Summary
ここで示すプロトコルは、哺乳類細胞内の細胞骨格構造を研究するために細胞形状を標準化するマイクロパターンの自動製作を可能にする。このユーザーフレンドリーな技術は市販のイメージ投射システムと設定することができ、標準的な細胞生物学の実験室にアクセスできない専門の装置を要求しない。
Abstract
マイクロパターニングは、自然な細胞間変動から生じる合併症を回避しながら、細胞コンパートメントの形態と機能の間の関係を研究するために使用される細胞生物学コミュニティで確立された技術です。細胞形状を標準化するために、セルは3D金型に閉じ込められるか、接着的な島を通して接着幾何学のために制御されます。しかし、フォトリソグラフィとディープUVエッチングに基づく従来のマイクロパターニング技術は、クリーンルームや特殊な設備に大きく依存しています。ここでは、市販の撮像システムで簡便に設定できる、ドイルらから改変された赤外線レーザー支援マイクロパターン化技術(マイクロフォトパターン化)を提示する。このプロトコルでは、ニコンA1R MP+イメージングシステムを使用して、ポリビニルアルコールコーティングカバーリップ上のプリセット領域をアブラプターする赤外線(IR)レーザーを介してミクロン精度のマイクロパターンを生成します。ハードウェアオートフォーカスを搭載していないシステムでは、高効率かつ精度の高いパターン製作を可能にするカスタムスクリプトを採用しています。我々は、このIRレーザー支援マイクロパターン化(マイクロフォトパターン化)プロトコルが、細胞が排他的に取り付け、所望の形状を取る定義されたパターンをもたらすことを示す。さらに、セル形状の標準化により、多数の細胞からのデータを平均化することができる。このプロトコルで生成されたパターンは、高解像度のイメージングと定量分析と組み合わせて、比較的高いスループット画面に使用して、形態と機能の間のリンクを媒介する分子プレーヤーを識別することができます。
Introduction
細胞形状は、組織形態形成1、細胞遊び出し2、細胞増殖3、遺伝子発現4などの基本的な生物学的プロセスの重要な決定因子である。細胞形状の変化は、細胞膜を変形させる細胞骨格の動的再配置と、細胞に及ぶ外力などの外的要因と、細胞細胞および細胞マトリックス接着の幾何学的形状との間の複雑なバランスによって駆動される。例えば、間葉系細胞の移動は、血漿膜を前方に押し出し、広いラメリポディア6を作成する先端に密なアクチンネットワークを重合し、アクトミオシン収縮は細胞の狭い後縁を引き込んで現在位置7,8から細胞を取り外す。このような特殊な細胞骨格構造を摂動するようなシグナル伝達事象を破壊し、細胞の移動を遅くする9.また、胃の中での上皮シートの曲げには、細胞とその隣人がくさび状の10になる原因となるアクトミオシンベースの尖語狭窄が必要です。これらの研究は細胞形状の重要性を強調しているが、細胞形状の固有の不均一性は、形態を機能に結びつけるメカニズムを特定する努力を妨げている。
このため、細胞の形状を操作するための数多くのアプローチが過去30年間に開発されました。これらのアプローチは、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を防汚表面にパターン化して細胞接着幾何学的形状を3次元型で拘束するか、または細胞接着幾何学を制御することによって、その目標を達成する、マイクロパターニング11と呼ぶ技術である。ここでは、長年にわたって人気を集めている技術の数を確認します。
もともとマイクロエレクトロニクスアプリケーションのアプローチとして開拓されたソフトリソグラフィベースのマイクロコンタクト印刷は、明らかにカルトのお気に入り12になっています。マスターウエハは、まずフォトレジスト被覆シリコン基板の領域を光照射に選択的に露出させることによって作製され、パターン化された表面13を残す。次いで、PDMSなどのエラストマーをマスターウエハに注ぎ、ECMタンパク質を所望の基質11,14に移すソフトな「スタンプ」を生成する。製造されると、マスターウエハを使用して、再現性の高いマイクロパターン12を生じさせる多くのPDMSスタンプをキャストすることができる。しかし、長いフォトリソグラフィプロセスのためにパターンを容易に調整することはできません。このプロセスには、生物学部門では一般的に利用できない高度に特殊な機器とクリーンルームも必要です。
最近では、深いUVを用いたダイレクト印刷は、従来のリソグラフィーベースのアプローチによってもたらされる限界を回避することが報告されている。深いUV光は、ポリL-リジン-移植-ポリエチレングリコールでコーティングガラスカバースリップの選択的領域にフォトマスクを介して向けられる。深部UVにさらされた化学基は、感光リンカーを使用せずに光変換され、ECMタンパク質15の結合を可能にする。感光リンカーの欠如は、パターン化されたカバーリップが7ヶ月以上室温で安定したままであることを可能にします15.この方法はクリーンルームおよびフォトリソグラフィ装置の使用を避け、より少ない専門訓練を必要とする。しかし、フォトマスクの要件は、パターンの容易に利用可能な変更を必要とする実験のための実質的なハードルをまだ提起します。
