है।
    5. A1plus स्कैन क्षेत्र खिड़की में, पूरे FOV पर कब्जा करने के लिए 1 करने के लिए ज़ूम सेट ।
    6. ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन को सहेजें।
  4. "Print_Fudiciary_Marker" ऑप्टिकल विन्यास की स्थापना
    1. "छवि" ऑप्टिकल विन्यास डुप्लिकेट और इसे "Print_Fudiciary_Marker" नाम दें।
    2. A1plus कॉम्पैक्ट जीयूआई विंडो में, सबसे छोटे स्कैन आकार और निवास समय (हमारे सिस्टम पर क्रमशः 64 पिक्सल और 80.2 एमएस) का चयन करें।
    3. चूंकि इस चरण में कोई इमेजिंग की आवश्यकता नहीं है, इसलिए डिटेक्टर संवेदनशीलता को 0 सेट करें और लेजर पावर को 30% तक बढ़ाएं। उच्च लेजर शक्ति थर्मल वांछित क्षेत्रों में कवरस्लिप पर PVA परत को हटा देंगे।
    4. A1plus स्कैन क्षेत्र खिड़की में, अधिकतम करने के लिए ज़ूम सेट (हमारे सिस्टम के लिए १५.८७) और FOV के बीच में स्कैन क्षेत्र जगह है ।
    5. एनडी अधिग्रहण विंडो में, जेड-स्टैक प्रयोग स्थापित करें। सापेक्ष करने के लिए जेड स्थिति में आंदोलन सेट करें और उपयुक्त जेड डिवाइस का चयन करें। माइक्रोस्कोप चरण या आसन्न FOVs के बीच PVA सतह में किसी भी असमानता के लिए खाते में ऊपर और नीचे 10 माइक्रोन करने के लिए कदम आकार और 10 माइक्रोन करने के लिए ढेर गहराई सेट करें ।
  5. "ऑटोफोकस" ऑप्टिकल विन्यास की स्थापना
    1. "छवि" ऑप्टिकल विन्यास डुप्लिकेट और इसे "Autofocus" का नाम बदलें।
    2. A1plus स्कैन क्षेत्र खिड़की में, ज़ूम कारक को कम करें ताकि FOV प्रत्ययी मार्कर से थोड़ा बड़ा हो। यह सुनिश्चित करता है कि कवरस्लिप पर अन्य छोटी विशेषताएं ऑटोफोकसिंग में हस्तक्षेप नहीं करेंगी।
    3. डिवाइस मेनू में, ऑटोफोकस सेट अप काचयन करें। जेड-स्टैक प्रयोग में जेड-स्टैक के लिए स्कैन मोटाई सेट करें (चरण 3.5.5 देखें)। माइक्रोस्कोप इस रेंज के माध्यम से स्कैन और प्रत्ययी मार्कर का उपयोग कर सबसे अच्छा फोकल विमान मिल जाएगा । स्टेप साइज को डिफॉल्ट के तौर पर छोड़ दें।
  6. "Load_ROI" ऑप्टिकल विन्यास की स्थापना
    1. "छवि" ऑप्टिकल विन्यास डुप्लिकेट और इसे "Load_ROI" नाम दें।
    2. A1plus कॉम्पैक्ट जीयूआई विंडो में, आरओआई मास्क के समान स्कैन आकार सेट करें। इस ऑप्टिकल विन्यास का उपयोग एक छवि को कैप्चर करने के लिए किया जाएगा जिस पर आरओआई मास्क लोड किया जाएगा। हमने रिज़ॉल्यूशन और स्पीड के बीच इष्टतम संतुलन हासिल करने के लिए 2048 पिक्सल का इस्तेमाल किया।
      नोट: यह आवश्यक है कि यह कैप्चर की गई छवि आरओआई मास्क के आकार में समान हो।
  7. "माइक्रोपैटर्न" ऑप्टिकल विन्यास की स्थापना
    1. "Print_Fiduciary_Marker" ऑप्टिकल विन्यास डुप्लिकेट और इसे "माइक्रोपैटर्न" का नाम बदलें।
    2. ज़ूम फैक्टर को एक में सेट करें।
    3. A1plus MP GUI विंडो में, PVA को ablate करने के लिए उत्तेजना लेजर शक्ति बढ़ाएं और हमारे प्रयोगों में क्रमशः एक उपयुक्त स्कैन गति (40% और 32 s/frame) का चयन करें।
    4. ND उत्तेजना खिड़की में, एक एनडी उत्तेजना प्रयोग की स्थापना की। समय सारणी में कुछ चरण जोड़ें और प्रत्येक को उत्तेजना के रूप में निर्धारित करें। सुनिश्चित करें उत्तेजना क्षेत्र और अवधि सही हैं।
      नोट: चरणों की संख्या को पीवीए परत की मोटाई और चिकनाई के साथ-साथ इस ऑप्टिकल विन्यास में उपयोग की जाने वाली लेजर शक्ति के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
    5. एक ही विंडो में, प्रत्येक चरण से पहले StgMoveMainz(-1.000,1)कार्य करने में सक्षम करें। यह फिर से जेड-दिशा में किसी भी विचलन के लिए खातों ।
      नोट: दूरी और दिशा जिसमें उद्देश्य चालें PVA परत की मोटाई और चिकनाई के अनुसार समायोजित किया जा सकता है ।
  8. "Label_Surface" ऑप्टिकल विन्यास की स्थापना
    1. "Print_Fudiciary_Marker" ऑप्टिकल विन्यास डुप्लिकेट और इसे "Label_Surface" नाम दें।
    2. A1plus कॉम्पैक्ट जीयूआई विंडो में, लेजर पावर को काफी बढ़ाएं और ज़ूम को एक सेट करें। यहां इस्तेमाल होने वाली हाई लेजर पावर से ग्लास कवरस्लिप को शारीरिक रूप से नुकसान होगा और नग्न आंखों को दिखाई देने वाला लेबल पैदा होगा । यह आगे के प्रयोगों में पैटर्न का पता लगाने में सहायता करता है।

