Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontroll av cellegeometri gjennom infrarød laserassistert mikropatterning

Published: July 10, 2021 doi: 10.3791/62492
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Summary

Protokollen som presenteres her muliggjør automatisert fabrikasjon av mikropatterner som standardiserer celleform for å studere cytoskeletale strukturer i pattedyrceller. Denne brukervennlige teknikken kan settes opp med kommersielt tilgjengelige bildesystemer og krever ikke spesialisert utstyr utilgjengelig for standard cellebiologiske laboratorier.

Abstract

Mikropatterning er en etablert teknikk i cellebiologisamfunnet som brukes til å studere sammenhenger mellom morfologi og funksjon av cellulære rom mens omgå komplikasjoner som oppstår fra naturlige celle-til-celle variasjoner. For å standardisere celleformen er cellene enten begrenset i 3D-former eller kontrollert for limgeometri gjennom klebende øyer. Imidlertid er tradisjonelle mikropatterningsteknikker basert på fotolitografi og dyp UV-etsning sterkt avhengig av rene rom eller spesialisert utstyr. Her presenterer vi en infrarød laserassistert mikropatteringsteknikk (mikrofotopatterning) modifisert fra Doyle et al. som enkelt kan settes opp med kommersielt tilgjengelige bildesystemer. I denne protokollen bruker vi et Nikon A1R MP+ bildebehandlingssystem for å generere mikropatterns med mikronpresisjon gjennom en infrarød (IR) laser som ablates forhåndsinnstilte regioner på poly-vinyl alkoholbelagte deksler. Vi bruker et tilpasset skript for å muliggjøre automatisert mønsterproduksjon med høy effektivitet og nøyaktighet i systemer som ikke er utstyrt med en maskinvare-autofokus. Vi viser at denne IR-laserassisterte mikropatterningsprotokollen (mikrofotopatterning) resulterer i definerte mønstre som celler utelukkende fester seg til og tar på seg ønsket form. Videre kan data fra et stort antall celler beregnes i gjennomsnitt på grunn av standardisering av celleform. Mønstre generert med denne protokollen, kombinert med høyoppløselig bildebehandling og kvantitativ analyse, kan brukes til relativt høye gjennomstrømningsskjermer for å identifisere molekylære spillere som formidler koblingen mellom form og funksjon.

Introduction

Celleform er en nøkkeldeterminant for grunnleggende biologiske prosesser som vevsmorfogenese1, cellemigrering2, celleproliferasjon3og genuttrykk4. Endringer i celleformen drives av en intrikat balanse mellom dynamiske omorganiseringer av cytoskjelettet som deformerer plasmamembranen og ekstrinsiske faktorer som eksterne krefter som utøves på cellen og geometrien til cellecelle- og cellematriseadhesjoner5. Migrerende mesenchymale celler, for eksempel, polymeriserer et tett aktinnettverk i forkant som skyver plasmamembranen fremover og skaper en bred lamellipodia6, mens actomyosin-kontraktilitet trekker tilbake cellens smale etterfølgende kant for å løsne cellen fra sin nåværende posisjon7,8. Forstyrrende signalhendelser som gir opphav til slike spesialiserte cytoskeletale strukturer, perturberer form og polaritet og bremser cellemigrasjon9. I tillegg krever epitelplatebøying under gastrulation actomyosin-basert apikal innsnevring som får celler og deres naboer til å bli kileformede10. Selv om disse studiene fremhever viktigheten av celleform, har den iboende heterogeniteten i celleformen beheftet med å identifisere mekanismer som forbinder morfologi for å fungere.

For dette formål har mange tilnærminger for å manipulere celleform blitt utviklet i løpet av de siste tre tiårene. Disse tilnærmingene oppnår sitt mål ved enten å begrense cellen med en tredimensjonal mugg eller kontrollere cellulær vedheftgeometri gjennom mønstret avsetning av ekstracellulære matriseproteiner (ECM) på en antifouling overflate, en teknikk kalt mikropatterning11. Her vil vi gjennomgå en rekke teknikker som har blitt populære gjennom årene.

Opprinnelig banebrytende som en tilnærming for mikroelektroniske applikasjoner, har myk litografibasert mikrokontaktutskrift utvetydig blitt en kultfavoritt12. En masterskive fremstilles først ved å selektivt eksponere områder av et fotoresistbelagt silisiumsubstrat til fotoirradiering, og etterlater seg en mønstret overflate13. En elastomer, for eksempel PDMS, helles deretter på hovedskiven for å generere et mykt "stempel" som overfører ECM-proteiner til ønsket substrat11,14. Når den er fabrikkert, kan en masterskive brukes til å kaste mange PDMS-frimerker som gir opphav til svært reproduserbare mikropatterner12. Mønstrene kan imidlertid ikke justeres lett på grunn av den lange fotolittografiprosessen. Denne prosessen krever også høyt spesialisert utstyr og renrom som vanligvis ikke er tilgjengelige i biologiavdelinger.

Mer nylig har direkte utskrift ved hjelp av dyp UV blitt rapportert å omgå begrensninger som tradisjonelle litografibaserte tilnærminger utgjør. Dypt UV-lys ledes gjennom en fotomaske til selektive områder av englassdekslerlip belagt med poly-L-lysin-podet -polyetylenglykol. Kjemiske grupper utsatt for dyp UV er fotokonvertert uten bruk av lysfølsomme linkers for å muliggjøre binding av ECM-proteiner15. Mangelen på lysfølsomme linkers gjør det mulig for mønstrede deksler å holde seg stabile ved romtemperatur i over syv måneder15. Denne metoden unngår bruk av renrom og fotolitografiutstyr og krever mindre spesialisert opplæring. Kravet til fotomasker utgjør imidlertid fortsatt et betydelig hinder for eksperimenter som krever lett tilgjengelige endringer i mønstre.

