Summary
여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.
Abstract
Micropatterning은 자연적인 세포 대 세포 변이에서 발생하는 합병증을 우회하면서 세포 구획의 형태와 기능 사이의 연결을 연구하는 데 사용되는 세포 생물학 커뮤니티에서 확립 된 기술입니다. 세포 모양을 표준화하기 위해 세포는 3D 금형에 국한되거나 접착제 섬을 통해 접착제 형상을 제어합니다. 그러나 포토리소그래피와 딥 UV 에칭을 기반으로 하는 기존의 마이크로패턴 기술은 클린룸이나 특수 장비에 크게 의존합니다. 여기서 우리는 도일 외에서 변형된 적외선 레이저 보조 마이크로패터닝 기술(microphotopatterning)을 제시하여 시판되는 이미징 시스템으로 편리하게 설정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 Nikon A1R MP+ 이미징 시스템을 사용하여 폴리 비닐 알코올 코팅 커버립의 사전 설정 영역을 축산하는 적외선(IR) 레이저를 통해 미크론 정밀도로 마이크로패턴을 생성합니다. 우리는 하드웨어 자동 초점이 장착되지 않은 시스템에서 고효율과 정확도로 자동화 된 패턴 제작을 가능하게하기 위해 사용자 정의 스크립트를 사용합니다. 우리는 이 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜이 세포가 독점적으로 부착하고 원하는 모양을 취하는 정의된 패턴을 초래한다는 것을 보여줍니다. 더욱이, 셀 형상의 표준화로 인해 많은 수의 세포로부터의 데이터를 평균화할 수 있다. 고해상도 이미징 및 정량 분석과 결합된 이 프로토콜과 함께 생성된 패턴은 상대적으로 높은 처리량 스크린에 사용하여 형태와 기능 간의 연결을 중재하는 분자 플레이어를 식별할 수 있습니다.
Introduction
세포 형상은 조직 형태발생1,세포 이동2,세포 증식3및 유전자 발현4와같은 근본적인 생물학적 과정의 주요 결정자이다. 세포 형상의 변화는 혈장 막과 세포 세포 및 세포 매트릭스 유착의 기하학과 같은 외장 적 인자를 변형시키는 세포 골격의 동적 재배열 사이의 복잡한 균형에 의해 구동된다5. 예를 들어, 중간엽 세포를 마이그레이션하는 것은 플라즈마 멤브레인을 앞으로 밀어 내고 넓은 라멜리포디아6을생성하는 최첨단 액틴 네트워크를 중합하고, actomyosin 수축은 세포의 좁은 후행 가장자리를 후퇴시켜 현재 위치7,8에서세포를 분리한다. 이러한 특수 시토셀레탈 구조를 초래하는 신호 이벤트를 방해하여 모양과 극성을 분산시키고 세포 이동9을느리게 합니다. 또한, 위화 중에 상피 시트굽힘은 세포와 이웃이 쐐기 모양10이되는 원인이 되는 actomyosin 기반 의 정압 수축을 필요로 한다. 이 연구 결과는 세포 모양의 중요성을 강조하더라도, 세포 모양에 있는 내재된 이질성은 기능에 형태학을 연결하는 기계장치를 확인하기 위하여 노력을 방해했습니다.
이를 위해 지난 3년 동안 세포 모양을 조작하기 위한 수많은 접근법이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 세포세포를 3차원 몰드로 제한하거나 세포외 매트릭스(ECM) 단백질의 패턴 침착을 통해 세포 부착 기하학을 제어하는 것으로 목표를 달성하며,마이크로패터닝(11)이라고불리는 기술이다. 여기에서 우리는 수년에 걸쳐 인기를 얻은 기술의 숫자를 검토합니다.
원래 마이크로 전자 응용 프로그램에 대한 접근 으로 개척, 소프트 리소그래피 기반 마이크로 접촉 인쇄는 명백하게 컬트좋아하는되고있다 12. 마스터 웨이퍼는 먼저 포토레지스트 코팅 실리콘 기판의 영역을 광조사에 선택적으로 노출시켜 패턴표면(13)을남겨두고 제작된다. PDMS와 같은 탄성중합체는 마스터 웨이퍼에 부어 ECM 단백질을 원하는기판(11,14)으로전달하는 부드러운 "스탬프"를 생성한다. 일단 제작되면 마스터 웨이퍼를 사용하여 많은 PDMS 스탬프를 캐스팅하여 매우 재현 가능한 마이크로패턴(12)을유발할 수 있습니다. 그러나 긴 포토리소그래피 프로세스로 인해 패턴을 쉽게 조정할 수 없습니다. 이 과정은 또한 생물학 부에서 일반적으로 사용할 수없는 고도로 전문화된 장비와 클린룸이 필요합니다.
최근에는 딥 UV를 이용한 직접 인쇄는 기존의 리소그래피 기반 접근법에 의해 야기되는 한계를 우회하는 것으로 보고되었습니다. 딥 UV 광은 포토마스크를 통해 폴리 L-리신-이식-폴리에틸렌 글리콜으로 코팅된 유리 커버슬립의 선택적영역으로 전달됩니다. 깊은 UV에 노출된 화학 군은 ECM단백질(15)의결합을 가능하게 하기 위해 감광성 링커를 사용하지 않고 광변환된다. 감광성 링커가 부족하여 패턴 커버립이 7개월 이상 실온에서 안정적으로 유지될 수있습니다. 이 방법은 클린룸과 포토리소그래피 장비의 사용을 방지하고 덜 전문적인 교육이 필요합니다. 그러나 포토마스크에 대한 요구 사항은 여전히 패턴의 쉽게 사용할 수 있는 변경이 필요한 실험에 상당한 장애물이 됩니다.