4. आरओआई मास्क उत्पन्न करना और मैक्रो स्थापित करना

  1. आरओआई मास्क उत्पन्न करना
    1. 2048 आरजीबी छवि उत्पन्न करने के लिए एडोब फ़ोटोशॉप या अन्य उपलब्ध सॉफ़्टवेयर × उपयोग करें। छवि माइक्रोस्कोप के तहत एक FOV से मेल खाती है(यानी, 532.48 × 532.48 माइक्रोन, 0.26 माइक्रोन प्रति पिक्सेल)। छवि में एक काला (0, 0, 0) पृष्ठभूमि होनी चाहिए।
      नोट: लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटर्निंग के लिए आरओआई मास्क जेनरेट करने के लिए कई कमर्शियल और फ्री इमेज एडिटर्स का इस्तेमाल किया जा सकता है । यद्यपि हम मास्क उत्पन्न करने के लिए एडोब फोटोशॉप का उपयोग करते हैं, लेकिन जीआईएमपी और इमेजजे/फिजी वैकल्पिक मुफ्त विकल्पों के रूप में भी उपलब्ध हैं।
    2. काले रंग की पृष्ठभूमि पर 8 - 12 सफेद (255,255,255) पैटर्न ड्रा करें। पैटर्न का आकार सेल प्रकार (व्यास में ~ 200 पिक्सल) के आधार पर भिन्न होता है। ऑटोफोकसिंग के लिए छवि के केंद्र में 500 × 500 खाली क्षेत्र छोड़ दें। आसन्न पैटर्न (>200 पिक्सल) के बीच पर्याप्त जगह छोड़ दें और इष्टतम एब्लेशन और सेल अटैचमेंट के लिए एफओवी के बोर्डर पर। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत पैटर्न गिथुब (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) पर उपलब्ध हैं।
  2. मैक्रो की स्थापना
    1. मैक्रो मेनू पर क्लिक करें और नई मैक्रोका चयन करें ।
    2. नई मैक्रो विंडो में गिथुब (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) पर उपलब्ध "Pattern_Stimulation" कोड का आयात करें। कोड के इस टुकड़े को एक उपयुक्त फ़ोल्डर में सहेजें।
    3. एक और नई मैक्रो विंडो खोलें और गिथुब (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) पर उपलब्ध "Stage_Movement" कोड का आयात करें। सुनिश्चित करें कि इस कोड में "Stage_Movement"कार्य निर्देशिका चरण 4.2.2 में समान है। चरण 4.2.2 में एक ही फ़ोल्डर के लिए"Stage_Movement" कोड सहेजें।