I tillegg til metoder som manipulerer cellegeometri gjennom kontrollert avsetning av ECM-proteiner på en 2D-overflate, søker andre å kontrollere celleform ved å begrense celler i 3D-mikrostrukturer. Mange studier har tilpasset den myke litografibaserte tilnærmingen beskrevet ovenfor for å generere 3D, i stedet for 2D, PDMS-kamre for å undersøke formavhengige biologiske prosesser i embryoer, bakterier, gjær og planter16,17,18,19. To-foton polymerisasjon (2PP) har også tatt ledelsen som en mikrofabrikasjonsteknikk som kan skape komplekse 3D hydrogel stillaser med nanometeroppløsning20. 2PP er avhengig av prinsippene for to-foton adsorpsjon, hvor to fotoner levert i femtosecond pulser absorberes samtidig av et molekyl - fotoinitiator i dette tilfellet - som muliggjør lokal polymerisering av fotopolymerer21. Denne teknikken har blitt tungt brukt til å skrive ut 3D stillaser som etterligner de innfødte ECM-strukturene i menneskelig vev og har vist seg å indusere lav fotokjemisk skade på celle22.

Debuten av mikrofotopattering for 10 år siden ga forskere muligheten til å fremstille mikropatterns samtidig som de unngår utilgjengelig og spesialisert utstyr. Mikrofotopatterning skaper mønstre på mikronskalaen ved å termisk fjerne selektive områder av poly-vinylalkohol (PVA) belagt på aktiverte glassflater ved hjelp av en infrarød laser23,24. ECM-proteiner som bare fester den underliggende glassoverflaten og ikke PVA, fungerer da som biokjemiske signaler for å muliggjøre kontrollert spredningsdynamikk og celleform. Denne metoden gir også overlegen fleksibilitet siden mønstre lett kan endres i sanntid. Her tilbyr vi en trinnvis protokoll for mikrofotopatterning ved å bruke et kommersielt flerfoton bildebehandlingssystem. Den beskrevne protokollen er designet for rask og automatisert fabrikasjon av store mønstre. Vi demonstrerte at disse mønstrene effektivt kontrollerer celleformen ved å begrense geometrien til celle-ECM-vedheft. Til slutt viser vi at den beskrevne mønsterteknikken modulerer organiseringen og dynamikken i aktincytoskjelettet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbehandling av deksler

  1. Forbered knirkende rene deksler som beskrevet i Waterman-Storer, 199825.
  2. Forbered 1% (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS) løsning og inkuber dekslene i løsningen i 10 min med mild agitasjon. Pass på at dekslene beveger seg fritt i løsningen.
  3. Vask dekslene to ganger med dH2O i 5 min hver.
  4. Forbered 0,5% glutaraldehyd (GA) løsning og inkuber dekslene i løsningen i 30 min på en shaker. For 25 deksler, bruk 50 ml glutaraldehydoppløsning. Pass på at dekslene beveger seg fritt i løsningen.
  5. Vask deksler tre ganger med dH2O i 10 min hver.
  6. Spinn tørre deksler i 30 s ved hjelp av en spesialbygd coverlip spinner. En detaljert beskrivelse av coverlip spinner har blitt publisert26 og er tilgjengelig online (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Aktiverte deksler kan lagres i opptil en måned ved +4 °C i en boks med skillevegger slik at de skiller seg ut fra hverandre.

2. PVA-belegg

  1. Bland PVA (98 % hydrolysert PVA, MW 98000) med dH2O for å lage en 5,6 % løsning.
  2. Solubiliser blandingen i et 90 °C vannbad og filtrer umiddelbart gjennom et 0,2 μm filter i et biosikkerhetsskap mens det er varmt. Filtrer lagerløsningen på nytt hvis den utfelles. PVA-løsning kan lagres ved romtemperatur i 3 måneder.
  3. I et 15 ml rør legger du til en del HCl i åtte deler PVA. Snu røret forsiktig et par ganger for å blande.
  4. Hell 2 ml av den blandede oppløsningen i en 35 mm Petri-tallerken og senk en ren, forbehandlet deksleslip i væsken, pass på at dekslene ikke holder seg til bunnen. Inkuber ved romtemperatur i 5 min på en shaker.
  5. Fjern forsiktig dekslene fra løsningen. Bruk coverlip spinneren til å spinne frakk i 40 s. I mellomtiden rengjør pinsettene. Overfør dekslene til en eske og tørk ved +4 °C over natten. PVA-belagte deksler kan oppbevares ved +4 °C i opptil to uker.

3. Konfigurere multifotonmikroskopet

MERK: Den beskrevne protokollen er stilt inn for å lage cellelimmikropatterner av ønsket form og størrelse på oppreiste eller inverterte flerfotonavbildningssystemer, spesielt de som ikke er utstyrt med en autofokus for maskinvare. Således, for hvert synsfelt (FOV), ablates mønsterskriptet et lite område for å lage en fiduciary markør på coverlip, bruker en programvare autofokus for å fokusere mikroskopet på coverlip overflaten, og ablates ønsket mønster. Hvis du kjører dette skriptet i en løkke for tilstøtende FOVer, opprettes det et stort utvalg av mikropatterner (5 x 5 mm eller større) som begrenser celleformen og modulerer aktiviteten til intracellulære biologiske prosesser. Den beskrevne protokollen ble utviklet for Nikon A1R MP+ bildebehandlingssystem som styres av NIS-Elements programvare. Hvis et bildebehandlingssystem fra en annen leverandør brukes til mønster, bør de optiske konfigurasjonene og mønsterskriptet justeres i henhold til produsentens instruksjoner.