2D 표면에 ECM 단백질의 제어 된 증착을 통해 세포 기하학을 조작하는 방법 외에도, 다른 3D 미세 구조에 세포를 제한하여 세포 모양을 제어하는 방법을 추구한다. 많은연구는 배아, 박테리아, 효모 및 식물16,17,18,19에서모양 의존성 생물학적 과정을 조사하기 위해 2D, PDMS 챔버가 아닌 3D를 생성하기 위해 위에서 설명한 소프트 리소그래피 기반접근법을조정하였다. 2-광자 중합(2PP)은 또한 나노미터분해능(20)을가진 복잡한 3D 하이드로겔 스캐폴드를 생성할 수 있는 미세 제조 기술로 주도권을 잡았다. 2PP는 펨토초 펄스에서 전달되는 두 개의 광자가 동시에 흡수되는 2광광흡착의 원리에 의존하며, 이 경우광중합체(21)의국소 중합화를 가능하게 한다. 이 기술은 인간 조직의 네이티브 ECM 구조를 모방하는 3D 스캐폴드를 인쇄하기 위해 크게 사용되었으며세포(22)에낮은 광화학적 손상을 유도하는 것으로 나타났다.
10년 전 마이크로포토패싱의 데뷔는 연구원들에게 접근이 불가능하고 특수장비가 없는 동시에 마이크로패턴을 제작할 수 있는 기회를 제공했습니다. 마이크로포토패터닝은 적외선레이저(23,24)를이용하여 활성화된 유리 표면에 코팅된 폴리비닐 알코올(PVA)의 선택적 영역을 열적으로 제거하여 미크로톤 스케일에 패턴을 생성한다. PVA가 아닌 기본 유리 표면만을 부착하는 ECM 단백질은 제어된 확산 역학 및 세포 모양을 가능하게 하는 생화학적 단서역할을 합니다. 이 방법은 패턴을 실시간으로 쉽게 변경할 수 있기 때문에 뛰어난 유연성을 제공합니다. 여기서, 우리는 상업적다광화상 영상을 이용하여 마이크로포토패싱의 단계별 프로토콜을 제공한다. 설명된 프로토콜은 대형 패턴의 신속하고 자동화된 제조를 위해 설계되었습니다. 우리는 이러한 패턴이 세포-ECM 접착력의 형상을 제한하여 셀 모양을 효율적으로 제어한다는 것을 입증했습니다. 마지막으로, 설명된 패터닝 기술이 액틴 세포골격의 조직과 역학을 조절한다는 것을 입증합니다.
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Protocol
1. 커버 슬립 전처리
- 워터맨 스토어, 1998년 25에설명 된 대로 삐걱 거리는 깨끗한 커버립을 준비합니다.
- 1% (3-aminopropyl) 트리메톡시실레인 (APTMS) 용액을 준비하고 부드러운 동요와 함께 10 분 동안 용액의 커버립을 배양. 커버립이 솔루션에서 자유롭게 이동해야 합니다.
- 워시 커버립은 dH2O로 각각 5분 씩 두 번 커버합니다.
- 0.5% 글루타랄데히드(GA) 용액을 준비하고 셰이커에서 30분 동안 용액의 커버립을 배양합니다. 25개의 커버립의 경우 50mL의 글루타랄데히드 용액을 사용하십시오. 커버립이 솔루션에서 자유롭게 이동해야 합니다.
- 워시 커버립은 dH2O로 각각 10분 씩 세 번 커버합니다.
- 맞춤형 커버슬립 스피너를 사용하여 30s의 드라이 커버립을 회전시합니다. 커버슬립 스피너에 대한 자세한 설명이26일 게시되었으며 온라인(https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/)에서 확인할 수 있습니다. 활성화된 커버립은 칸막이가 있는 상자에 +4°C에서 최대 1개월 동안 보관하여 서로 떨어져 서 있을 수 있습니다.
2. PVA 코팅
- PVA(98% 가수분해 PVA, MW 98000)와 dH2O를 혼합하여 5.6% 용액을 만듭니다.
- 90°C 수조에서 혼합물을 용해시키고 뜨거운 동안 생물 안전 캐비닛에 0.2 μm 필터를 통해 즉시 필터링합니다. 침전시되면 스톡 솔루션을 다시 필터링합니다. PVA 용액은 실온에서 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 15mL 튜브에서 8개의 PVA에 HCl 1부를 추가합니다. 튜브를 조심스럽게 혼합하려면 몇 번 반전하십시오.
- 혼합 용액 2mL을 35mm 페트리 접시에 붓고 깨끗하고 가공된 커버슬립을 액체에 담그고 커버립이 바닥에 달라붙지 않도록 주의하십시오. 셰이커에서 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 조심스럽게 솔루션에서 커버립을 제거합니다. 커버슬립 스피너를 사용하여 40s용 으로 코트를 회전시다. 그 동안, 핀셋을 청소. 커버슬립을 상자에 옮기고 하룻밤 동안 +4°C에서 건조시다. PVA 코팅 커버립은 최대 2주 동안 +4°C로 보관할 수 있습니다.
3. 다광현미경 구성
참고: 설명된 프로토콜은 수직 또는 반전된 다중 광자 이미징 시스템, 특히 하드웨어 자동 초점 장치가 장착되지 않은 셀 접착제 마이크로 패턴을 만들기 위해 조정됩니다. 따라서, 모든 시야(FOV)에 대해, 패터닝 스크립트는 커버슬립에 신탁 마커를 만들기 위해 작은 영역을 수축시키고, 소프트웨어 자동 초점을 사용하여 커버슬립 표면에 현미경을 집중하고, 원하는 패턴을 축산한다. 인접한 FOV용 루프에서 이 스크립트를 실행하면 세포 모양을 제한하고 세포 내 생물학적 프로세스의 활성을 조절하는 큰 마이크로 패턴 배열(5 x 5mm 이상)이 생성됩니다. 설명된 프로토콜은 NIS-Elements 소프트웨어에 의해 제어되는 Nikon A1R MP+ 이미징 시스템을 위해 개발되었습니다. 다른 공급업체의 이미징 시스템이 패터닝에 사용되는 경우 제조업체의 지침에 따라 광학 구성 및 패터닝 스크립트를 조정해야 합니다.