また、2D表面にECMタンパク質を制御して細胞の形状を操作する方法に加えて、細胞を3D微細構造に閉じ込めることで細胞形状を制御する方法も模索しています。多くの研究は、胚、細菌、酵母および植物16、17、18、19における形状依存性生物学的プロセスを調査するために、2Dではなく、PDMSチャンバーを生成するために、上記のソフトリソグラフィーベースのアプローチを適応させた。二光子重合(2PP)はまた、ナノメートル分解能20で複雑な3Dヒドロゲル足場を作り出すことができる微細加工技術としてリードを取った。2PPは、2光子吸着の原理に依存しており、フェムト秒パルスで送達される2つの光子は、光重合体21の局所重合を可能にする分子(この場合は光発合剤)によって同時に吸収される。この技術は、ヒト組織のネイティブECM構造を模倣する3D足場を印刷するために多用されており、細胞22に低い光化学的損傷を誘導することが示されている。
10年前のマイクロフォトパターニングのデビューにより、研究者はアクセス不能で特殊な機器を避けながらマイクロパターンを製造する機会を得ました。マイクロフォトパターン化は、赤外線レーザー23,24を用いて活性ガラス表面に被覆されたポリビニルアルコール(PVA)の選択的領域を熱的に除去することにより、ミクロンスケールのパターンを作成する。PVAではなく下層ガラス表面のみを取り付けるECMタンパク質は、制御された拡散ダイナミクスと細胞形状を可能にする生化学的手掛かりとして機能します。また、パターンをリアルタイムで容易に変更できるため、柔軟性も高くなります。ここでは、商用のマルチフォトンイメージングシステムを用いてマイクロフォトパターニングのステップバイステッププロトコルを提供する。記述されたプロトコルは大きいパターンの急速で自動化された製造のために設計されている。これらのパターンは、細胞-ECM接着の幾何学的形状を拘束することによって、細胞形状を効率的に制御することを実証した。最後に、記述されたパターン化技術がアクチン細胞骨格の組織とダイナミクスを調節することを実証する。
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Protocol
1. カバースリップ前処理
- ウォーターマンストア、199825に記載されているようにキーキークリーンなカバーリップを準備します。
- 1%(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS)溶液を調製し、穏やかな攪拌で10分間溶液中のカバーリップをインキュベートします。カバーリップがソリューション内で自由に動かされることを確認します。
- カバーリップをdH2Oで2回洗浄し、それぞれ5分間洗います。
- 0.5%グルタルアルデヒド(GA)溶液を調製し、シェーカー上で30分間溶液中のカバーリップをインキュベートします。25のカバーリップの場合、グルタルアルデヒド溶液の50 mLを使用してください。カバーリップがソリューション内で自由に動かされることを確認します。
- カバーリップをdH2Oで3回洗浄し、それぞれ10分間洗います。
- カスタムメイドのカバースリップスピナーを使用して、30 s用のスピンドライカバーリップ。カバースリップスピナーの詳細な説明は26 で公開されており、オンラインで入手できます(https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/)。活性のカバーリップは、互いに離れて立つために、分割器付きの箱に+4 °Cで最大1ヶ月間保存することができます。
2. PVAコーティング
- PVA(98%加水分解PVA、MW 98000)とdH2Oを混合して、5.6%溶液を作ります。
- 90°Cの水浴で混合物を可溶化し、高温の間にバイオセーフティキャビネットの0.2 μmフィルターを通してすぐにフィルターします。沈殿した場合は、ストックソリューションを再度フィルタリングします。PVA溶液は、室温で3ヶ月間保存することができます。
- 15 mLチューブで、8つの部品PVAに1つの部品HClを追加します。チューブを慎重に数回反転して混ぜます。
- 混合溶液2 mLを35mmのペトリ皿に注ぎ、清潔で前処理されたカバースリップを液体に浸し、カバーリップが底にくっつかないように注意します。シェーカーで室温で5分間インキュベートします。
- ソリューションからカバーリップを慎重に取り外します。カバースリップスピナーを使用して、40 sのスピンコートを使用します。その間に、ピンセットをきれいにします。カバースリップを箱に移し、一晩+4°Cで乾かします。PVAコーティングカバーリップは+4 °Cで2週間まで保存できます。
3. 多光子顕微鏡の構成