  1. Slå på mikroskopprogramvaren. Kontroller at målet "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" er montert på mikroskopet.
    MERK: Protokollen som er beskrevet her er optimalisert for et 25x/1.1 NA vann nedsenkingsmål, men andre mål kan også brukes til mønster. Leserne bør være klar over at pattering med et høyt forstørrelsesmål (f.eks., 40x og 60x) tar lengre tid, da det reduserer antall mønstre som er ablated i hver FOV betydelig. Mål for lav forstørrelse kan brukes til mønster så lenge de gir jevn belysning over FOV og laserkraft som er tilstrekkelig til å fyre opp PVA-laget.
  2. I A1plus MP GUI-vinduet setter du laserlinjen til 750 nm.
  3. Sette opp den optiske konfigurasjonen "Bilde"
    MERK: NIS-Elements gir brukerne flere verktøy (grafisk grensesnitt, en anskaffelsesarbeidsflytbygger JOBS, optiske konfigurasjoner og makroer) for å kontrollere mikroskopmaskinvaren. I denne protokollen oppnås det meste av maskinvarekontrollen gjennom forskjellige optiske konfigurasjoner, samt ND Acquisition- og ND Stimulation-moduler.
    1. Klikk Ny optisk konfigurasjoni kategorien Kalibrering . Gi den optiske konfigurasjonen navnet "Image". Dette er den optiske basiskonfigurasjonen som gjør det mulig å forestille seg dekslene gjennom refleks. La alle andre alternativer være standard, og velg riktig målsetting.
    2. I A1plus MP GUI-vinduet klikker du på Innstillinger-knappen for å konfigurere maskinvareinnstillingene under denne optiske konfigurasjonen. Sett stimuleringslaseren til IR stim, plasser Beam Splitter (BS 20/80) i lysbanen, sett skannerenheten til Galvano og velg riktig descanned detektor.
    3. I A1plus Compact GUI-vinduet velger du en skannestørrelse og oppholdstid som er tilstrekkelig til å fange opp små funksjoner på henholdsvis coverlip (1,1 ms og 1024 piksler på systemet vårt). Klikk på Normal-knappen slik at ingen linjegjennomsnitt eller linjeintegrasjon utføres. Kontroller at det er merket av for Bruk IR-laser. Konfigurer enveisskanning for enkelhets skyld.
      MERK: Hvis skannehastigheten er problematisk, kan toveis skanning brukes.
    4. I samme vindu justerer du laserkraften og detektorfølsomheten for å oppnå et lyst, men ikke mettet bilde av dekslene. Å sette laserkraften til 3 - 5% av maksimal effekt og detektorfølsomhet ("HV" glidebryter) til 15 V er et godt utgangspunkt.
    5. I vinduet A1plus-skanneområde setter du Zoom til 1 for å fange opp hele FOV-en.
    6. Lagre den optiske konfigurasjonen.
  4. Sette opp den optiske Print_Fudiciary_Marker-konfigurasjonen
    1. Dupliser den optiske konfigurasjonen "Bilde" og gi den nytt navn "Print_Fudiciary_Marker".
    2. I A1plus Compact GUI-vinduet velger du den minste skannestørrelsen og oppholdstiden (henholdsvis 64 piksler og 80,2 ms på systemet vårt).
    3. Siden det ikke er nødvendig med bildebehandling i dette trinnet, setter du detektorfølsomheten til 0 og øker laserkraften til 30%. Høyere lasereffekt vil termisk fjerne PVA-laget på dekslene i de ønskede områdene.
    4. I vinduet A1plus Scan Area setter du Zoom til maksimum (15,87 for systemet vårt) og plasserer skanneområdet midt i FOV-en.
    5. I vinduet ND Acquisition konfigurerer du et Z-stack-eksperiment. Sett bevegelsen i Z-posisjonen til Relativ og velg riktig Z-enhet. Sett trinnstørrelsen til 2 μm og stakkdybden til 10 μm over og under for å ta høyde for ujevnheter i mikroskopstadiet eller PVA-overflaten mellom tilstøtende FOVer.
  5. Sette opp den optiske konfigurasjonen "Autofokus"
    1. Dupliser den optiske konfigurasjonen "Bilde" og gi den nytt navn "Autofokus".
    2. I vinduet A1plus-skanneområde reduserer du zoomfaktoren slik at FOV er litt større enn fiduciary-markøren. Dette sikrer at andre små funksjoner på dekslene ikke forstyrrer autofokusering.
    3. Velg Konfigurer automatisk på Enheter -menyen. Sett skannetykkelsen til Z-stakken i Z-stack-eksperimentet (se trinn 3.5.5). Mikroskopet vil skanne gjennom dette området og finne det beste fokusplanet ved hjelp av fiduciary markøren. La trinnstørrelsen være standard.
  6. Sette opp den optiske konfigurasjonen "Load_ROI"
    1. Dupliser den optiske konfigurasjonen "Bilde" og gi den nytt navn "Load_ROI".
    2. I A1plus Compact GUI-vinduet angir du skannestørrelsen som er identisk med størrelsen på ROI-masken. Denne optiske konfigurasjonen vil bli brukt til å ta opp et bilde som ROI-masken skal lastes inn på. Vi brukte 2048 piksler for å oppnå en optimal balanse mellom oppløsning og hastighet.
      MERK: Det er viktig at dette innspilte bildet er identisk i størrelse med ROI-masken.
  7. Sette opp den optiske konfigurasjonen "Micropattern"
    1. Dupliser den optiske konfigurasjonen "Print_Fiduciary_Marker" og gi den nytt navn "Micropattern".
    2. Sett Zoom-faktoren til en.
    3. I A1plus MP GUI-vinduet øker du stimuleringslaserkraften for å fyre av PVA og velger en passende skannehastighet (henholdsvis 40% og 32 s / ramme i våre eksperimenter).
    4. I ND Stimulation-vinduet setter du opp et ND-stimuleringseksperiment. Legg til noen faser i tidsplanen, og angi hver fase som Stimulering. Sørg for at stimuleringsområdet og varigheten er riktig.
      MERK: Antall faser kan justeres i henhold til tykkelsen og glattheten til PVA-laget, samt lasereffekten som brukes i denne optiske konfigurasjonen.
    5. I samme vindu aktiverer du funksjonen StgMoveMainZ(-1.000,1) før hver fase. Dette står igjen for eventuelle avvik i Z-retningen.
      MERK: Avstanden og retningen som objektivet beveger seg i, kan justeres i henhold til tykkelsen og glattheten til PVA-laget.
  8. Sette opp den optiske Label_Surface-konfigurasjonen
    1. Dupliser den optiske konfigurasjonen "Print_Fudiciary_Marker" og gi den nytt navn "Label_Surface".
    2. I A1plus Compact GUI-vinduet øker du lasereffekten betraktelig og setter Zoom til en. Høy lasereffekt som brukes her vil fysisk skade glassdekslene og produsere en etikett som er synlig for det blotte øye. Dette bidrar til å finne mønstrene i ytterligere eksperimenter.