5. फोटो एब्लेशन का उपयोग करके माइक्रोपैटर्न उत्पन्न करना

  1. माइक्रोस्कोप और उसके सामान को चालू करें। सुनिश्चित करें कि आईआर लेजर इस से पहले पर्याप्त रूप से गरम हो गया है।
  2. पीवीए-लेपित कवरलिप को धारक पर स्थानांतरित करें। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के लिए, PVA सतह को नीचे के चेहरे को अलग करने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. कवरस्लिप को स्थिर करने के लिए कोनों में पानी जोड़ें और धारक को माइक्रोस्कोप चरण पर माउंट करें।
  4. उद्देश्य को कम करें और कवरस्लिप पर पानी डालें।
    नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक 25x/1.1 एनए पानी विसर्जन उद्देश्य के लिए अनुकूलित है । यदि एक शुष्क या तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया जाता है, तो पानी को उचित विसर्जन माध्यम से प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। जब एक बड़े माइक्रोपैटर्न सरणी उत्पन्न करने के लिए जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया जाता है, तो वाष्पीकरण एक मुद्दा बन सकता है। यदि ऐसा है, तो पानी को जेनेटल के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, जो फार्मेसियों से उपलब्ध एक ओवर-द-काउंटर आई लुब्रिकेंट है।
  5. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में, A1plus एमपी जीयूआई विंडो में आईआर लेजर शटर चालू करें। पैटर्निंग से पहले लेजर को संरेखित करने के लिए ऑटोअलाइनमेंट बटन पर क्लिक करें।
    नोट: लेजर पथ में छोटे विचलन के रूप में प्रत्येक पैटर्निंग सत्र की शुरुआत में लेजर ऑटोअलाइनमेंट करना महत्वपूर्ण है, जिससे पैटर्न की गुणवत्ता काफी प्रभावित होगी।
  6. "छवि" ऑप्टिकल विन्यास पर स्विच करें। A1plus कॉम्पैक्ट जीयूआई विंडो में, एफओवी को स्कैन करने के लिए स्कैन पर क्लिक करें, जबकि धीरे-धीरे उद्देश्य को कवरस्लिप के करीब ले जा रहा है।
  7. ध्यान से छवि की निगरानी करें। सबसे पहले, छवि बेहद मंद दिखाई देगी। जब तक छवि की चमक बढ़ जाती है तब तक उद्देश्य को कवरलिप के करीब ले जाएं। यह कवरस्लिप सतह है जो उद्देश्य का सामना कर रही है। जब तक चमक घटती और फिर से बढ़ती है तब तक उद्देश्य को आगे बढ़ाते रहें। यह PVA सतह को पैटर्न किया जाना है। इस सतह पर किसी भी छोटी सुविधा (कवरलिप खामियों, धूल, आदि)पर ध्यान केंद्रित करें और जेड ड्राइव पर शून्य सेट करें। ध्यान केंद्रित करने के बाद हमेशा शून्य सेट करें।
    नोट: हालांकि कवरस्लिप की दोनों सतहों को PVA के साथ लेपित किया जाता है, ग्लास के ऑप्टिकल गुणों को पीवीए कोटिंग द्वारा काफी बदल नहीं दिया जाता है। हम नियमित रूप से शुष्क, पानी और तेल विसर्जन उद्देश्यों के साथ इस तरह के कवरस्लिप छवि और इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करने के लिए गैर नमूनों PVA सतह नहीं मिला ।
  8. "Label_Surface" ऑप्टिकल विन्यास पर स्विच करें। कैप्चरपर क्लिक करें । "इमेजिंग" ऑप्टिकल विन्यास और स्कैन करने के लिए लौटें। कांच की सतह क्षतिग्रस्त होनी चाहिए और असंगत दिखाई नी चाहिए। क्षतिग्रस्त क्षेत्र नग्न आंखों को दिखाई देता है, जो आगे के प्रयोगों में पैटर्न के स्थान का संकेत देता है।
    नोट: दृश्यमान लेबल के आकार को बढ़ाने के लिए, कई आसन्न FOVs में चरण 5.8 दोहराएं।
  9. फिर से जांच करें कि उद्देश्य मोटे तौर पर कवरस्लिप के केंद्र में है। सुनिश्चित करें कि उद्देश्य और कवरलिप के बीच पर्याप्त पानी है। कांच के कणों से बचने और पुष्टि करने के लिए स्कैन करने के लिए 1 से 2 FOVs द्वारा मंच ले जाएँ।
  10. डिवाइसेज मेन्यू में Stage_Movement मैक्रो खोलें। जांच करें कि Pattern_Stimulation कार्य निर्देशिका सही है; यदि नहीं, तो उत्तेजना नहीं होगी। चर "पैटर्नलेंगथ" और "पैटर्नहेठ" को एफओवी की वांछित संख्या में सेट करें जो पैटर्न किए जाएंगे। मैक्रो को बचाएं और चलाएं।
  11. पैटर्निंग पूरा होने के बाद, "इमेजिंग" ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन पर स्विच करें। फिर, जांच करें कि आईआर लेजर शटर A1plus एमपी जीयूआई विंडो में खुला है।
  12. पैटर्न देखने के लिए मंच ले जाएँ। उनकी गुणवत्ता की जांच करने के लिए पैटर्न के माध्यम से स्कैन करें।
  13. कवरस्लिप को ग्रिड बॉक्स में स्थानांतरित करें, पैटर्न का सामना करना पड़ रहा है।
  14. उपयोग से पहले एक सप्ताह तक +4 डिग्री सेल्सियस पर पैटर्न वाले कवर्लिप स्टोर करें।

6. फाइब्रोनेक्टिन सोखने

  1. 1 एम नाओएच समाधान में ताजा 1 एम एनएबीएच4 बनाएं। 0.2 मीटर इथेनामाइन युक्त पीएच 8.0 फॉस्फेट बफर में 1:100 अनुपात जोड़ें।
  2. पैटर्न वाले कवर्लिप्स को 35 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें। ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाने के लिए 8 मिनट के लिए ऊपर के समाधान के 1 एमसीएल के साथ प्रत्येक कवरलिप को इनक्यूबेट करें, और फिर पीबीएस के साथ 3 बार कुल्ला करें।
  3. पीबीएस में पतला फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) 10 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए । +37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एफएन में कवरस्लिप को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि सब्सट्रेट के लिए ईसीएम प्रोटीन की पर्याप्त गैर-विशिष्ट बाध्यकारी देखी जाती है, तो एफएन को पीबीएस में पतला किया जा सकता है जिसमें 0.1% प्लूरोनिक एफ-12724होता है।
  4. कवर्लिप को पीबीएस के साथ 2 बार धोएं। यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो पीबीएस में रात भर +4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. सेल अटैचमेंट

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव गिंगिवल फाइब्रोब्लास्ट के लिए अनुकूलित किया गया है।