- 현미경 소프트웨어를 켭니다. "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" 목표가 현미경에 장착되었는지 확인합니다.
참고: 여기에 설명된 프로토콜은 25x/1.1 NA 수분 침수 목표에 최적화되어 있지만 다른 목표는 패터닝에도 사용할 수 있습니다. 독자는 각 FOV에서 절단된 패턴의 수를 크게 줄이기 때문에 높은 배율목표(예:40x 및 60x)를 가진 패터링하는 데 시간이 더 오래 걸린다는 것을 알고 있어야 합니다. 낮은 배율 목표는 FOV 전체에 균일한 조명을 제공하고 PVA 층을 축출하기에 충분한 레이저 전력을 제공하는 한 패터닝에 사용할 수 있습니다. - A1plus MP GUI 창에서 레이저 라인을 750 nm로 설정합니다.
- "이미지" 광학 구성 설정
참고: NIS-Elements는 현미경 하드웨어를 제어하는 몇 가지 도구(그래픽 인터페이스, 획득 워크플로빌더 JOBS, 광학 구성 및 매크로)를 사용자에게 제공합니다. 이 프로토콜에서는 대부분의 하드웨어 제어는 ND 획득 및 ND 자극 모듈뿐만 아니라 다양한 광학 구성을 통해 달성됩니다.- 교정 탭에서 새 광학 구성을클릭합니다. 광학 구성 "이미지"의 이름을 지정합니다. 이것은 반사도를 통해 커버 슬립의 이미징을 허용하는 기준선 광학 구성입니다. 다른 모든 옵션을 기본값으로 두고 적절한 목표를 선택합니다.
- A1plus MP GUI 창에서 설정 버튼을 클릭하여 이 광학 구성에서 하드웨어 설정을 구성합니다. 자극 레이저를 IR 스팀으로 설정하고, 빔 스플리터(BS 20/80)를 경경로에 배치하고, 스캐너 유닛을 갈바노로 설정하고 적절한 낙폭 검출기를 선택합니다.
- A1plus Compact GUI 창에서 커버슬립(각각 1.1ms 및 1024픽셀)의 작은 기능을 캡처하기에 충분한 스캔 크기와 거주 시간을 선택합니다. 일반 버튼을 클릭하므로 줄 평균 또는 줄 통합이 수행되지 않습니다. IR 레이저 사용 상자가 선택되어 있는지 확인합니다. 단순성으로 단방향 스캐닝을 설정합니다.
참고: 스캔 속도가 우려되는 경우 양방향 스캐닝을 사용할 수 있습니다. - 같은 창에서 레이저 전력및 검출기 감도를 조정하여 커버슬립 표면의 밝지만 포화되지 않은 이미지를 얻습니다. 레이저 전력을 최대 전력 및 검출기 감도("HV" 슬라이더)의 3~5%로 설정하면 좋은 출발점입니다.
- A1plus 스캔 영역 창에서 확대/축소를 1로 설정하여 전체 FOV를 캡처합니다.
- 광학 구성을 저장합니다.
- "Print_Fudiciary_Marker" 광학 구성 설정
- "이미지" 광학 구성을 복제하고 "Print_Fudiciary_Marker"로 이름을 바꿉니다.
- A1plus 컴팩트 GUI 창에서 가장 작은 스캔 크기와 거주 시간(각각 64픽셀 및 80.2ms)을 선택합니다.
- 이 단계에서는 이미징이 필요하지 않으므로 검출기 민감도를 0으로 설정하고 레이저 전력을 30%로 증가시킵니다. 레이저 전력이 높을수록 원하는 영역의 커버슬립에 있는 PVA 층을 열적으로 제거합니다.
- A1plus 스캔 영역 창에서 줌을 최대(시스템의 경우 15.87로 설정)하고 검색 영역을 FOV 중간에 배치합니다.
- ND 획득 창에서 Z 스택 실험을 설정합니다. Z 위치에서 상대적으로 이동을 설정하고 적절한 Z 장치를 선택합니다. 스텝 크기를 2 μm으로 설정하고 스택 깊이를 위와 아래 10 μm으로 설정하여 현미경 단계 또는 인접한 FOV 사이의 PVA 표면의 불균일성을 고려합니다.
- "자동 초점" 광학 구성 설정
- "이미지" 광학 구성을 복제하고 "자동 초점"의 이름을 바꿉니다.
- A1plus 스캔 영역 창에서 확대/축소 계수를 줄여 FOV가 신탁 마커보다 약간 큽수 있습니다. 이렇게 하면 커버슬립의 다른 작은 기능이 자동 초점 작업을 방해하지 않습니다.
- 장치 메뉴에서 자동 초점 설정 을 선택합니다. 스캔 두께를 Z 스택 실험에서 Z 스택의 두께로 설정합니다(단계 3.5.5 참조). 현미경은이 범위를 통해 스캔하고 신탁 마커를 사용하여 최고의 초점 평면을 찾을 것입니다. 단계 크기를 기본값으로 둡니다.
- "Load_ROI" 광학 구성 설정
- "이미지" 광학 구성을 복제하고 "Load_ROI"로 이름을 바꿉니다.