4. Generere avkastningenemaske og sette opp makroen

  1. Generere roi-masken
    1. Bruk Adobe Photoshop eller annen tilgjengelig programvare for å generere et 2048-× RGB-bilde fra 2048. Bildet tilsvarer en FOV under mikroskopet (dvs. 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm per piksel). Bildet skal ha en svart (0, 0, 0) bakgrunn.
      MERK: En rekke kommersielle og gratis bilderedigerere kan brukes til å generere ROI-masker for laserassistert mikropattering. Selv om vi bruker Adobe Photoshop til å generere masker, er GIMP og ImageJ / Fiji også tilgjengelige som alternative gratisalternativer.
    2. Tegn 8 - 12 hvite (255 255 255) mønstre på svart bakgrunn. Mønsterstørrelsen varierer avhengig av celletype (~200 piksler i diameter). La det være et 500 × 500 tomt område midt i bildet for autofokusering. La det være tilstrekkelig avstand mellom tilstøtende mønstre (>200 piksler) og ved boarderen til FOV for optimal ablasjon og cellevedlegg. Mønstre som presenteres i denne protokollen er tilgjengelige på Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
  2. Sette opp makroen
    1. Klikk Makro -menyen, og velg Ny makro.
    2. Importer "Pattern_Stimulation"-koden som er tilgjengelig på Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning), til nytt makrovindu. Lagre denne kodedelen i en passende mappe.
    3. Åpne et annet nytt makrovindu, og importer koden "Stage_Movement" som er tilgjengelig på Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Kontroller at arbeidsmappen "Stage_Movement" i denne koden er identisk med den i trinn 4.2.2. Lagre koden "Stage_Movement" i samme mappe i trinn 4.2.2.