注:説明されたプロトコルは、アップライトまたは反転マルチフォトンイメージングシステム、特にハードウェアオートフォーカスが装備されていないシステム上で、所望の形状とサイズの細胞接着マイクロパターンを作成するように調整されています。したがって、すべての視野(FOV)について、パターン作成スクリプトはカバースリップ上に受託マーカーを作成するために小さな領域を省略し、ソフトウェアオートフォーカスを使用して顕微鏡をカバースリップ表面に焦点を合わせ、所望のパターンを省略する。隣接するFOVのループでこのスクリプトを実行すると、細胞の形状を制約し、細胞内生物学的プロセスの活性を調節するマイクロパターン(5 x 5 mm以上)の大規模な配列が堅牢に作成されます。記載されたプロトコルは、ニコンA1R MP +NIS-Elementsソフトウェアによって制御されるイメージングシステムのために開発されました。別のベンダーのイメージングシステムをパターニングに使用する場合は、光学式構成とパターン化スクリプトを製造元の指示に従って調整する必要があります。
- 顕微鏡ソフトウェアをオンにします。「Apo LWD 25X/1.10W DIC N2」の目的が顕微鏡に取り付けられていることを確認してください。
注: ここで説明するプロトコルは、25x/1.1 NA 水浸漬目的に最適化されていますが、他の目的もパターニングに使用できます。読者は、高度化の目的(例えば、40xと60x)でパタパタとする時間が長くなるので、各FOVでアブレートされるパターンの数が大幅に減少することに注意してください。低倍率目標は、PVA層を取り除くのに十分なFOVおよびレーザーパワーを均等に照射する限り、パターニングに使用できます。 - A1plus MP GUIウィンドウで、レーザーラインを 750 nm に設定します。
- 「イメージ」光構成の設定
注: NIS-Elements は、顕微鏡ハードウェアを制御するためのいくつかのツール(グラフィカルインタフェース、取得ワークフロービルダーJOBS、光学式構成、マクロ)をユーザーに提供します。このプロトコルでは、ハードウェア制御の大部分は、ND取得およびND刺激モジュールだけでなく、様々な光学構成を介して達成されます。- [ キャリブレーション ] タブで、[ 新しい光学式設定] をクリックします。光学式構成に「イメージ」という名前を付けます。これは、反射率を通してカバースリップのイメージングを可能にするベースライン光学構成です。その他のオプションはすべてデフォルトのままにして、適切な目的を選択します。
- A1plus MP GUIウィンドウで、[設定]ボタンをクリックして、この光設定でハードウェア設定を構成します。刺激レーザーをIR スティムに設定し、光路にビームスプリッタ(BS 20/80)を配置し、スキャナユニットをガルヴァーノに設定し、適切なスキャン解除された検出器を選択します。
- A1plus Compact GUIウィンドウで、カバースリップ上の小さなフィーチャをキャプチャするのに十分なスキャン サイズとドウェルタイムを選択します(システム上でそれぞれ 1.1 ms と 1024 ピクセル)。[標準] ボタンをクリックすると、ライン平均化やラインの統合は実行されません。[IR レーザーを使用]ボックスがオンになっていることを確認します。単純にするために単方向スキャンを設定します。
注: スキャン速度が問題となる場合は、双方向スキャンを使用できます。 - 同じウィンドウで、レーザーパワーと検出器感度を調整して、カバースリップ表面の明るいが飽和していない画像を得ます。レーザーパワーを最大電力と検出器感度の5%("HV"スライダ)を15Vに設定するのが良い出発点です。
- A1plus スキャンエリアウィンドウで、ズームを 1 に設定して、FOV 全体をキャプチャします。
- オプティカル構成を保存します。
- 「Print_Fudiciary_Marker」光構成の設定
- 「イメージ」光学式構成を複製し、「Print_Fudiciary_Marker」と名前を変更します。
- A1plus コンパクト GUIウィンドウで、スキャンの最小サイズとドウェルタイム (システム上ではそれぞれ 64 ピクセルと 80.2 ミリ秒) を選択します。
- この工程では撮像が不要なので、検出器感度を0に設定し、レーザーパワーを30%に上げます。レーザーパワーが高いほど、所望の領域のカバースリップ上のPVA層が熱的に除去されます。
- A1plus スキャンエリアウィンドウで、ズームを最大 (システムでは 15.87) に設定し、FOV の中央にスキャンエリアを配置します。
- ND取得ウィンドウで、Zスタック実験を設定します。Z 位置の移動を相対位置に設定し、適切な Z デバイスを選択します。ステップサイズを2μmに、スタック深さを10μm上方と下に設定して、顕微鏡ステージの不均一、または隣接するFOV間のPVA表面を考慮します。
- 「オートフォーカス」光構成の設定
- 「イメージ」光学式設定を複製し、「オートフォーカス」に変更します。
- A1plus スキャン領域ウィンドウで、FOVが受託マーカーよりわずかに大きくなるようにズーム係数を小さくします。これにより、カバースリップ上の他の小さなフィーチャーが自動焦点を妨げなくなります。
- [ デバイス] メニューの [ 自動フォーカスの設定] を選択します。Z スタック実験でスキャンの厚さを Z スタックの厚さに設定します(ステップ 3.5.5 を参照)。顕微鏡はこの範囲をスキャンし、受託者マーカーを使用して最もよい焦点面を見つける。ステップサイズはデフォルトのままにします。
- 「Load_ROI」光構成の設定
- 「イメージ」光学式構成を複製し、名前を「Load_ROI」に変更します。