  1. संस्कृति 70% संकुचन के लिए कोशिकाओं की एक 10 सेमी पकवान।
  2. +37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में सेल कल्चर मीडिया, पीबीएस और 0.05% ट्राइप्सिन को गर्म करें।
    नोट: उन कोशिकाओं के लिए जो सब्सट्रेट के लिए कमजोर पालन करते हैं, वर्सने (0.48 m M EDTA) या मालिकाना एंजाइम मुक्त बफर के साथ गैर-प्रोटियोलिटिक वियोजन पैटर्न के लिए सेल लगाव बढ़ा सकते हैं और इस पर विचार किया जाना चाहिए।
  3. सीडिंग कोशिकाओं से पहले, पैटर्न वाले कवरस्लिप को 1 एमएल गर्म पीबीएस युक्त एक साफ 35 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें।
  4. 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान से सेल संस्कृति मीडिया aspirate और PBS के साथ एक बार धोने ।
  5. डिश में 0.05% ट्राइप्सिन/ईडीटीए के 700 माइक्रोन जोड़ें और +37 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, 1 मिनट के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर।
  6. इस दौरान, पैटर्न वाले कवर्लिप को कवर करने वाले पीबीएस को एस्पिरेट करें और सेल कल्चर मीडिया के 1 एमएल जोड़ें।
  7. पुष्टि करें कि कोशिकाओं को अलग कर दिया है। फिर सेल कल्चर मीडिया के 10 एमएल के साथ ट्राइपसिनाइज्ड कोशिकाओं को फिर से रीस करें और पैटर्न वाले कवर्लिप में 1 मिलियनल जोड़ें।
  8. 2 - 3 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में संस्कृति कोशिकाओं और जांच अगर कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या पैटर्न से जुड़ी है। यदि हां, तो असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए एक बार मीडिया बदलें। यह एक ही पैटर्न पर कई कोशिकाओं के उतरने की संभावना को कम करता है।
    नोट: अटैचमेंट का समय सेल प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  9. एक और 3-4 घंटे के बाद, या जब कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या पैटर्न पर फैल गया है, कोशिकाओं को आगे प्रयोगों के लिए तैयार हैं । सेल डिवीजन से बचने के लिए ज्यादा देर तक इंतजार न करें।

8. डेटा अधिग्रहण

  1. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए साइटोस्केलेटन बफर27 में 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  2. ब्याज के प्रोटीन के लिए स्थापित इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का पालन करें। PVA-लेपित कवर्लिप्स किसी भी इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के साथ अच्छी तरह से काम करते हैं।
  3. एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की छवियों को प्राप्त करें। प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर, प्रति एफओवी में एक या कई कोशिकाओं की छवि।

9. छवि विश्लेषण

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को माइक्रोस्कोप छवियों के जेड-स्टैक से बड़ी संख्या में कोशिकाओं पर ब्याज के प्रोटीन के औसत फ्लोरेसेंस संकेत प्राप्त करने की अनुमति देता है।

  1. एनआईएस तत्वों में अधिग्रहीत छवियों को खोलें और छवियों को क्रॉप करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक छवि में केवल एक अच्छी तरह से प्रसार सेल होता है। छवि प्रसंस्करण पर विस्तृत निर्देश नीचे दी गई स्क्रिप्ट में पाया जा सकता है।
  2. एनाकोंडा स्थापित करें और एनाकोंडा नेविगेटर के माध्यम से स्पाइडर लॉन्च करें।
    नोट: .py स्क्रिप्ट आवश्यकताओं में पहचाने गए उपयुक्त पैकेजों के साथ किसी भी वातावरण में चलाई जा सकती हैं.txt। हम एनाकोंडा की सलाह देते हैं क्योंकि इसमें नीचे दिए गए कोड के लिए अधिकांश आवश्यक पैकेज होते हैं।
  3. गिथुब (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) से स्क्रिप्ट डाउनलोड करें और क्रमशः 3 चैनलों या 4 चैनलों वाली छवियों के लिए स्पायडर("Pattern_Averaging_3Channels.py"या "Pattern_Averaging_4Channels.py"में खुले) ।
  4. अधिग्रहीत छवियों के आधार पर पैरामीटर सेट करें। विस्तृत विवरण के लिए स्क्रिप्ट देखें।
  5. स्क्रिप्ट चलाने के लिए F5 दबाएं। प्रगति को कंसोल पैनल में ट्रैक किया जा सकता है।
  6. एक ही फ़ोल्डर में सहेजी गई आउटपुट फाइलों को पुनः प्राप्त करें। आउटपुट छवियां सभी नमूनों के लिए प्रत्येक चैनल का औसत हैं। एक्सेल शीट एक नमूना सेल के भीतर प्रत्येक चैनल की औसत तीव्रता को दर्शाती है, जो आगे मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम बनाती है।