5. Generere mikropatterner ved hjelp av fotoablasjon

  1. Slå på mikroskopet og tilbehøret. Kontroller at IR-laseren har varmet opp tilstrekkelig før dette.
  2. Overfør den PVA-belagte dekslen på en holder. For et oppreist mikroskop, sørg for at PVA-overflaten blir ablated ansikter ned.
  3. Tilsett vann i hjørnene for å stabilisere dekslene og monter holderen på mikroskopstadiet.
  4. Senk målet og tilsett vann på dekslene.
    MERK: Protokollen som er beskrevet her, er optimalisert for et 25x/1.1 NA vann nedsenkingsmål. Hvis det brukes et tørt eller olje nedsenkningsmål, bør vann erstattes med et passende nedsenkingsmedium. Når et vann nedsenkingsmål brukes til å generere et stort mikropattern array, kan fordampning bli et problem. Hvis dette er tilfelle, bør vann erstattes med GenTeal, et over-the-counter øye smøremiddel tilgjengelig fra apotek.
  5. I mikroskopprogramvaren slår du på IR-laserlukkeren i A1plus MP GUI-vinduet. Klikk på Autoalignment-knappen for å justere laseren før du mønstrer.
    MERK: Det er avgjørende å utføre laserjustering i begynnelsen av hver mønsterøkt, da små avvik i laserbanen vil påvirke kvaliteten på mønstrene betydelig.
  6. Bytt til den optiske konfigurasjonen "Image". I A1plus Compact GUI-vinduet klikker du på Skann for å skanne FOV mens du sakte flytter målet nærmere dekslene.
  7. Overvåk bildet nøye. Først vil bildet virke ekstremt svakt. Flytt målsettingen nærmere dekslene til lysstyrken i bildet øker. Dette er dekslene som står overfor målet. Fortsett å flytte målsettingen til lysstyrken minker og øker igjen. Dette er PVA-overflaten som skal mønstres. Fokuser på en hvilken som helst liten funksjon (coverlip ufullkommenheter, støv, etc.) på denne overflaten og sett null på Z-stasjonen. Sett alltid null etter fokusering.
    MERK: Selv om begge overflatene på dekslene er belagt med PVA, endres ikke de optiske egenskapene til glass betydelig av PVA-belegg. Vi ser rutinemessig for oss slike coverlips med tørre, vann- og oljeinnlevelsesmål og fant ikke den ikke-mønstrede PVA-overflaten for å forstyrre avbildningen.
  8. Bytt til den optiske konfigurasjonen "Label_Surface". Klikk Spill inn. Gå tilbake til den optiske konfigurasjonen og skanningen av avbildningen. Glassoverflaten skal være skadet og virke amorf. Det skadede området er synlig for det blotte øye, noe som indikerer plasseringen av mønstre i videre eksperimenter.
    MERK: For å øke størrelsen på den synlige etiketten, gjenta trinn 5.8 i flere tilstøtende FOVer.
  9. Sjekk igjen at målet er omtrent i midten av dekslet. Sørg for at det er tilstrekkelig vann mellom målet og dekslene. Flytt scenen med 1 til 2 FOVer for å unngå glasspartikler og skann for å bekrefte.
  10. Åpne Stage_Movement makroen på Enheter-menyen. Kontroller at den Pattern_Stimulation arbeidsmappen er riktig. Hvis ikke, vil stimulering ikke forekomme. Sett variablene "PatternLength" og "PatternHeight" til ønsket antall FOVer som skal mønstres. Lagre og kjør makroen.
  11. Når mønsteret er fullført, bytter du til den optiske konfigurasjonen "Imaging". Kontroller igjen at IR-laserlukkeren er åpen i A1plus MP GUI-vinduet.
  12. Flytt fasen for å vise mønstrene. Skann gjennom mønstrene for å sjekke kvaliteten.
  13. Overfør dekslene til rutenettboksen, med mønstre vendt opp.
  14. Oppbevar mønstrede deksler ved +4 °C i opptil én uke før bruk.

6. Fibronectin adsorpsjon

  1. Lag fersk 1 M NaBH4 i 1 M NaOH-oppløsning. Tilsett et forhold på 1:100 til pH 8,0 fosfatbuffer som inneholder 0,2 M etanamin.
  2. Overfør mønstrede deksler til en 35 mm vevskulturrett. Inkuber hvert deksle med 1 ml av oppløsningen ovenfor i 8 minutter for å slukke autofluorescens, og skyll deretter 3 ganger med PBS.
  3. Fortynn fibronektin (FN) i PBS til en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml. Inkuber dekslene i FN i 1 time ved +37 °C.
    MERK: Hvis det observeres betydelig ikke-spesifikk binding av ECM-protein til substratet, kan FN fortynnes i PBS som inneholder 0,1% Pluronic F-12724.
  4. Vask dekslene 2 ganger med PBS. Oppbevars i PBS ved +4 °C over natten hvis det ikke brukes umiddelbart.

7. Cellevedlegg

MERK: Følgende protokoll er optimalisert for primære humane gingivalfibroblaster.

  1. Kultur en 10 cm tallerken med celler til 70% samløp.
  2. Varm opp cellekulturmedier, PBS og 0,05% trypsin i et +37 °C vannbad.
    MERK: For celler som holder seg svakt til substratet, kan ikke-proteolytisk dissosiasjon med versene (0,48 mM EDTA) eller en proprietær enzymfri buffer øke celletilknytningen til mønstrene og bør vurderes.
  3. Før såddceller, flytt den mønstrede dekslen til en ren 35 mm vevskulturfat som inneholder 1 ml varm PBS.
  4. Aspirer cellekulturmediene fra 10 cm vevskulturretten og vask en gang med PBS.
  5. Tilsett 700 μL 0,05% trypsin/EDTA i parabolen og inkuber celler i en +37 °C, 5 % CO 2-inkubator i 1 min.
  6. I mellomtiden aspirerer du PBS som dekker den mønstrede dekslen og legger til 1 ml cellekulturmedier.
  7. Bekreft at cellene er koblet fra. Deretter resuspenderer du de trypsiniserte cellene med 10 ml cellekulturmedier og legger til 1 ml til den mønstrede coverlipen.
  8. Kulturceller i inkubatoren i 2 - 3 timer og sjekk om et tilstrekkelig antall celler har festet seg til mønstrene. I så fall endrer du medier én gang for å fjerne celler som ikke er tilknyttet. Dette minimerer sjansen for at flere celler lander på samme mønster.
    MERK: Vedleggstiden kan variere avhengig av celletype.
  9. Etter ytterligere 3-4 timer, eller når et tilstrekkelig antall celler har spredt seg på mønstre, er cellene klare for videre eksperimenter. Ikke vent for lenge for å unngå celledeling.

8. Datainnsamling

  1. Fest celler med 4% PFA i cytoskjelettbuffer27 i 10 minutter ved romtemperatur.
  2. Følg immunfluorescensprotokoller etablert for proteiner av interesse. PVA-belagte deksler fungerer bra med enhver immunfluorescensprotokoll.
  3. Hent bilder av celler ved hjelp av et passende mikroskop. Avhengig av målet med eksperimentet, bilde enten en eller flere celler per FOV.