- A1plus コンパクト GUIウィンドウで、ROI マスクと同じスキャン サイズを設定します。この光学式構成は、ROI マスクがロードされるイメージをキャプチャするために使用されます。解像度と速度の最適なバランスを実現するために、2048ピクセルを使用しました。
注: このキャプチャされたイメージは ROI マスクと同じサイズにする必要があります。
- 「マイクロパターン」光構成の設定
- 「Print_Fiduciary_Marker」光学構成を複製し、名前を「マイクロパターン」に変更します。
- ズーム倍率を 1 に設定します。
- A1plus MP GUIウィンドウで、PVAを取り込むために刺激レーザーパワーを増やし、適切なスキャン速度(それぞれ実験で40%と32 s/frame)を選択します。
- ND刺激ウィンドウで、ND刺激実験を設定します。時間スケジュールにいくつかのフェーズを追加し、それぞれを刺激として設定します。刺激領域と持続時間が正しいことを確認します。
注: この光学構成で使用されるレーザーパワーだけでなく、PVA層の厚みや平滑度に応じて、フェーズ数を調整できます。 - 同じウィンドウで、各フェーズの前に StgMoveMainZ(-1.000,1) 関数を有効にします。これは、Z 方向の偏差を再度説明します。
注: 目的が移動する距離と方向は、PVA レイヤーの厚さと滑らかさに応じて調整できます。
- 「Label_Surface」光構成のセットアップ
- 「Print_Fudiciary_Marker」光学構成を複製し、名前を「Label_Surface」に変更します。
- A1plus コンパクト GUIウィンドウで、レーザーパワーを大幅に増加し、ズームを 1 に設定します。ここで使用される高いレーザーパワーは、物理的にガラスカバースリップを損傷し、肉眼で見えるラベルを生成します。これは、さらなる実験でパターンを見つけるのに役立ちます。
4. ROI マスクの生成とマクロの設定
- ROI マスクの生成
- Adobe Photoshop または利用可能な他のソフトウェアを使用して、2048 × 2048 RGB 画像を生成します。画像は顕微鏡下のFOV(すなわち 、532.48×532.48 μm、0.26 μm/ピクセル)に対応しています。イメージには、背景が黒 (0, 0, 0) である必要があります。
注: 多くの市販および無料のイメージ エディターを使用して、レーザー支援マイクロパターニング用の ROI マスクを生成できます。我々は、マスクを生成するためにアドビフォトショップを使用していますが、GIMPとImageJ / フィジーは、代替無料のオプションとしても利用可能です。 - 黒の背景に 8 ~ 12 の白 (255,255,255) パターンを描画します。パターンサイズは、セルの種類によって異なります(直径は200ピクセル程度)。自動焦点を合わせるためのイメージの中央に 500 × 500 の空白領域を残します。隣接するパターン(>200ピクセル)とFOVのボーダーとの間に十分なスペースを残して、最適なアブレーションとセルアタッチメントを行います。このプロトコルで提示されたパターンは Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) で使用できます。
- Adobe Photoshop または利用可能な他のソフトウェアを使用して、2048 × 2048 RGB 画像を生成します。画像は顕微鏡下のFOV(すなわち 、532.48×532.48 μm、0.26 μm/ピクセル)に対応しています。イメージには、背景が黒 (0, 0, 0) である必要があります。
- マクロの設定
- [ マクロ ] メニューの [ 新しいマクロ] をクリックします。
- Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) で使用可能な 「Pattern_Stimulation」コードを「新規マクロ 」ウィンドウにインポートします。このコードを適切なフォルダーに保存します。
- 別の新しいマクロウィンドウを開き、Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) で利用可能な "Stage_Movement" コードをインポートします。このコードの"Stage_Movement"作業ディレクトリが、手順 4.2.2 の作業ディレクトリと同じであることを確認します。手順 4.2.2 の同じフォルダに"Stage_Movement" コードを保存します。
5. 写真アブレーションを用いたマイクロパターンの生成
- 顕微鏡とその付属品をオンにします。この前に、IRレーザーが十分にアップしていることを確認してください。
- PVAコーティングされたカバースリップをホルダーに移します。直立顕微鏡の場合は、PVA表面が面を下にアブレートすることを確認します。
- コーナーに水を加え、カバースリップを安定させ、ホルダーを顕微鏡ステージに取り付けます。
- 目的を下げ、カバースリップに水を加えます。