- A1plus 컴팩트 GUI 창에서 ROI 마스크와 동일한 스캔 크기를 설정합니다. 이 광학 구성은 ROI 마스크가 로드되는 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. 우리는 해상도와 속도 사이의 최적의 균형을 달성하기 위해 2048 픽셀을 사용했다.
참고: 캡처된 이미지는 ROI 마스크와 크기가 동일합니다.
- "마이크로패턴" 광학 구성 설정
- "Print_Fiduciary_Marker" 광학 구성을 복제하고 "마이크로패턴"의 이름을 바꿉니다.
- 확대/축소 계수를 하나로 설정합니다.
- A1plus MP GUI 창에서 자극 레이저 전력을 증가하여 PVA를 압하하고 적절한 스캔 속도(실험에서 각각 40%와 32s/frame)를 선택합니다.
- ND 자극 창에서 ND 자극 실험을 설정합니다. 시간 일정에 몇 단계를 추가하고 각 단계를 자극으로 설정합니다. 자극 영역과 지속 시간이 올바른지 확인합니다.
참고: 위상수는 PVA 층의 두께와 부드러움뿐만 아니라 이 광학 구성에 사용되는 레이저 전력에 따라 조정할 수 있습니다. - 동일한 창에서 각 단계 앞에 StgMoveMainZ(-1.000,1) 기능을 사용하도록 설정합니다. 이것은 다시 Z 방향의 편차를 설명합니다.
참고: 목표 이동이 PVA 층의 두께와 부드러움에 따라 조정될 수 있는 거리와 방향입니다.
- "Label_Surface" 광학 구성 설정
- "Print_Fudiciary_Marker" 광학 구성을 복제하고 이름을 "Label_Surface"로 바꿉니다.
- A1plus 컴팩트 GUI 창에서 레이저 전력을 크게 늘리고 줌을 하나로 설정합니다. 여기에 사용되는 높은 레이저 힘은 물리적으로 유리 커버 슬립을 손상하고 육안으로 볼 수있는 라벨을 생성합니다. 이렇게 하면 추가 실험에서 패턴을 찾는 데 도움이 됩니다.
4. ROI 마스크를 생성하고 매크로 설정
- ROI 마스크 생성
- Adobe Photoshop 또는 사용 가능한 다른 소프트웨어를 사용하여 2048× RGB 이미지를 생성합니다. 이미지는현미경(즉, 532.48 × 532.48 μm, 픽셀당 0.26 μm)의 FOV에 해당합니다. 이미지에는 검은색(0, 0, 0) 배경이 있어야 합니다.
참고: 레이저 보조 마이크로패터닝을 위한 ROI 마스크를 생성하는 데 많은 상용 및 무료 이미지 편집기를 사용할 수 있습니다. 우리는 마스크를 생성하기 위해 어도비 포토샵을 사용하지만, 김프와 ImageJ / 피지는 대체 무료 옵션으로 사용할 수 있습니다. - 검은 색 배경에 8 - 12 흰색 (255,255,255) 패턴을 그립니다. 패턴 크기는 셀 유형(직경 200픽셀)에 따라 다릅니다. 500개의 × 500개의 빈 영역을 이미지 중앙에 두고 자동 초점 조정을 합니다. 인접 패턴(>200픽셀) 과 FOV 의 보더 사이에 충분한 공간을 남겨 최적의 절제 및 셀 부착을 제공합니다. 이 프로토콜에 제시된 패턴은 Github(https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning)에서 사용할 수 있습니다.
- Adobe Photoshop 또는 사용 가능한 다른 소프트웨어를 사용하여 2048× RGB 이미지를 생성합니다. 이미지는현미경(즉, 532.48 × 532.48 μm, 픽셀당 0.26 μm)의 FOV에 해당합니다. 이미지에는 검은색(0, 0, 0) 배경이 있어야 합니다.
- 매크로 설정
- 매크로 메뉴를 클릭하고 새 매크로를 선택합니다.
- Github(https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning)에서 사용할 수 있는 "Pattern_Stimulation" 코드를 새 매크로 창으로 가져옵니다. 이 코드 조각을 적절한 폴더에 저장합니다.
- 다른 새 매크로 창을 열고 Github(http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning)에서 사용할 수 있는 "Stage_Movement" 코드를 가져옵니다. 이 코드의 "작업디렉토리"Stage_Movement 4.2.2 단계의 작업 디렉터리와 동일한지 확인합니다. 4.2.2 단계에서 동일한 폴더에"Stage_Movement" 코드를 저장합니다.
5. 사진 절제를 사용하여 미세 패턴을 생성
- 현미경과 그 액세서리를 켭니다. IR 레이저가 이 전에 충분히 워밍업되었는지 확인합니다.
- PVA 코팅 커버슬립을 홀더에 옮기. 직립 현미경의 경우 PVA 표면이 얼굴을 아래로 압하되도록 하십시오.
- 커버슬립을 안정화하고 홀더를 현미경 단계에 장착하기 위해 모서리에 물을 추가합니다.
- 목표를 낮추고 덮개 슬립에 물을 추가합니다.
참고: 여기에 설명된 프로토콜은 25x/1.1 NA 수분 침지 목표에 최적화되어 있습니다. 건조 또는 오일 침지 목표를 사용하는 경우 물을 적절한 침지 매체로 대체해야 합니다. 큰 마이크로패턴 어레이를 생성하는 데 수분 침수 목표를 사용하면 증발이 문제가 될 수 있습니다. 이 경우, 물은 약국에서 사용할 수있는 창구 판매 눈 윤활제 GenTeal로 대체해야합니다. - 현미경 소프트웨어에서 A1plus MP GUI 창에서 IR 레이저 셔터를 켭니다. 자동 정렬 버튼을 클릭하여 패킹 전에 레이저를 정렬합니다.
참고: 레이저 경로의 작은 편차가 패턴의 품질에 크게 영향을 미치기 때문에 각 패터닝 세션의 시작 부분에서 레이저 자동 정렬을 수행하는 것이 중요합니다. - "이미지" 광학 구성으로 전환합니다. A1plus 컴팩트 GUI 창에서 스캔을 클릭하여 FOV를 스캔하는 동시에 목표는 커버슬립에 가깝게 천천히 이동합니다.
- 이미지를 주의 깊게 모니터링합니다. 처음에는 이미지가 매우 어둡게 나타납니다. 이미지 밝기가 증가할 때까지 목표를 커버슬립에 더 가깝게 이동합니다. 이것은 목표에 직면 하는 커버 슬립 표면. 밝기가 감소하고 다시 증가할 때까지 목표를 계속 이동합니다. 패턴화할 PVA 표면입니다. 이 표면에 작은 기능 (커버 슬립 결함, 먼지 등)에초점을 맞추고 Z 드라이브에 0을 설정합니다. 포커스를 설정한 후 항상 0을 설정합니다.
참고: 커버슬립의 두 표면모두 PVA로 코팅되어 있지만, PVA 코팅으로 유리의 광학 적 특성은 크게 변경되지 않습니다. 우리는 정기적으로 건조, 물 및 오일 침지 목표로 이러한 커버립을 이미지하고 이미징을 방해하는 패턴이 없는 PVA 표면을 찾지 못했습니다. - "Label_Surface" 광학 구성으로 전환합니다. 캡처를클릭합니다. "이미징" 광학 구성으로 돌아가서 스캔합니다. 유리 표면이 손상되어 비정질이 나타나야 합니다. 손상된 부위는 육안으로 볼 수 있으며, 추가 실험에서 패턴의 위치를 나타냅니다.
참고: 가시 레이블의 크기를 늘리려면 인접한 여러 FOV에서 5.8단계를 반복합니다. - 목표가 대략 커버슬립의 중앙에 있는지 다시 확인하십시오. 목표와 커버슬립 사이에 충분한 물이 있는지 확인하십시오. 유리 입자를 피하기 위해 스테이지를 1~2FOV로 이동하여 확인합니다.
- 장치 메뉴에서 Stage_Movement 매크로를 엽니다. Pattern_Stimulation 작업 디렉토리가 올바른지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 자극이 발생하지 않습니다. 변수 "PatternLength" 및 "PatternHeight"를 패턴화할 원하는 FOV 수로 설정합니다. 매크로를 저장하고 실행합니다.
- 패터닝이 완료되면 "이미징" 광학 구성으로 전환합니다. 다시 말하지만, IR 레이저 셔터가 A1plus MP GUI 창에서 열려 있는지 확인합니다.
- 스테이지를 이동하여 패턴을 봅니다. 패턴을 스캔하여 품질을 확인합니다.
- 패턴이 위쪽을 향하도록 커버슬립을 그리드 박스로 전송합니다.
- 패턴 커버립을 사용 전 최대 1주일 동안 +4°C로 보관하십시오.
6. 섬유네틴 흡착
- 1 M NaOH 솔루션으로 신선한 1 M NaBH4를 만듭니다. 0.2 M 에탄올라민을 함유한 pH 8.0 인산염 버퍼에 대한 1:100 비율로 추가합니다.
- 패턴 커버립을 35mm 조직 배양 접시에 옮기. 각 커버슬립을 위의 용액 1mL로 8분 동안 배양하여 자동 불경을 해소한 다음 PBS로 3회 헹구세요.
- PBS에서 섬유넥틴(FN)을 10μg/mL의 최종 농도로 희석한다. FN의 커버슬립을 +37°C에서 1h로 배양합니다.
참고: 기판에 ECM 단백질의 실질적인 비특이적 결합이 관찰되는 경우, FN은 0.1% 플루론 F-12724를함유하는 PBS에서 희석될 수 있다. - PBS로 커버슬립을 2번 씻으시다. 즉시 사용하지 않을 경우 하룻밤 동안 PBS에 +4 °C로 보관하십시오.
7. 셀 부착
참고: 다음 프로토콜은 1차 인간 치지발 섬유아세포에 최적화되어 있습니다.
- 70%의 수렴성으로 10cm의 세포 요리를 배양합니다.
- +37°C 수조에서 세포 배양 배지, PBS 및 0.05% 트립신을 데우십시오.
참고: 기판에 약하게 부착되는 세포의 경우, 성구(0.48 mM EDTA) 또는 독점적인 효소없는 완충액을 가진 비보성 해리화는 패턴에 대한 세포 부착을 증가시킬 수 있으며 고려해야 한다. - 파종 세포에 앞서 패턴 커버슬립을 1mL 웜 PBS를 함유한 깨끗한 35mm 조직 배양 접시로 재배치한다.
- 세포 배양 매체를 10cm 조직 배양 접시에서 흡인시키고 PBS로 한 번 씻는다.
- 접시에 0.05% 트립신/EDTA의 700 μL을 추가하고 세포를 +37°C, 5% CO2 인큐베이터로 1분 동안 배양한다.
- 한편, 패턴 커버슬립을 커버하는 PBS를 흡인하고 세포 배양 매체1mL을 추가한다.
- 세포가 분리된지 확인합니다. 그런 다음 세포 배양 배지의 10mL로 트립시화 된 세포를 다시 중단하고 패턴 커버 슬립에 1 mL을 추가합니다.
- 2 -3 h에 대한 인큐베이터에서 배양 세포와 충분한 수의 세포가 패턴에 부착되었는지 확인합니다. 그렇다면 미디어를 한 번 변경하여 첨부되지 않은 셀을 제거합니다. 이렇게 하면 여러 셀이 동일한 패턴에 착륙할 가능성을 최소화합니다.
참고: 첨부 파일 시간은 셀 유형에 따라 다를 수 있습니다. - 또 다른 3-4 h 후, 또는 충분한 수의 세포가 패턴에 퍼진 경우, 세포는 추가 실험을 위한 준비가 되어 있습니다. 세포 분열을 피하기 위해 너무 오래 기다리지 마십시오.
8. 데이터 수집
- 세포 골격버퍼27에서 4% PFA로 셀을 실온에서 10분 동안 수정합니다.
- 관심 있는 단백질을 위해 확립된 면역형광 프로토콜을 따르십시오. PVA 코팅 커버립은 면역 형광 프로토콜과 잘 작동합니다.
- 적절한 현미경을 사용하여 세포의 이미지를 습득합니다. 실험의 목표에 따라 FOV당 하나 또는 여러 셀을 이미지합니다.
9. 이미지 분석
참고: 다음 프로토콜을 통해 사용자는 현미경 이미지의 Z 스택에서 많은 수의 세포에 대한 관심 있는 단백질의 평균 형광 신호를 얻을 수 있습니다.
- NIS 요소에서 획득한 이미지를 열고 이미지를 자르게 합니다. 각 이미지에 잘 분산된 셀이 하나만 포함되어 있는지 확인합니다. 이미지 처리에 대한 자세한 지침은 아래 스크립트에서 찾을 수 있습니다.
- 아나콘다를 설치하고 아나콘다 네비게이터를 통해 스파이더를 시작합니다.
참고: .py 스크립트는 요구 사항에 식별된 적절한 패키지로 모든 환경에서 실행할 수 있습니다.txt. Anaconda는 아래 코드에 필요한 대부분의 패키지가 포함되어 있으므로 권장됩니다. - Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning)에서 스크립트를 다운로드하고 Spyder("Pattern_Averaging_3Channels.py"또는 "Pattern_Averaging_4Channels.py"에서 각각 3 채널 또는 4 채널이있는 이미지에 대해 엽니 다.
- 획득된 이미지를 기반으로 매개 변수를 설정합니다. 자세한 설명은 스크립트를 참조하십시오.
- F5를 눌러 스크립트를 실행합니다. 진행 상황을 콘솔 패널에서 추적할 수 있습니다.
- 동일한 폴더에 저장된 출력 파일을 검색합니다. 출력 이미지는 모든 샘플에 대한 각 채널의 평균입니다. excel 시트는 샘플 셀 내의 각 채널의 평균 강도를 보여 주므로 추가 정량 적 분석을 가능하게 합니다.
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Representative Results
마이크로패터닝을 통해 얻은 실험 데이터의 품질은 패턴의 품질에 크게 좌우됩니다. 위의 방법으로 생성 된 패턴의 품질을 결정하기 위해 먼저 반사 현미경 검사를 사용하여 커버 슬립의 사진 압착 영역의 모양과 크기를 평가했습니다. 우리는 각 개별 패턴이 절제 마스크와 매우 유사하게 보였고 선명한 보더와 균일하게 빛을 반사하는 표면을 표시한 것으로나타났습니다(그림 2B). 원하는 사이토스켈레톤 아키텍처에 따라 다양한 모양과 크기를 인쇄할 수 있지만, 우리의 목적에 가장 적합한 석궁 모양을 사용했습니다. 원자력 현미경 검사법(AFM)은 이러한 패턴이 높이약 140nm이고전체(도 2F)에걸쳐 최소한의 토폴로지 변화로 매끄러운 표면을 가지고 있음을 밝혔다. 낮은 레이저 전력 및 잘못된 초점 평면과 같은 최적이 아닌 패터닝 설정은 고르지 않은 토폴로지(그림2C)를사용하여 어둡고 부분적인 패턴으로 나타나는 PVA 표면을 불완전하게 제거했습니다. 레이저 전력을 너무 높게 설정하면 PVA "버블링"이 발생했으며 극단적 인 경우 커버 슬립 표면 손상도 바람직하지 않습니다(도 2D).
예비 실험에서 우리는 단일 커버 슬립에 여러 FOV를 감소시켜 패터닝 영역을 증가시키려고 시도했습니다. 우리는 이 접근이 원칙적으로 작동하더라도 현미경 스탠드의 Z 드리프트와 커버 슬립의 약간의 기울기로 인해 신뢰할 수 없고 지루하다는 것을 발견했습니다. 자동화된 방식으로 많은 수의 FOV를 통해 고품질 패턴을 달성하기 위해 패터닝 과정에서 현미경 초점의 정밀도를 향상시키는 맞춤형 매크로를 구현했습니다. 다광현미경은 좁은 초점 평면에서 높은 전력으로 PVA를 효율적으로 분해하는 펄스 레이저를 사용하여 패턴화 공정이 샘플의 고르지 않거나 기울어지는 것에 민감합니다. 따라서 각 FOV에서 정확한 초점 평면을 식별하는 것이 중요합니다. 이것은 완벽한 초점 모듈이 부족한 시스템에 더욱 문제가 되는데, 이는 1~2미크론의 편차가 패터닝 공정을 결실없이 만들 수 있기 때문에 더욱 문제가 됩니다. 이 문제를 해결하기 위해 사용자 지정된 매크로 스크립트는 비교적 두꺼운 Z 스택(≈20 μm)을 스캔하여 대략적으로만 집중해야 하는 새 FOV의 중앙에 작은 사각형을 먼저 패턴으로 지정합니다. 현미경은 이미지 스택을 빠르게 스캔하고 NIS Elements 자동 초점 기능을 사용하여 최적의 초점 평면을 식별합니다. 그런 다음 패턴 마스크가 로드되고 IR 자극이 발생하기 위한 자극 ROI로 설정됩니다. 이후 스테이지는 다음 FOV로 이동하여 이 프로세스를 반복합니다. 또한, 현미경 단계 운동의 제곱파 모양경로는 순차적 FOV 간의 오차 축적을 최소화했다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 정기적으로 3 시간 미만으로 커버 슬립의 3.5 x 3.5 mm 영역을 커버 하는 49 현미경 FOV로 구성 된 패턴을 제조.
PVA가 흔들리지 않는 패턴 영역이 ECM 단백질을 흡착할 수 있는지 테스트하기 위해 패턴 커버립을 10 μg/mL FN으로 코팅하고 항 FN 항체로 염색했습니다. 넓은 필드 형광 현미경 을 사용하여, 우리는 FN이 레이저 절제(그림 2E)에의해 PVA가 제거 된 패턴 영역에 균일하게 흡착것을 발견했다.
세포골격 아키텍처및 장력 분포가 패턴에서 예상대로 수정될 수 있는지 를 확인하기 위해, 우리는 패턴 커버립에 세포를 시드하고 형광 현미경 을 통해 수축의 마커인 미오신 광 체인의 분포를 시각화했습니다. 초기 파종 후 세포는 점차 커버슬립쪽으로 몰리게 되었습니다. 패턴 영역에 착륙하여 시간이 지남에 따라 패턴 모양으로 확산되는 것입니다. PVA에 착륙한 사람들은 느슨하게 부착되어 여러 번의 세서스와 미디어 변경 후에 제거되었습니다. 우리는 세포가 라멜리포디아의 액틴 조밀 한 림, 양쪽을 따라 두꺼운 복부 응력 섬유, 횡방향 아크로 연결된 라멜리포디아에서 발산되는 등쪽 응력 섬유를 포함하여 현상전형 섬유아세포 구조를 표시하는 패턴에 퍼진 것을 발견했습니다(그림3A). 미오신 라이트 체인(MLC)은 조밀한 라멜리포디아 림 뒤에 앉아 액틴 번들을 따라 줄무늬 패턴을 표시했습니다. 많은 세포의 평균 된 이미지로 표시된 바와 같이, 이 표현형은 많은 수의 패턴(도 3B)에걸쳐 일관되었다.
그림 1. IR 레이저 보조 마이크로 패터닝 (마이크로 포토패닝)의 회로도. (A)유리 커버립은 각각의 순서대로 APTMS, GA 및 PVA와 화학적으로 결합된다. PVA 표면은 세포와 단백질에 대한 비 접착제입니다. (B)PVA는 IR 레이저에 의해 사전 설정된 패턴으로 제거된다. (C)패턴 커버립은 패턴 부위에만 흡착되는 ECM 단백질로 코팅됩니다. (D)세포는 관심 있는 단백질을 위해 커버립, 고정 및 면역염색에 도금됩니다. 패턴 섬에 착륙 하는 세포는 특징적인 사이토셀레탈 구조를 초래 하는 패턴의 모양으로 확산, PVA에 착륙 하는 그 구형 남아 있는 동안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 마이크로패턴 유효성 검사 및 특성화. (A)IR 레이저 보조 마이크로패싱(microphotopatterning) 현미경 단계의 설정. IR 레이저는 여러 FOV에서 PVA를 열적으로 분해합니다. (B)명확한 보더가 있고 ROI 마스크와 동일한 미세 패턴의 반사 현미경 이미지. (C)최적이 아닌 레이저 전력으로 인한 PVA의 불완전제거의 반사 현미경 이미지. (D)과잉 레이저 전력으로 인한 PVA 버블링의 반사 현미경 이미지. (E)FN 코팅 패턴 커버립의 면역 형광 이미지는 항 FN 1차 항체 및 형광소-컨쥬게이트이 있는 이차 항체로 염색되었다. (F)AFM 토폴로지 스캔 라인과 석궁 패턴의 대표적인 AFM 이미지. 마이크로패턴의 토폴로지 측정을 위해 나노마법사 4 원자력 현미경에 장착된 브루커 AFM 프로브(MLCT-B)를 사용하여 접촉 모드 이미징을 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 마이크로 패턴에 도금 된 세포의 대표적인 이미지. (A)액틴 및 MLC를 위해 면역염색된 석궁 패턴에 도금된 1차 인간 칭기발 섬유아제의 대표적인 이미지. 이미지는 100배 의 목표를 갖춘 공초점 현미경으로 획득되었습니다. (B)사용자 정의 파이썬 스크립트에 의해 생성 된 석궁 패턴에 도금 된 세포에서 actin 및 MLC의 평균 면역 형광 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
상기 결과는 기술된 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜이 세포 형상 및 세포골격계 건축의 조작을 가능하게 하는 다양한 형상의 재현가능한 부착 패턴을 제공한다는 것을 보여준다. 마이크로포토패싱이 시작되기 전과 이후에 수많은 마이크로패턴 방법이 개발되었지만, 이 방법은 몇 가지 장점을 가지고 있다. 첫째, 일반적으로 엔지니어링 부서 내에서만 발견되는 특수 장비와 클린룸이 필요하지 않습니다. 사실, 다광현미경이 생물학 부서에서 더 흔한 광경이 되고 있기 때문에, 마이크로포토패터닝은 다광현미경의 적용을 확장하고 사용자의 잠재적인 풀에 추가합니다. 또한 패턴은 긴 리소그래피 프로세스를 수반하는 새 마스터 웨이퍼를 제작하는 대신 필요에 따라 변경하고 즉시 인쇄할 수 있습니다.
기존의 microphotopatterning 프로토콜에 비해, 우리의 프로토콜의 한 가지 개선은 커버 슬립 준비 중에 몇 가지 시간이 많이 걸리는 경화 단계를 제거하는 것입니다. 우리는 PVA 커버 슬립 부착의 품질이 패턴이 여전히 손상되지 않았고 제조 후 2 주에도 세포를 묶을 수 있기 때문에 흔들리지 않는 상태로 남아 있음을 보여줍니다. 더 중요한 것은, 우리는 각 FOV24의위치를 미리 설정할 필요가 제거하여 패터닝 프로세스의 자동화를 개선했다. 대신 각 FOV의 최적의 초점 평면을 정확하게 식별하면서 넓은 영역의 패터닝을 허용하는 이해할 수 있는 매크로를 구현합니다.
프로토콜의 매크로는 시스템에서 패터닝을 자동화할 수 있지만, 모든 상용 레이저 스캐닝 현미경에는 다른 제품과 거의 호환되지 않는 독자적인 소프트웨어가 함께 제공되므로 다른 시스템에서 정확한 프로토콜을 구현하기가 어렵습니다. 그러나, 전체 워크플로우는 자동화된 마이크로패터닝, 즉 각 개별 FOV에 초점을 맞추고, 마스크를 적재하고, PVA를 타오르는 과정, 현미경 단계를 새로운 FOV로 이동하는 과정을 용이하게 하기 위해 다른 상용 시스템에 잘 적응할 수 있습니다.
패터닝 프로토콜의 몇 가지 단계는 효율적인 패터닝을 보장하기 위해 세심한 주의를 기울여 수행해야 합니다. 가장 중요한 단계는 패턴을 생성하기 전에 자극 조건을 최적화하는 것입니다. 다중 광자 현미경 검사법에서는, 2개 이상의 광자가 형광 분자에 거의 동시에 도착하고 형광을 자극하기 위하여 그들의 에너지를 결합해야 합니다. 이 낮은 확률 이벤트는 신호 대 잡음 비율28을증가 매우 얇은 광학 섹션을 만듭니다. 이미징에 도움이 되지만 이 기능은 얇은 PVA 코팅을 시료의 Z 위치에 매우 민감하게 제거합니다. 이에 대응하기 위해 몇 가지 조치를 구현할 수 있습니다. 첫째, 레이저 전력은 폴리머를 "끓이거나" 유리 커버슬립을 손상시키지 않고 PVA를 철저히 제거하도록 미세 조정되어야 합니다. PVA 제거가 일관되게 불완전한 경우 일반적으로 레이저 전력이 증가하므로 레이저 정렬을 확인하는 것이 좋습니다. 둘째, 현미경 단계는 불완전한 패턴귀착될 수 있는 견본 기울기를 피하기 위하여 평준화되어야 합니다. PVA 층이 표적이 되도록 여러 Z 위치의 IR 자극도 설정해야 합니다. 또는 현미경에 완벽한 초점 모듈이 장착된 경우 PVA 타겟팅을 위한 Z 위치에서 최적의 오프셋을 결정하기 위한 예비 테스트를 수행할 수 있습니다. 또 다른 중요한 단계는 자동화 된 방식으로 패턴 자극을 허용하는 현미경 매크로를 설정하는 것입니다. 매크로는 샘플 기울기 또는 표면 불균일으로 인한 합병증을 피하기 위해 각각의 새 FOV의 초점 평면을 찾아야 합니다. 또한 스테이지가 연속 FOV 사이의 Z 편차를 최소화하기 위해 양방향 스캐닝에서 가져온 경로와 유사하게 행에서 행으로 S 모양으로 이동할 수 있도록 해야 합니다.
설명된 프로토콜에 대한 한 가지 제한은 많은 수의 패턴 커버립을 생성하는 데 필요한 시간이며, 리소그래피 기반 마이크로컨택트인쇄(29,30)가제공하는 비교할 수 없는 이점이다. 따라서 이 프로토콜은 제한된 수의 조건이 필요한 실험이나 패턴 모양 및 크기에서 쉽게 사용할 수 있는 조정이 필요한 실험에 가장 적합합니다. 또한 하드웨어 자동 초점 모듈이 부족한 시스템의 경우 자동화되고 효과적인 PVA 제거를 보장하기 위해 다양한 Z-평면에 일련의 자극 이벤트를 통합합니다. IR 자극이 가장 많은 시간이 소요되는 단계이므로 각 자극 이벤트(~30초)를 추가하면 패터닝 프로세스가 크게 길어집니다. 시간이 우려되는 경우 단계 크기를 줄임으로써 미세 조정 자동 초점을 권장합니다. 이렇게 하면 필요한 IR 자극 이벤트의 수가 감소하는 최고의 초점 평면의 식별을 용이하게 합니다. 실험에서 자극 이벤트의 수를 5개에서 2개로 줄이면 시간이 절반(1.5h)줄어듭니다.
결론적으로, 우리가 설명하는 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜은 IR 레이저 장착 현미경에 접근할 수 있는 모든 실험실에서 사용될 수 있다. 세포골격계 아키텍처를 연구하고 형태와 기능을 연결하는 신호 경로를 연구하는 것 외에도 이 기술은 약물 스크리닝 및 세포 간 가변성에 민감한 기타 응용 분야에도 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 S.P.에 Connaught 기금 새로운 조사상에 의해 지원되었다, 혁신을위한 캐나다 재단, NSERC 디스커버리 보조금 프로그램 (보조금 RGPIN-2015-05114 및 RGPIN-2020-05881), 맨체스터 대학과 토론토 대학 공동 연구 기금, 토론토 XSeed 프로그램 대학. C.T.는 NSERC USRA 펠로우십의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
References
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