9. Bildeanalyse

MERK: Følgende protokoll lar brukerne få det gjennomsnittlige fluorescenssignalet til proteinet av interesse over et stort antall celler fra Z-stabler av mikroskopbilder.

  1. Åpne de oppkjøpte bildene i NIS Elements og beskjær bildene. Kontroller at hvert bilde bare inneholder én brønnoppslagscelle. Detaljerte instruksjoner om bildebehandling finner du i skriptet nedenfor.
  2. Installer Anaconda og start Spyder gjennom Anaconda Navigator.
    MERK: De .py skriptene kan kjøres i alle miljøer med de riktige pakkene identifisert i kravene.txt. Vi anbefaler Anaconda fordi den inneholder de fleste nødvendige pakker for kodene nedenfor.
  3. Last ned skriptet fra Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) og åpne i Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py" eller "Pattern_Averaging_4Channels.py" for bilder med henholdsvis 3 kanaler eller 4 kanaler).
  4. Angi parametere basert på de anskaffede bildene. Se skriptet hvis du vil ha detaljerte beskrivelser.
  5. Trykk F5 for å kjøre skriptet. Fremdriften kan spores i Konsoll-panelet.
  6. Hent utdatafilene som er lagret i samme mappe. Utdatabildene er gjennomsnittet for hver kanal for alle prøver. Excel-arket viser gjennomsnittsintensiteten for hver kanal i en eksempelcelle, noe som muliggjør ytterligere kvantitativ analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kvaliteten på de eksperimentelle dataene oppnådd gjennom mikropatterning er i stor grad avhengig av kvaliteten på mønstrene. For å bestemme kvaliteten på mønstre generert med metoden ovenfor, brukte vi først refleksmikroskopi for å vurdere formen og størrelsen på de ablerte områdene på omslagsslipet. Vi fant at hvert enkelt mønster så veldig likt ablasjonsmasken og viste klare boarders og en overflate som reflekterte lys jevnt (Figur 2B). En rekke former og størrelser kan skrives ut avhengig av ønsket cytoskjelettarkitektur, men vi brukte armbrøstformen som passer best til våre formål. Atomkraftmikroskopi (AFM) viste at slike mønstre var omtrent 140 nm i høyden og hadde en jevn overflate med minimal topologisk variasjon gjennom (Figur 2F). Suboptimale mønsterinnstillinger, for eksempel lav lasereffekt og feil fokusplan, resulterte i ufullstendig fjerning av PVA-overflaten som manifesterer seg som mørkere, delvise mønstre med ujevn topologi (Figur 2C). Hvis du stiller inn lasereffekten for høy, førte det til at PVA "bobler" og når den er ekstrem, dekker overflateskade som også er uønsket (Figur 2D).

I foreløpige eksperimenter forsøkte vi å øke mønsterområdet ved å avta flere FOVer på en enkelt coverlip. Vi fant at denne tilnærmingen, selv om den i prinsippet fungerer, er upålitelig og kjedelig på grunn av Z-drift av mikroskopstativet og liten tilt av dekslet. For å oppnå mønstre av høy kvalitet over et stort antall FOVer på en automatisert måte, implementerte vi en tilpasset makro som forbedret presisjonen til mikroskop med fokus under mønsterprosessen. Multifotonmikroskopet bruker en pulslaser som effektivt forringer PVA med høy effekt i et smalt fokusplan, noe som gjør mønsterprosessen følsom for ujevnheter eller tilt i prøven. Som et resultat er det viktig å identifisere det nøyaktige fokusplanet i hver FOV. Dette er enda mer problematisk for systemer som mangler en perfekt fokusmodul, da avvik så lite som en til to mikron kan gjøre mønsterprosessen fruktløs. For å løse dette problemet mønstrer det tilpassede makroskriptet først en liten firkant i midten av hver nye FOV som bare trenger å være grovt i fokus ved å skanne gjennom en relativt tykk Z-stakk (≈20 μm). Mikroskopet skanner deretter raskt gjennom bildestakken og bruker NIS Elements autofokusfunksjon for å identifisere det optimale fokusplanet. Mønstermasken lastes deretter inn og angis som stimulerings-AVKASTNING for IR-stimulering. Fasen flyttes deretter til neste FOV og gjentar denne prosessen. I tillegg sørget den firkantede bølgeformede banen til mikroskopets scenebevegelse minimal feilakkumulering mellom sekvensielle FOVer. Ved å bruke denne protokollen fremstiller vi rutinemessig mønstre som består av 49 mikroskop-FOVer som dekker 3,5 x 3,5 mm område av dekslene i mindre enn 3 timer.

For å teste om mønstrede områder, ikke uforstyrret PVA, kunne adsorbere ECM-proteiner, belagte vi mønstrede deksler med 10 μg / ml FN og farget dem med anti-FN-antistoff. Ved hjelp av bredfelts fluorescerende mikroskopi fant vi ut at FN jevnt adsorberte til de mønstrede områdene der PVA hadde blitt fjernet ved laserablasjon (figur 2E).