注: ここで説明するプロトコルは、25x/1.1 NA 水浸しの目的に最適化されています。乾燥または油浸し目的が使用される場合、水は適切な浸漬媒体に置き換える必要があります。水浸漬目的を使用して大きなマイクロパターンアレイを生成する場合、蒸発が問題になる可能性があります。この場合、水は薬局から入手可能な市販の目の潤滑剤であるGenTealに置き換える必要があります。 - 顕微鏡ソフトウェアで 、A1plus MP GUIウィンドウでIRレーザーシャッターをオンにします。 自動調整 ボタンをクリックして、パターニングの前にレーザーを整列します。
注: レーザーパスの小さな偏差がパターンの品質に大きく影響するため、各パターニングセッションの開始時にレーザー自動調整を行うことが重要です。 - 「イメージ」光構成に切り替えます。 A1plus Compact GUI ウィンドウで、[ スキャン ] をクリックして FOV をスキャンし、目的をカバースリップにゆっくりと近づけます。
- 画像を注意深く監視します。最初は、画像が非常に薄暗く表示されます。画像の明るさが上がるまで、目的をカバースリップに近づけます。これは、目的に向いているカバースリップサーフェスです。明るさが減少し、再び増加するまで、目的を移動し続けます。これはパターン化される PVA サーフェスです。この表面上の小さな特徴(カバースリップの欠陥、ほこり など)に焦点を当て、Zドライブにゼロを設定します。フォーカスを設定した後は常にゼロに設定します。
注:カバースリップの両方の表面はPVAでコーティングされていますが、ガラスの光学特性はPVAコーティングによって大きく変化しません。私たちは、乾燥した、水、油浸しの目的を持つそのようなカバーリップを日常的に画像化し、イメージングを妨げる非パターンPVA表面を見つけることができませんでした。 - 「Label_Surface」光構成に切り替えます。[ キャプチャ] をクリックします。「イメージング」光学構成に戻り、スキャンします。ガラス表面が損傷し、アモルファスに見える必要があります。損傷した領域は肉眼で見え、さらなる実験におけるパターンの位置を示す。
注: 表示ラベルのサイズを大きくするには、複数の隣接する FOV で手順 5.8 を繰り返します。 - 目的がカバースリップのほぼ中央にあることをもう一度確認してください。目的とカバースリップの間に十分な水があることを確認します。ガラス粒子を避け、確認するためにスキャンするために、ステージを1〜2個のFOVで移動します。
- [デバイス]メニューで、Stage_Movementマクロを開きます。Pattern_Stimulation作業ディレクトリが正しいことを確認します。そうでなければ、刺激は起こりません。変数"PatternLength"と"パターンの高さ"をパターン化する FOV の所望の数に設定します。マクロを保存して実行します。
- パターニングが完了したら、「イメージング」光学構成に切り替えます。ここでも、IRレーザーシャッターが A1plus MP GUI ウィンドウで開いているか確認してください。
- ステージを移動してパターンを表示します。パターンをスキャンして品質を確認します。
- パターンを上に向けて、カバースリップをグリッドボックスに転送します。
- 使用前に1週間まで+4 °Cでパターンのカバーリップを保管してください。
6. フィブロネクチン吸着
- 1 M NaOH溶液で新鮮な1 M NaBH4 を作ります。0.2 Mエタノールアミンを含むpH 8.0リン酸緩衝液に対して1:100の比率で加える。
- パターン化されたカバーリップを35mmティッシュ培養皿に移す。上記の溶液1 mLで各カバースリップを8分間インキュベートして自家蛍光を急いで、PBSで3回リンスします。
- フィブロネクチン(FN)をPBSで10μg/mLの最終濃度に希釈する。カバースリップを+37°Cで1時間FNにインキュベートします。
注:ECMタンパク質の基質への実質的な非特異的結合が観察される場合、FNは0.1%プルロニックF-12724を含むPBSで希釈することができる。 - カバースリップをPBSで2回洗います。すぐに使用しない場合は、一晩で+4 °CでPBSで保存してください。
7. セルの添付
注: 次のプロトコルは、ヒトの歯肉線維芽細胞に最適化されています。
- 10cmの細胞を70%合流に培養する。
- +37 °Cの水浴中の細胞培養培地、PBSおよび0.05%トリプシンを温める。
注:基質に弱く接着する細胞の場合、非タンパク質分解液とversene(0.48 mM EDTA)または独自の酵素フリーバッファーがパターンへの細胞の付着性を高める可能性があり、考慮する必要があります。 - 細胞を播種する前に、パターン化されたカバースリップを1 mLの温かいPBSを含むきれいな35mmティッシュ培養皿に再配置する。
- 10cm組織培養皿から細胞培養培地を吸引し、PBSで1回洗浄する。
- 700 μLの 0.05% トリプシン/EDTAを皿に加え、+37 °Cで細胞をインキュベートし、5%のCO2 インキュベーターを1分間インキュベーターします。
- その間、パターン化されたカバースリップを覆うPBSを吸引し、1mLの細胞培養培地を加える。
- セルが切り離されていることを確認します。その後、細胞培養培地10mLでトリプシン化細胞を再懸濁し、パターン化されたカバースリップに1mLを加える。