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Representative Results

माइक्रोपैटर्निंग के माध्यम से प्राप्त प्रायोगिक डेटा की गुणवत्ता काफी हद तक पैटर्न की गुणवत्ता पर निर्भर है। ऊपर की विधि के साथ उत्पन्न पैटर्न की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए, हमने सबसे पहले कवरस्लिप के फोटो एब्लेटेड क्षेत्रों के आकार और आकार का आकलन करने के लिए परावर्तन माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया। हमने पाया कि प्रत्येक व्यक्ति पैटर्न बहुत ablation मुखौटा के समान देखा और स्पष्ट बोर्डर्स और एक सतह है कि प्रकाश समान रूप से परिलक्षित(चित्रा 2B)प्रदर्शित किया । वांछित साइटोस्केलेटन वास्तुकला के आधार पर विभिन्न प्रकार के आकार और आकार मुद्रित किए जा सकते हैं, लेकिन हमने क्रॉसबो आकार का उपयोग किया जो हमारे उद्देश्यों के अनुकूल है। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) से पता चला है कि इस तरह के पैटर्न ऊंचाई में लगभग 140 एनएम थे और पूरे(चित्रा 2F)में न्यूनतम स्थलाकृतिक भिन्नता के साथ एक चिकनी सतह थी। कम लेजर पावर और गलत फोकल प्लेन जैसी सबऑप्टिमल पैटर्निंग सेटिंग्स के परिणामस्वरूप पीवीए सतह को अधूरा हटाने का परिणाम हुआ जो गहरे रंग के रूप में प्रकट होता है, असमान टोपोलॉजी(चित्रा 2C)के साथ आंशिक पैटर्न। लेजर शक्ति को बहुत अधिक स्थापित करने के परिणामस्वरूप पीवीए "बुदबुदाती" और जब चरम, कवर्लिप सतह क्षति भी अवांछनीय है(चित्रा 2 डी)।

प्रारंभिक प्रयोगों में हमने एक कवरस्लिप पर कई एफओवी को कम करके पैटर्निंग क्षेत्र को बढ़ाने का प्रयास किया। हमने पाया कि यह दृष्टिकोण, हालांकि सिद्धांत रूप में काम करता है, माइक्रोस्कोप स्टैंड के जेड-बहाव और कवरस्लिप के मामूली झुकाव के कारण अविश्वसनीय और थकाऊ है। एक स्वचालित फैशन में बड़ी संख्या में FOVs पर उच्च गुणवत्ता वाले पैटर्न को प्राप्त करने के लिए, हमने एक अनुकूलित मैक्रो लागू किया जिसने पैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान माइक्रोस्कोप की सटीकता में सुधार किया। मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोप एक पल्स लेजर को नियोजित करता है जो एक संकीर्ण फोकल प्लेन में उच्च शक्ति के साथ PVA को कुशलतापूर्वक कम करता है, जिससे पैटर्निंग प्रक्रिया नमूने में किसी भी असमानता या झुकाव के प्रति संवेदनशील हो जाती है। नतीजतन, प्रत्येक एफओवी में सटीक फोकल प्लेन की पहचान करना महत्वपूर्ण है। यह एक आदर्श फोकस मॉड्यूल की कमी वाले सिस्टम के लिए और भी अधिक समस्याग्रस्त है, क्योंकि विचलन के रूप में एक से दो माइक्रोन पैटर्निंग प्रक्रिया को निरर्थक बना सकते हैं। इस समस्या का समाधान करने के लिए, अनुकूलित मैक्रो स्क्रिप्ट पहले प्रत्येक नए FOV के केंद्र में एक छोटे वर्ग पैटर्न है कि केवल एक अपेक्षाकृत मोटी जेड स्टैक (≈20 μm) के माध्यम से स्कैनिंग द्वारा ध्यान में मोटे तौर पर होने की जरूरत है । माइक्रोस्कोप तो जल्दी से छवियों के ढेर के माध्यम से स्कैन और इष्टतम फोकल विमान की पहचान करने के लिए एनआईएस तत्वों ऑटोफोकस समारोह का उपयोग करता है । पैटर्न मुखौटा तो भरी हुई है और आईआर उत्तेजना के लिए उत्तेजना आरओआई के रूप में सेट करने के लिए होते हैं । मंच बाद में अगले FOV के लिए ले जाता है और इस प्रक्रिया को दोहराता है । इसके अलावा, माइक्रोस्कोप चरण आंदोलन के वर्ग-तरंग आकार के पथ ने अनुक्रमिक एफओवी के बीच न्यूनतम त्रुटि संचय सुनिश्चित किया। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम नियमित रूप से 3 घंटे से कम समय में कवरस्लिप के 3.5 x 3.5 मिमी क्षेत्र को कवर करने वाले 49 माइक्रोस्कोप एफओवी से बने पैटर्न बनाते हैं।

यह परीक्षण करने के लिए कि क्या नमूनों वाले क्षेत्र, बेफिक्र पीवीए नहीं, ईसीएम प्रोटीन को सोडोर कर सकते हैं, हमने 10 माइक्रोग्राम/एमएल एफएन के साथ पैटर्न वाले कवरस्लिप को लेपित किया और उन्हें एंटी-एफएन एंटीबॉडी के साथ दाग दिया। व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, हमने पाया कि एफएन समान रूप से पैटर्न वाले क्षेत्रों में सोखता है जहां PVA को लेजर एब्लेशन(चित्रा 2E)द्वारा हटा दिया गया था।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या पैटर्न पर उम्मीद के अनुसार साइटोस्केलेटन वास्तुकला और तनाव वितरण को संशोधित किया जा सकता है, हमने पैटर्न वाले कवरस्लिप पर कोशिकाओं को वरीयता दी और फ्लोरेसेस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से संकुचन के एक मार्कर मायोसिन लाइट चेन के वितरण की कल्पना की। प्रारंभिक सीडिंग के बाद, कोशिकाएं धीरे-धीरे कवरस्लिप की ओर झुक जाती हैं। जो नमूनों वाले क्षेत्रों से जुड़े हुए हैं और समय के साथ पैटर्न के आकार में फैल गए हैं। उन है कि PVA पर उतरा केवल शिथिल संलग्न है और कई वॉश और मीडिया में परिवर्तन के बाद हटा दिया गया । हमने पाया कि पैटर्न पर फैल कोशिकाओं ने लमेलिपोडिया के एक ऐक्टिन-घने रिम, दोनों पक्षों के साथ मोटी वेंट्रल स्ट्रेस फाइबर, और ट्रांसवर्स आर्क्स(चित्रा 3 ए)से जुड़े लमेलिपोडिया से निकलने वाले पृष्ठीय तनाव फाइबर सहित फेनोटाइपिकल फाइब्रोब्लास्ट संरचनाओं को प्रदर्शित किया। मायोसिन लाइट चेन (एमएलसी) घने लैमेलिपोडिया रिम के पीछे बैठे और ऐक्टिन बंडलों के साथ एक स्ट्रेटेड पैटर्न प्रदर्शित किया। जैसा कि कई कोशिकाओं की औसत छवियों द्वारा इंगित किया गया है, यह फेनोटाइप बड़ी संख्या में पैटर्न(चित्रा 3 बी)में सुसंगत था।

Figure 1
चित्रा 1। आईआर लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटर्निंग (माइक्रोफोटोपैटर्निंग) की योजनाबद्ध। (A)ग्लास कवरस्लिप को संबंधित क्रम में एपीटीएमएस, जीए और पीवीए के साथ रासायनिक रूप से संयोजित किया जाता है । पीवीए सतह कोशिकाओं और प्रोटीन के लिए चिपकने वाला नहीं है। (ख)पीएफए को आईआर लेजर द्वारा पूर्व निर्धारित पैटर्न में हटा दिया जाता है। (ग)पैटर्न वाले कवर्लिप्स को ईसीएम प्रोटीन से लेपित किया जाता है जो केवल पैटर्न वाले क्षेत्रों में सोख देगा। (घ)कोशिकाओं को कवरस्लिप, फिक्स्ड और इम्यूनोडाड पर ब्याज के प्रोटीन के लिए चढ़ाया जाता है । पैटर्न वाले द्वीपों पर भूमि प्राप्त कोशिकाएं पैटर्न के आकार में फैलती हैं जो विशिष्ट साइटोस्केलेल संरचनाओं को जन्म देती हैं, जबकि पीवीए पर भूमि गोलाकार बनी रहती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। माइक्रोपैटर्न सत्यापन और लक्षण वर्णन। (ए)माइक्रोस्कोप स्टेज पर आईआर लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटर्निंग (माइक्रोफोटोपैटरिंग) सेटअप। आईआर लेजर थर्मल कई FOVs में PVA ablates । (ख)माइक्रोपैटर्न की एक परावर्तन माइक्रोस्कोपी छवि जिसमें स्पष्ट बोर्डर होते हैं और आरओआई मास्क के समान होते हैं। (ग)सबऑप्टिमल लेजर पावर के परिणामस्वरूप पीवीए को अपूर्ण हटाने की एक परावर्तन माइक्रोस्कोपी छवि। (घ)अतिरिक्त लेजर शक्ति के परिणामस्वरूप पीवीए बुदबुदाने की एक परावर्तन माइक्रोस्कोपी छवि । (ई)एंटी-एफएन प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोफोर-कंजूस माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग एफएन लेपित पैटर्न वाले कवरस्लिप की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। (च)एक एएफएम टोपोलॉजी स्कैन लाइन और एक क्रॉसबो पैटर्न की एक प्रतिनिधि एएफएम छवि। माइक्रोपैटर्न की टोपोलॉजी को मापने के लिए, नैनोविजार्ड 4 परमाणु बल माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार ब्रुकर एएफएम जांच (एमएलसीटी-बी) का उपयोग करके संपर्क मोड इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। माइक्रोपैटर्न पर चढ़ाया गया कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। (A)एक प्राथमिक मानव gingival फाइब्रोब्लास्ट की प्रतिनिधि छवियां क्रॉसबो पैटर्न पर चढ़ाया ऐक्टिन और एमएलसी के लिए इम्यूनो दाग । छवियों को 100x उद्देश्य से लैस एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत किया गया था। (ख)कस्टम पायथन लिपि द्वारा उत्पन्न क्रॉसबो पैटर्न पर चढ़ाया गया कोशिकाओं में ऐक्टिन और एमएलसी की औसत इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ऊपर दिए गए परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि वर्णित आईआर लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटर्निंग (माइक्रोफोटोपैटर्निंग) प्रोटोकॉल विभिन्न आकृतियों के प्रजनन योग्य अनुयायी पैटर्न प्रदान करता है जो सेल आकार और साइटोस्केलेल आर्किटेक्चर के हेरफेर को सक्षम बनाता है। यद्यपि माइक्रोफोटोपैटरिंग की शुरुआत से पहले और बाद में कई माइक्रोपैटर्निंग विधियों को विकसित किया गया है, इस विधि के कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह विशेष उपकरण और क्लीनरूम की आवश्यकता नहीं है जो आमतौर पर केवल इंजीनियरिंग विभागों के भीतर पाए जाते हैं। वास्तव में, चूंकि मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोप जीव विज्ञान विभागों में एक अधिक आम दृश्य बन रहे हैं, माइक्रोफोटोपैटर्निंग मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोप के अनुप्रयोगों का विस्तार करता है और उपयोगकर्ताओं के संभावित पूल में जोड़ता है। पैटर्न भी मांग पर बदला जा सकता है और तुरंत मुद्रित, बजाय एक नया मास्टर वेफर है कि एक लंबी लिथोग्राफी प्रक्रिया जरूरत पर जोर देता बनाने के लिए होने की ।

पहले से मौजूद माइक्रोफोटोपैटरिंग प्रोटोकॉल की तुलना में, हमारे प्रोटोकॉल में एक सुधार कवरस्लिप तैयारी के दौरान कई समय लेने वाले इलाज चरणों का उन्मूलन है। हम बताते हैं कि PVA-कवरस्लिप लगाव की गुणवत्ता बेफिक्र रहती है क्योंकि पैटर्न अभी भी बरकरार थे और निर्माण के दो सप्ताह बाद भी कोशिकाओं को बांध सकते थे। इससे भी महत्वपूर्ण बात, हमने प्रत्येक एफओवी24की स्थिति को पूर्व निर्धारित करने की आवश्यकता को नष्ट करके पैटर्निंग प्रक्रिया के स्वचालन में सुधार किया। इसके बजाय, हम एक समझ में मैक्रो को लागू करते हैं जो प्रत्येक एफओवी के इष्टतम फोकल प्लेन की ठीक पहचान करते हुए एक बड़े क्षेत्र की पैटर्निंग की अनुमति देता है।

यद्यपि प्रोटोकॉल में मैक्रो हमारे सिस्टम पर पैटर्निंग के स्वचालन को सक्षम करते हैं, हम समझते हैं कि हर वाणिज्यिक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप अपने स्वयं के मालिकाना सॉफ्टवेयर के साथ आता है जो शायद ही कभी दूसरों के साथ संगत होता है, जिससे अन्य प्रणालियों पर हमारे सटीक प्रोटोकॉल को लागू करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, समग्र कार्यप्रवाह को स्वचालित माइक्रोपैटर्निंग की सुविधा के लिए अन्य वाणिज्यिक प्रणालियों के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित किया जा सकता है, अर्थात् प्रत्येक व्यक्ति एफवी पर ध्यान केंद्रित करने की प्रक्रिया, मास्क लोड करना, PVA को एब्लेटिंग करना, और माइक्रोस्कोप चरण को एक नए एफओवी में ले जाना।

पैटर्निंग प्रोटोकॉल में कई कदम कुशल पैटर्निंग सुनिश्चित करने के लिए बड़ी सावधानी के साथ किए जाने चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण कदम पैटर्न पैदा करने से पहले उत्तेजना की स्थिति को अनुकूलित करना है। बहु-फोटॉन माइक्रोस्कोपी में, फ्लोरोसेंट अणु पर लगभग एक साथ दो या अधिक फोटॉन पहुंचना चाहिए और फ्लोरेसेंस को उत्तेजित करने के लिए अपनी ऊर्जा को जोड़ना चाहिए। यह कम संभावना घटना एक अत्यंत पतली ऑप्टिकल अनुभाग बनाती है जो सिग्नल-टू-शोर अनुपात28को बढ़ाती है। हालांकि इमेजिंग के लिए फायदेमंद, यह सुविधा पतली PVA कोटिंग को हटाने के नमूने की जेड स्थिति के लिए बेहद संवेदनशील बनाता है । इसका मुकाबला करने के लिए कई उपाय लागू किए जा सकते हैं । सबसे पहले, लेजर पावर को पॉलिमर को "उबलते" या ग्लास कवरस्लिप को नुकसान पहुंचाए बिना PVA को पूरी तरह से हटाने सुनिश्चित करने के लिए ठीक-ठाक होना चाहिए। यदि PVA हटाने लगातार अधूरा है, हम लेजर संरेखण की जांच के रूप में यह आमतौर पर लेजर शक्ति बढ़ जाती है की सलाह दें । दूसरा, माइक्रोस्कोप चरण नमूना झुकाव से बचने के लिए समतल किया जाना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप अधूरे पैटर्न हो सकते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि पीवीए परत को लक्षित किया गया है, कई जेड-पदों में आईआर उत्तेजनाएं भी स्थापित की जानी चाहिए। वैकल्पिक रूप से, यदि माइक्रोस्कोप एक आदर्श फोकस मॉड्यूल से लैस है, तो पीवीए लक्ष्यीकरण के लिए जेड-स्थिति में इष्टतम ऑफसेट निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक परीक्षण किए जा सकते हैं। एक और महत्वपूर्ण कदम एक माइक्रोस्कोप मैक्रो स्थापित करना है जो स्वचालित फैशन में पैटर्न उत्तेजना की अनुमति देता है। मैक्रो नमूना झुकाव या सतह असमानता से जटिलताओं से बचने के लिए प्रत्येक नए FOV के फोकल विमान खोजना चाहिए । यह भी मंच पंक्ति से पंक्ति के लिए एक एस आकार में स्थानांतरित करने के लिए, द्वि दिशात्मक स्कैनिंग में लिया पथ के अनुरूप, लगातार FOVs के बीच जेड में विचलन को कम करने की अनुमति चाहिए ।

वर्णित प्रोटोकॉल की एक सीमा बड़ी संख्या में पैटर्न वाले कवर्लिप का उत्पादन करने के लिए आवश्यक समय है, जो लिथोग्राफी-आधारित माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग29,30द्वारा पेश किया गया एक अद्वितीय लाभ है। नतीजतन, यह प्रोटोकॉल उन प्रयोगों के लिए सबसे उपयुक्त है जिनमें सीमित संख्या में शर्तों की आवश्यकता होती है, या जिन्हें पैटर्न आकार और आकार में आसानी से उपलब्ध समायोजन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, हार्डवेयर ऑटोफोकस मॉड्यूल की कमी वाले सिस्टम के लिए, हम स्वचालित और प्रभावी पीवीए हटाने को सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न जेड-विमानों में उत्तेजना की घटनाओं की एक श्रृंखला को एकीकृत करते हैं। चूंकि आईआर उत्तेजना सबसे अधिक समय लेने वाला कदम है, इसलिए प्रत्येक उत्तेजना घटना (~ 30 सेकंड) के अलावा पैटर्निंग प्रक्रिया को काफी लंबा करता है। यदि समय चिंता का विषय है, तो हम कदम का आकार कम करके ऑटोफोकस को ठीक करने का सुझाव देते हैं। यह सबसे अच्छा फोकल विमान की पहचान की सुविधा प्रदान करता है जो आवश्यक आईआर उत्तेजना घटनाओं की संख्या को कम करेगा। हमारे प्रयोगों में, उत्तेजना की घटनाओं की संख्या को पांच से घटाकर दो समय आधा (1.5 घंटे) कम कर देता है।

अंत में, आईआर लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटरिंग (माइक्रोफोटोपैटरिंग) प्रोटोकॉल जिसका हम वर्णन करते हैं, उसका उपयोग किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है जिसमें आईआर लेजर-सुसज्जित माइक्रोस्कोप तक पहुंच है। साइटोस्केलेटल आर्किटेक्चर और सिग्नलिंग पाथवे का अध्ययन करने के अलावा, इस तकनीक को दवा स्क्रीनिंग और अन्य अनुप्रयोगों पर भी लागू किया जा सकता है जो सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता के प्रति संवेदनशील हैं।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव का खुलासा नहीं करते ।

Acknowledgments

इस काम को कनॉट फंड न्यू इन्वेस अन्वेषक पुरस्कार द्वारा एसपी, कनाडा फाउंडेशन फॉर इनोवेशन, NSERC डिस्कवरी ग्रांट प्रोग्राम (अनुदान आरजीपिन-2015-05114 और आरजीपिन-2020-05881), मैनचेस्टर विश्वविद्यालय और टोरंटो विश्वविद्यालय संयुक्त अनुसंधान कोष, और टोरंटो XSeed कार्यक्रम विश्वविद्यालय को समर्थन दिया गया था। सीटी को एनएसईआरसी यूएसआरए फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane Aldrich 281778
10 cm Cell Culture Dish VWR 10062-880 Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective Nikon MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish VWR 10861-586 Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Thermo 62248 1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin BioShop ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Wisent 311-425-CL
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
Fibronectin Sigma-Aldrich FC010 1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody BD 610077 Mouse
Fiji ImageJ Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin Invitrogen A12380 568nm
Glass Coverslip VWR 16004-302 22 × 22 mm
Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16220 25% aqueous solution
Hydrochloric Acid Caledon 6025-1-29 37% aqueous solution
IR Laser Coherent Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α Gibco 12561-056
Mounting Medium Sigma F4680
Mouse Secondary Antibody Cell Signaling Technology 4408S Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope Nikon A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody Cell Signaling Technology 3672S Rabbit
NIS Elements Nikon Version 5.21.03
Nitric Acid Caledon 7525-1-29 70% aqueous solution
Photoshop Adobe Version 21.2.1
Pluronic F-127 Sigma P2443 Powder
Poly(vinyl alchohol) Aldrich 341584 MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody Cell Signaling Technology 4412S Goat, 488nm
Shaker VWR 10127-876 Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride Aldrich 452882 Powder
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium Phosphate Dibasic Sigma S5136 Powder
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S5011 Powder
Spyder Anaconda 4.1.4
Trypsin Wisent 325-042-CL 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 173
इन्फ्रारेड लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटर्निंग के माध्यम से सेल ज्यामिति का नियंत्रण
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Yang, S., Tuo, C., Iu, E., Plotnikov, S. V. Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning. J. Vis. Exp. (173), e62492, doi:10.3791/62492 (2021).

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