For å avgjøre om cytoskjelettarkitektur og spenningsfordeling kunne endres som forventet på mønstrene, sådde vi celler på mønstrede deksler og visualiserte fordelingen av myosinlyskjeden, en markør for kontraktilitet, gjennom fluorescensmikroskopi. Etter første sådd graviterte cellene gradvis mot dekslene. De som landet på mønstrede områder festet og spredte seg i form av mønsteret over tid. De som landet på PVA bare løst festet og ble fjernet etter flere vasker og medieendringer. Vi fant at celler spredte seg på mønstre som viste fenotypiske fibroblaststrukturer, inkludert en aktintett kant av lamellipodia, tykke ventrale stressfibre langs de to sidene, og dorsale stressfibre som kommer fra lamellipodia forbundet med tverrgående buer (Figur 3A). Myosin light chain (MLC) satt bak den tette lamellipodia-kanten og viste et strikket mønster langs aktinbunter. Som angitt av gjennomsnittlige bilder av mange celler, var denne fenotypen konsekvent på tvers av et stort antall mønstre (figur 3B).

Figure 1
Figur 1. Skjematisk for IR-laserassistert mikropattering (mikrofotopatterning). (A) Glassdeksler er kjemisk konjugert med APTMS, GA og PVA, i den respektive rekkefølgen. PVA-overflaten er ikke-klebende til celler og proteiner. (B) PVA fjernes i forhåndsinnstilte mønstre av en IR-laser. (C) Mønstrede deksler er belagt med et ECM-protein som bare adsorberer til mønstrede områder. (D) Celler er belagt på deksler, fast og immunostert for proteiner av interesse. Celler som lander på mønstrede øyer spredte seg i form av mønsteret som gir opphav til karakteristiske cytoskeletale strukturer, mens de som lander på PVA forblir sfæriske. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Micropattern validering og karakterisering. (A) IR laserassistert mikropatterning (mikrofotopatterning) oppsett på et mikroskopstadium. IR-laseren ablates PVA termisk i flere FOVer. (B) Et refleksmikroskopibilde av mikropatterner som har klare boarders og er identiske med ROI-maskene. (C) Et refleksmikroskopibilde av ufullstendig fjerning av PVA som følge av suboptimal lasereffekt. (D) Et refleksmikroskopibilde av PVA-boblende som følge av overflødig lasereffekt. (E) Immunfluorescence bilder av FN belagt mønstret deksler farget med anti-FN primære antistoffer og fluorofor-konjugerte sekundære antistoffer. (F) En AFM-topologiskannelinje og et representativt AFM-bilde av et armbrøstmønster. For å måle mikropatternens topologi ble det utført kontaktmodusavbildning ved hjelp av en Bruker AFM-sonde (MLCT-B) montert på et NanoWizard 4 atomkraftmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Representative bilder av celler belagt på mikropatterns. (A) Representative bilder av en primær menneskelig gingival fibroblast belagt på armbrøst mønstre immunostained for aktin og MLC. Bilder ble anskaffet med et konfokalt mikroskop utstyrt med et 100x mål. (B) Gjennomsnittlig immunfluorescence bilder av aktin og MLC i celler belagt på armbrøst mønstre generert av en tilpasset Python skript. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Resultatene ovenfor viser at den beskrevne IR-laserassisterte mikropatterningsprotokollen (mikrofotopatterning) gir reproduserbare tilhengermønstre i ulike former som muliggjør manipulering av celleform og cytoskeletal arkitektur. Selv om mange mikropatterningsmetoder har blitt utviklet både før og etter debuten av mikrofotopatterning, har denne metoden flere fordeler. For det første krever det ikke spesialisert utstyr og renrom som vanligvis bare finnes i ingeniøravdelinger. Faktisk, etter hvert som multifotonmikroskop blir et mer vanlig syn i biologiavdelinger, utvider mikrofotopatterning applikasjonene til multifotonmikroskopet og legger til det potensielle utvalget av brukere. Mønstre kan også endres på forespørsel og trykkes umiddelbart, i stedet for å måtte fremstille en ny mesterskive som innebærer en lang litografiprosess.

Sammenlignet med den eksisterende mikrofotopatteringsprotokollen, er en forbedring i vår protokoll eliminering av flere tidkrevende herdetrinn under coverlip-forberedelse. Vi viser at kvaliteten på PVA-coverlip vedlegg forblir uforstyrret da mønstrene fortsatt var intakte og kunne binde celler selv to uker etter fabrikasjon. Enda viktigere er at vi forbedret automatiseringen av mønsterprosessen ved å eliminere behovet for å forhåndsinnstille posisjonen til hver FOV24. I stedet implementerer vi en forståelig makro som tillater mønster av et stort område, samtidig som vi nøyaktig identifiserer det optimale fokusplanet til hver FOV.

Selv om makroene i protokollen muliggjør automatisering av mønster på systemet vårt, forstår vi at hvert kommersielt laserskanningsmikroskop kommer med sin egen proprietære programvare som sjelden er kompatibel med andre, noe som gjør det vanskelig å implementere vår eksakte protokoll på andre systemer. Den generelle arbeidsflyten kan imidlertid tilpasses andre kommersielle systemer for å lette automatisert mikropattering, nemlig prosessen med å fokusere på hver enkelt FOV, laste masken, ablating PVA og flytte mikroskopstadiet til en ny FOV.