- 培養器内の培養細胞を2〜3時間培養し、十分な数の細胞がパターンに結合しているかどうかを確認する。その場合は、メディアを 1 回変更して、接続されていないセルを削除します。これにより、複数のセルが同じパターンに着陸する可能性が最小限になります。
メモ:添付時間はセルの種類によって異なる場合があります。 - さらに3〜4時間後、または十分な数の細胞がパターン上に広がった場合、細胞はさらなる実験の準備ができている。細胞分裂を避けるために、あまりにも長く待たないでください。
8. データ取得
- 細胞骨格緩衝液27 内に4%PFAの細胞を室温で10分間固定する。
- 目的のタンパク質に対して確立された免疫蛍光プロトコルに従ってください。PVAコーティングカバーリップは、あらゆる免疫蛍光プロトコルでうまく機能します。
- 適切な顕微鏡を用いて細胞の画像を取得します。実験の目的に応じて、FOVごとに1つまたは複数のセルを画像化します。
9. 画像解析
注:次のプロトコルは顕微鏡のイメージのZスタックから多数の細胞の関心の蛋白質の平均蛍光信号を得ることを可能にする。
- 取得した画像をNIS要素で開き、画像をトリミングします。各画像に適切に広がるセルが 1 つだけ含まれていることを確認します。画像処理の詳細な手順は、以下のスクリプトで見つけることができます。
- アナコンダをインストールし、アナコンダナビゲーターを介してスパイダーを起動します。
注: .pyスクリプトは、要件で特定された適切なパッケージを使用して、任意の環境で実行できます.txt。Anaconda には、以下のコードに必要なパッケージのほとんどが含まれているため、Anaconda をお勧めします。 - Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) からスクリプトをダウンロードし、Spyder(3チャンネルまたは 4 チャンネルのイメージの場合は"Pattern_Averaging_3Channels.py"または"Pattern_Averaging_4Channels.py")で開きます。
- 取得した画像に基づいてパラメータを設定します。詳細については、スクリプトを参照してください。
- F5 キーを押してスクリプトを実行します。進行状況はコンソールパネルで追跡できます。
- 同じフォルダーに保存されている出力ファイルを取得します。出力イメージは、すべてのサンプルの各チャンネルの平均です。エクセルシートは、サンプルセル内の各チャンネルの平均強度を示し、定量分析を可能にします。
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Representative Results
マイクロパターン化によって得られる実験データの質は、パターンの品質に大きく依存する。上記の方法で生成されるパターンの品質を決定するために、最初に反射率顕微鏡を使用して、カバースリップの写真のアブスレート領域の形状と大きさを評価しました。個々のパターンはアブレーションマスクと非常によく似ており、透明なボーダーと、光を均一に反射する表面を表示していることがわかりました(図2B)。望ましい細胞骨格の建築に応じて様々な形状やサイズを印刷することができますが、私たちは私たちの目的に最も適したクロスボウ形状を使用しました。原子間力顕微鏡(AFM)は、このようなパターンは高さが約140nmであり、全体を通して最小限の位相変化を伴う滑らかな表面を有することを明らかにした(図2F)。低レーザーパワーや不適切な焦点面などの最適でないパターニング設定により、不均一なトポロジを持つ暗い部分パターンとして現れるPVA表面の不完全な除去が生じる(図2C)。レーザーパワーを高く設定しすぎるとPVAの「バブリング」が生じ、極端な場合、覆い表面の損傷も望ましくない(図2D)。
予備実験では、単一のカバースリップで複数のFOVを減らしてパターニング領域を増やそうとしました。このアプローチは、原則として機能しますが、顕微鏡スタンドのZドリフトとカバースリップのわずかな傾きのために信頼性が低く、退屈であることがわかりました。多数のFOVに対して自動で高品質なパターンを実現するため、パターニングプロセスで顕微鏡の焦点を合わせる精度を向上させるカスタマイズされたマクロを実装しました。多光子顕微鏡は狭い焦点面の高い力でPVAを効率よく分解するパルスレーザーを採用し、サンプル内のいかなる不均一または傾きに敏感なパターン化プロセスを作り出す。その結果、各FOV内の正確な焦点面を特定することが重要です。これは、わずか1〜2ミクロンの偏差がパターニングプロセスを実りのないものにすることができるので、完璧なフォーカスモジュールを欠いているシステムにとってさらに問題になります。この問題に対処するために、カスタマイズされたマクロスクリプトは、まず、比較的厚いZスタック(≈20 μm)をスキャンするだけで、ほぼ焦点を合わせる必要がある各新しいFOVの中央にある小さな正方形をパターン化します。顕微鏡は、画像のスタックを素早くスキャンし、最適な焦点面を識別するためにNIS要素自動焦点関数を使用します。次に、パターンマスクをロードし、IR刺激を起こすために刺激ROIとして設定します。ステージは次の FOV に移動し、このプロセスを繰り返します。さらに、顕微鏡ステージの動きの方形の方形のパスは、順次FOV間の誤差蓄積を最小限に抑えました。このプロトコルを使用することにより、カバースリップの3.5 x 3.5mm面積を3時間未満でカバーする49個の顕微鏡FOVで構成されるパターンを日常的に製造しています。
非摂動PVAではなくパターン化された領域がECMタンパク質を吸着できるかどうかをテストするために、パターン化されたカバーリップを10 μg/mL FNでコーティングし、抗FN抗体で染色しました。広視野蛍光顕微鏡を用いて、レーザーアブレーションによってPVAが除去されたパターン化された領域にFNが均一に吸着することを発見した(図2E)。
細胞骨格のアーキテクチャとテンション分布をパターンに合わせて変更できるかどうかを判断するために、パターン化されたカバーリップに細胞を播種し、蛍光顕微鏡を通じて収縮性のマーカーであるミオシン軽鎖の分布を可視化しました。最初の播種後、細胞は徐々にカバースリップに向かって引き寄せられました。パターン化された領域に着陸したものは、時間の経過とともにパターンの形に取り付けられ、広がった。PVAに着陸したものは、緩やかに取り付けられ、数回のワッシュとメディアの変更の後に取り除かれました。我々は、ラメリポディアのアクチン密度リム、両側に沿った厚い腹側ストレス繊維、および横円弧で接続されたラメリポディアから発せられる背筋応力繊維を含む、異型線維芽細胞構造を示すパターンに広がる細胞を発見した(図3A)。ミオシン軽鎖(MLC)は密なラメリポディアリムの後ろに座り、アクチンバンドルに沿って縞模様を表示した。多くの細胞の平均画像で示されるように、この表現型は多数のパターンにわたって一貫していた(図3B)。
図 1.IRレーザー支援マイクロパターニング(マイクロフォトパターニング)の概略図。(A)ガラスカバーリップは、APTMS、GAおよびPVAと化学的に結合され、それぞれの順序で行う。PVA表面は細胞および蛋白質に対して非粘着性である。(B)PVAは、IRレーザーによってプリセットパターンで除去される。(C) パターン化されたカバーリップは、パターン化された領域にのみ吸着する ECM タンパク質でコーティングされています。(D) 細胞は、目的のタンパク質に対して、カバースリップ、固定、免疫染色にメッキされます。パターン化された島に着陸する細胞は、特徴的な細胞骨格構造を生み出すパターンの形に広がり、PVAに着陸する細胞は球形のままです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.マイクロパターンの検証と特性評価。(A)IRレーザーは顕微鏡ステージでマイクロパターニング(マイクロフォトパターン化)を行う。IRレーザーは、複数のFOVでPVAを熱的にアブラ化します。(B) A透明な下宿板を有し、ROIマスクと同一であるマイクロパターンの顕微鏡画像。(C)最適でないレーザーパワーに起因するPVAの不完全除去の反射率顕微鏡画像。(D)過剰なレーザーパワーに起因するPVAバブリングの反射率顕微鏡画像。(E)抗FN一次抗体およびフルオロフォア共役二次抗体で染色されたFN被覆パターンのカバーリップの免疫蛍光画像。(F) AFM トポロジ スキャン ラインとクロスボウ パターンの代表的な AFM イメージ。マイクロパターンのトポロジを測定するために、コンタクトモードイメージングは、NanoWizard 4原子間力顕微鏡に搭載されたBruker AFMプローブ(MLCT-B)を用いて行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.マイクロパターンにメッキされた細胞の代表的な画像。 (A) アクチンおよびMLCに対して免疫染色されたクロスボウパターンにメッキされた原発ヒト歯肉線維芽細胞の代表的な画像。画像は100xの目的を備えた共焦点顕微鏡で得られた。(B) カスタム Python スクリプトによって生成されたクロスボウパターンにメッキされた細胞におけるアクチンおよび MLC の平均免疫蛍光画像。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
上記の結果は、記述されたIRレーザー支援マイクロパターン化(マイクロフォトパターン化)プロトコルが、細胞形状および細胞骨格アーキテクチャの操作を可能にする様々な形状の再現可能な付着パターンを提供することを示している。マイクロフォトパターニングのデビュー前と後の両方で多くのマイクロパターン化法が開発されてきたが、この方法には複数の利点がある。第一に、通常はエンジニアリング部門内にしか存在しない特殊な機器やクリーンルームは必要ありません。実際、多光子顕微鏡が生物学部門でより一般的になりつつあるため、マイクロフォトパターン化は多光子顕微鏡の用途を拡大し、ユーザーの潜在的なプールに追加されます。パターンは、長いリソグラフィプロセスを必要とする新しいマスターウエハを製造する代わりに、オンデマンドで変更してすぐに印刷することもできます。
既存のマイクロフォトパターニングプロトコルと比較して、私たちのプロトコルの1つの改善は、カバースリップ調製中にいくつかの時間のかかる硬化ステップの除去です。PVAカバースリップアタッチメントの品質は、パターンがまだそのままであり、製造後2週間でも細胞を結合する可能性があり、妨げられていないことを示しています。さらに重要なことは、各FOV24の位置を事前設定する必要がなくなり、パターニングプロセスの自動化を改善しました。その代わりに、各FOVの最適な焦点面を正確に特定しながら、大きな領域のパターン化を可能にする理解しやすいマクロを実装します。
プロトコルのマクロは、当社のシステム上のパターニングの自動化を可能にしますが、我々はすべての市販のレーザースキャン顕微鏡は、他の人とほとんど互換性がない独自のソフトウェアが付属していることを理解し、他のシステム上で私たちの正確なプロトコルを実装することは困難になります。しかし、全体的なワークフローは、自動マイクロパターニング、すなわち個々のFOVに焦点を当て、マスクをロードし、PVAをアブローイングし、顕微鏡ステージを新しいFOVに移動させるプロセスを容易にするために、他の商用システムにうまく適応させることができます。
パターニングプロトコルのいくつかのステップは、効率的なパターニングを確実にするために細心の注意を払って行われるべきです。最も重要なステップは、パターンを生成する前に刺激条件を最適化することです。マルチフォトン顕微鏡では、2つ以上の光子が蛍光分子にほぼ同時に到着し、エネルギーを組み合わせて蛍光を励起する必要があります。この低確率イベントは、信号対雑音比28を増加させる極めて薄い光学セクションを作成します。イメージングには有益ですが、この機能により、薄いPVAコーティングの除去はサンプルのZ位置に非常に敏感になります。これに対抗するために、いくつかの対策を実施することができます。まず、レーザーパワーは、ポリマーを「沸騰」したり、ガラスカバースリップを損傷することなく、PVAを完全に除去するように微調整する必要があります。PVAの除去が一貫して不完全である場合、通常はレーザーパワーが増加するため、レーザーの位置合わせを確認することをお勧めします。第二に、サンプルの傾きを避けるために顕微鏡の段階を平準化する必要があり、不完全なパターンが生じる可能性があります。複数の Z 位置での IR 刺激も、PVA 層がターゲットになるように設定する必要があります。あるいは、顕微鏡に完全な焦点モジュールが装備されている場合、PVAターゲティングのためのZ位置の最適オフセットを決定するための予備試験を実施することができる。もう一つの重要なステップは、自動でパターン刺激を可能にする顕微鏡マクロを設定することです。マクロは、サンプルの傾きや表面の不均一性による複雑さを避けるために、新しい各FOVの焦点面を見つける必要があります。また、ステージが行から行へ S 字型で移動できるようにし、双方向スキャンで使用されるパスに似た形で、Z の連続する FOV 間の偏差を最小限に抑える必要があります。
記載されるプロトコルの1つの制限は、多数のパターン化されたカバーリップを生成するのに要する時間であり、リソグラフィベースのマイクロコンタクト印刷29、30によって提供される比類のない利点である。その結果、このプロトコルは、限られた数の条件が必要な実験や、パターンの形状やサイズの調整が容易に可能な実験に最適です。さらに、ハードウェアオートフォーカスモジュールを欠いているシステムでは、一連の刺激イベントを異なるZ面に統合し、PVA除去を自動化し、効果的に行います。IR刺激は最も時間のかかるステップであるため、各刺激イベント(〜30秒)を添加すると、パターニングプロセスが大幅に長くなります。時間が懸念される場合は、ステップサイズを小さくしてオートフォーカスを微調整することをお勧めします。これにより、必要なIR刺激イベントの数を減らす最適な焦点面の同定が容易になります。今回の実験では、刺激イベントの数を5から2に減らすと、時間が半分(1.5時間)短縮されます。
結論として、我々が記述するIRレーザー支援マイクロパターン化(マイクロフォトパターン化)プロトコルは、IRレーザー装備顕微鏡にアクセスできるあらゆるラボで使用することができます。細胞骨格アーキテクチャとシグナル伝達経路を研究することに加えて、この技術は、細胞間変動に敏感な薬物スクリーニングおよび他のアプリケーションにも適用することができる。
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Disclosures
著者らは利益相反を明らかにしていない。
Acknowledgments
この研究は、コノート基金の新調査官賞(S.P.、カナダイノベーション財団、NSERCディスカバリー補助金プログラム)(RGPIN-2015-05114とRGPIN-2020-05881)、マンチェスター大学とトロント大学共同研究基金、トロント大学XSeedプログラムによって支援されました。C.T.はNSERC USRAフェローシップによって支えられていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
References
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