Flere trinn i mønsterprotokollen bør gjennomføres med stor forsiktighet for å sikre effektiv mønster. Det mest kritiske trinnet er å optimalisere stimuleringsforholdene før du genererer mønstre. I multi-fotonmikroskopi må to eller flere fotoner komme nesten samtidig til et fluorescerende molekyl og kombinere energien for å begeistre fluorescens. Denne hendelsen med lav sannsynlighet skaper en ekstremt tynn optisk del som øker signal-til-støy-forholdet28. Selv om denne funksjonen er gunstig for avbildning, gjør den fjerningen av det tynne PVA-belegget ekstremt følsomt for prøvens Z-posisjon. Det kan iverksettes flere tiltak for å motvirke dette. Først bør laserkraft finjusteres for å sikre grundig fjerning av PVA uten å "koke" polymeren eller skade glassdekslene. Hvis PVA-fjerning er konsekvent ufullstendig, anbefaler vi at du kontrollerer laserjusteringen, da dette vanligvis øker laserstrømmen. For det andre bør mikroskopstadiet utjevnes for å unngå prøvevinkel, noe som kan føre til ufullstendige mønstre. IR-stimuleringer i flere Z-posisjoner bør også settes opp for å sikre at PVA-laget er målrettet. Alternativt, hvis mikroskopet er utstyrt med en perfekt fokusmodul, kan foreløpige tester utføres for å bestemme den optimale forskyvningen i Z-posisjon for PVA-målretting. Et annet kritisk trinn er å sette opp en mikroskopmakro som tillater mønsterstimulering på en automatisert måte. Makroen bør finne fokusplanet til hver nye FOV for å unngå komplikasjoner fra prøvevinkel eller overflate ujevnhet. Det bør også tillate scenen å bevege seg i en S-form fra rad til rad, analog med banen som er tatt i toveis skanning, for å minimere avvik i Z mellom påfølgende FOVer.

En begrensning i protokollen som er beskrevet, er tiden det tar å produsere et stort antall mønstrede omslag, en enestående fordel som tilbys av litografibasert mikrokontaktutskrift29,30. Som et resultat er denne protokollen best egnet for eksperimenter der et begrenset antall forhold kreves, eller de som krever lett tilgjengelige justeringer i mønsterform og størrelse. Videre, for systemer som mangler en autofokusmodul for maskinvare, integrerer vi en rekke stimuleringshendelser i forskjellige Z-fly for å sikre automatisert og effektiv PVA-fjerning. Siden IR-stimulering er det mest tidkrevende trinnet, forlenger tilleggingen av hver stimuleringshendelse (~ 30 sek) mønsterprosessen betydelig. Hvis tiden er bekymringsfull, foreslår vi at du finjusterer autofokus ved å redusere trinnstørrelsen. Dette letter identifiseringen av det beste fokusplanet som vil redusere antall IR-stimuleringshendelser som kreves. I våre eksperimenter reduserer reduksjonen av antall stimuleringshendelser fra fem til to tiden med halvparten (1,5 timer).

Til slutt kan IR-laserassistert mikropatterning (mikrofotopatterning) protokoll vi beskriver brukes i ethvert laboratorium som har tilgang til et IR-laserutstyrt mikroskop. I tillegg til å studere cytoskeletal arkitektur og signalveier som kobler form til funksjon, kan denne teknikken også brukes på legemiddelscreening og andre applikasjoner som er følsomme for celle-til-celle-variasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne avslører ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Connaught Fund New Investigator Award til S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (tilskudd RGPIN-2015-05114 og RGPIN-2020-05881), University of Manchester og University of Toronto Joint Research Fund, og University of Toronto XSeed Program. C.T. ble støttet av NSERC USRA fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane Aldrich 281778
10 cm Cell Culture Dish VWR 10062-880 Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective Nikon MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish VWR 10861-586 Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Thermo 62248 1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin BioShop ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Wisent 311-425-CL
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
Fibronectin Sigma-Aldrich FC010 1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody BD 610077 Mouse
Fiji ImageJ Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin Invitrogen A12380 568nm
Glass Coverslip VWR 16004-302 22 × 22 mm
Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16220 25% aqueous solution
Hydrochloric Acid Caledon 6025-1-29 37% aqueous solution
IR Laser Coherent Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α Gibco 12561-056
Mounting Medium Sigma F4680
Mouse Secondary Antibody Cell Signaling Technology 4408S Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope Nikon A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody Cell Signaling Technology 3672S Rabbit
NIS Elements Nikon Version 5.21.03
Nitric Acid Caledon 7525-1-29 70% aqueous solution
Photoshop Adobe Version 21.2.1
Pluronic F-127 Sigma P2443 Powder
Poly(vinyl alchohol) Aldrich 341584 MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody Cell Signaling Technology 4412S Goat, 488nm
Shaker VWR 10127-876 Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride Aldrich 452882 Powder
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium Phosphate Dibasic Sigma S5136 Powder
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S5011 Powder
Spyder Anaconda 4.1.4
Trypsin Wisent 325-042-CL 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
  2. Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
  3. Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
  4. Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
  5. Paluch, E., Heisenberg, C. -P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
  6. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
  9. Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
  10. Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
  11. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  12. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  13. Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
  14. Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
  15. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
  16. Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
  17. Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
  18. Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
  19. Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
  20. Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
  21. Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
  22. Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
  23. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
  24. Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
  25. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/Organelle Motility Assays. Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).
  26. Inoué, S., Spring, K. R. Video Microscopy: The Fundamentals. , Springer. US. (1997).
  27. Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
  28. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  29. Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
  30. Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0-14 (2013).

Tags

Bioingeniør utgave 173
Kontroll av cellegeometri gjennom infrarød laserassistert mikropatterning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, S., Tuo, C., Iu, E.,… More

Yang, S., Tuo, C., Iu, E., Plotnikov, S. V. Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning. J. Vis. Exp. (173), e62492, doi:10.3791/62492 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter