Summary
Протокол, представленный здесь, позволяет автоматизировать изготовление микроструктур, которые стандартизируют форму клеток для изучения цитоскелетных структур в клетках млекопитающих. Этот удобный для пользователя метод может быть установлен с коммерчески доступными системами визуализации и не требует специализированного оборудования, недоступного для стандартных лабораторий клеточной биологии.
Abstract
Микроструктурирование является признанным методом в сообществе клеточной биологии, используемым для изучения связей между морфологией и функцией клеточных компартментов, обходя осложнения, возникающие из естественных вариаций между клетками. Чтобы стандартизировать форму ячеек, клетки либо заключены в 3D-формы, либо контролируются для адгезивной геометрии через адгезивные острова. Однако традиционные методы микроструктурирования, основанные на фотолитографии и глубоком УФ-травлении, сильно зависят от чистых помещений или специализированного оборудования. Здесь мы представляем инфракрасную лазерную технику микроструктурирования (микрофотопаттернинг), модифицированную от Doyle et al., которая может быть удобно настроена с помощью коммерчески доступных систем визуализации. В этом протоколе мы используем систему визуализации Nikon A1R MP+ для генерации микроструктур с микронными прецизиями с помощью инфракрасного (ИК) лазера, который аблационирует заданные области на покрытых поливиниловым спиртом покровах. Мы используем пользовательский скрипт для обеспечения автоматизированного изготовления шаблонов с высокой эффективностью и точностью в системах, не оснащенных аппаратным автофокусом. Мы показываем, что этот протокол микроструктурирования (микрофотопа) с помощью ИК-лазера приводит к определенным паттернам, к которым клетки прикрепляются исключительно и принимают желаемую форму. Кроме того, данные из большого количества ячеек могут быть усреднены из-за стандартизации формы клеток. Паттерны, генерируемые с помощью этого протокола, в сочетании с изображениями с высоким разрешением и количественным анализом, могут использоваться для экранов с относительно высокой пропускной способностью для идентификации молекулярных игроков, опосредованных связью между формой и функцией.
Introduction
Форма клетки является ключевым фактором, определяющим фундаментальные биологические процессы, такие как морфогенез тканей1,миграция клеток2,пролиферация клеток3и экспрессия генов4. Изменения формы клеток обусловлены сложным балансом между динамическими перестройками цитоскелета, который деформирует плазматическую мембрану, и внешними факторами, такими как внешние силы, возлагаемые на клетку, и геометрией клеточно-клеточных и клеточно-матричных спаек5. Мигрирующие мезенхимальные клетки, например, полимеризуют плотную актиновую сеть на переднем крае, которая выталкивает плазматическую мембрану вперед и создает широкую ламеллиподию6,в то время как сократимость актиозина втягивает узкий задний край клетки, чтобы отсоединить клетку от ее текущего положения7,8. Нарушение сигнальных событий, которые порождают такие специализированные цитоскелетные структуры, нарушает форму и полярность и замедляет миграцию клеток9. Кроме того, изгиб эпителиального листа во время гаструляции требует апикального сужения на основе актомиозина, что приводит к тому, что клетки и их соседи становятся клиновидными10. Хотя эти исследования подчеркивают важность формы клеток, присущая им гетерогенность в форме клеток обременила усилия по выявлению механизмов, которые связывают морфологию с функцией.
С этой целью за последние три десятилетия были разработаны многочисленные подходы к манипулированию формой клеток. Эти подходы достигают своей цели, либо ограничивая клетку трехмерной плесенью, либо контролируя геометрию клеточной адгезии посредством узорчатого осаждения белков внеклеточного матрикса (ECM) на противообрастающую поверхность, метод, называемый микроструктурированием11. Здесь мы рассмотрим ряд методик, которые завоевали популярность на протяжении многих лет.
Первоначально впервые предложенная как подход к микроэлектронным приложениям, мягкая литография на основе микроконтактной печати однозначно стала культовым фаворитом12. Мастер-пластина сначала изготавливается путем выборочного воздействия на участки кремниевой подложки с фоторезистовым покрытием для фотоиррадиации, оставляя после себя узорчатую поверхность13. Эластомер, такой как PDMS, затем выливается на главную пластину для создания мягкого «штампа», который переносит белки ECM на желаемую подложку11,14. После изготовления мастер-пластина может быть использована для отливки многих штампов PDMS, которые дают начало высоковоспроизводимым микропаттернам12. Тем не менее, паттерны не могут быть легко скорректированы из-за длительного процесса фотолитографии. Этот процесс также требует высокоспециализированного оборудования и чистых помещений, которые обычно недоступны в биологических отделах.
Совсем недавно сообщалось, что прямая печать с использованием глубокого ультрафиолета обходит ограничения, связанные с традиционными подходами, основанными на литографии. Глубокий ультрафиолетовый свет направляется через фотомаску на селективные участки стеклянного покровного листа, покрытого поли-L-лизином-привитым полиэтиленгликолем. Химические группы, подвергающиеся воздействию глубокого УФ-излучения, фотоконвертируются без использования светочувствительных линкеров для обеспечения связывания белков ECM15. Отсутствие светочувствительных линкеров позволяет узорчатым покровам оставаться стабильными при комнатной температуре более семи месяцев15. Этот метод позволяет избежать использования чистых помещений и фотолитографического оборудования и требует менее специализированной подготовки. Тем не менее, потребность в фотомасках по-прежнему создает существенное препятствие для экспериментов, которые требуют легкодоступных изменений в шаблонах.
В дополнение к методам, которые манипулируют геометрией клеток посредством контролируемого осаждения белков ECM на 2D-поверхности, другие стремятся контролировать форму клеток, ограничивая клетки 3D-микроструктурами. Многие исследования адаптировали подход на основе мягкой литографии, описанный выше, для создания 3D, а не 2D, PDMS-камер для изучения зависящих от формы биологических процессов у эмбрионов, бактерий, дрожжей и растений16,17,18,19. Двухфотонная полимеризация (2PP) также взяла на себя инициативу в качестве метода микрофабрикации, который может создавать сложные 3D-гидрогелевые каркасы с нанометровым разрешением20. 2PP опирается на принципы двухфотонной адсорбции, где два фотона, доставленные фемтосекундными импульсами, поглощаются одновременно молекулой - в данном случае фотоинициатором - что обеспечивает локальную полимеризацию фотополимеров21. Этот метод широко использовался для печати 3D-каркасов, которые имитируют нативные структуры ECM тканей человека и, как было показано, вызывают низкое фотохимическое повреждение клеток22.
Дебют микрофотопирования 10 лет назад дал исследователям возможность изготавливать микроструктуры, избегая при этом недоступного и специализированного оборудования. Микрофотопирование создает узоры в микронном масштабе путем термического удаления селективных областей поливинилового спирта (ПВА), покрытых на поверхностях активированного стекла с помощью инфракрасного лазера23,24. Белки ECM, которые прикрепляют только подлежащую стеклянную поверхность, а не ПВА, затем служат биохимическими сигналами, чтобы обеспечить контролируемую динамику распространения и форму клеток. Этот метод также обеспечивает превосходную гибкость, поскольку шаблоны могут быть легко изменены в режиме реального времени. Здесь мы предоставляем пошаговый протокол микрофотопирования с использованием коммерческой многофотонной системы визуализации. Описанный протокол предназначен для быстрого и автоматизированного изготовления больших шаблонов. Мы продемонстрировали, что эти паттерны эффективно контролируют форму клеток, ограничивая геометрию клеточных АДГЕЗИЙ ECM. Наконец, мы демонстрируем, что описанная методика паттернирования модулирует организацию и динамику актинового цитоскелета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Предварительная обработка Coverslip
- Подготовьте скрипучие-чистые крышки, как описано в Waterman-Storer, 199825.
- Готовят 1% (3-аминопропил)триметоксисилан (АПТМС) раствор и инкубируют покровы в растворе в течение 10 мин с мягким перемешиванием. Убедитесь, что чехлы свободно перемещаются в растворе.
- Дважды стирайте крышки с dH2O по 5 мин каждая.
- Приготовьте 0,5% раствор глутаральдегида (GA) и инкубируют покровные листы в растворе в течение 30 мин на шейкере. Для 25 обшивки используйте 50 мл раствора глутарового альдегида. Убедитесь, что чехлы свободно перемещаются в растворе.
- Трижды стирайте крышки с dH2O по 10 мин каждая.
- Отжимают сухие крышки в течение 30 с с помощью специально изготовленного прядильщика. Подробное описание прядильщика обложки было опубликовано26 и доступно онлайн (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Активированные крышки можно хранить до одного месяца при +4 °C в коробке с разделителями так, чтобы они стояли отдельно друг от друга.
2. ПВА покрытие
- Смешайте ПВА (98% гидролизованный ПВА, MW 98000) с dH2O для создания 5,6% раствора.
- Солюбилизируйте смесь на водяной бане при 90 °C и немедленно процежьте через фильтр 0,2 мкм в шкафу биобезопасности в горячем виде. Снова отфильтруйте запасной раствор, если он выпадает в осадок. Раствор ПВА можно хранить при комнатной температуре в течение 3 месяцев.
- В пробирке 15 мл добавьте одну часть HCl к восьми частям ПВА. Осторожно переверкнуйте трубку несколько раз, чтобы перемешать.
- Налейте 2 мл смешанного раствора в чашку Петри 35 мм и погрузите чистый, предварительно обработанный покров в жидкость, заботясь о том, чтобы крышки не прилипали ко дну. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин на шейкере.
- Осторожно извлеките обтекаемые листки из раствора. Используйте спиннер для вращения покрова в течение 40 с. А пока очистите пинцет. Переложите крышку в коробку и высушите при +4 °C в течение ночи. Покрытые ПВА крышки можно хранить при +4 °C до двух недель.
3. Настройка многофотонного микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол настроен на создание клеточных адгезивных микроструктур желаемой формы и размера на вертикальных или перевернутых многофотонных системах визуализации, особенно тех, которые не оснащены аппаратным автофокусом. Таким образом, для каждого поля зрения (FOV) сценарий паттерна аблажирует небольшую область для создания фидуциарного маркера на крышке, использует программный автофокус для фокусировки микроскопа на поверхности покрова и сбрасывает желаемый рисунок. Выполнение этого скрипта в цикле для соседних FOV надежно создает большой массив микроструктур (5 x 5 мм или больше), которые ограничивают форму клеток и модулируют активность внутриклеточных биологических процессов. Описанный протокол разработан для системы визуализации Nikon A1R MP+, управляемой программным обеспечением NIS-Elements. Если для создания шаблонов используется система обработки изображений другого поставщика, оптические конфигурации и сценарий шаблонирования должны быть скорректированы в соответствии с инструкциями производителя.
- Включите программное обеспечение микроскопа. Убедитесь, что объектив "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" установлен на микроскопе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь, оптимизирован для цели погружения в воду 25x/1.1 NA, но другие цели также могут быть использованы для создания шаблонов. Читатели должны знать, что похлопывание с целью с высоким увеличением(например,40x и 60x) занимает больше времени, поскольку это значительно уменьшает количество паттернов, аблятируемых в каждом FOV. Объективы с низким увеличением могут использоваться для создания рисунков, если они обеспечивают равномерное освещение по всему FOV и мощность лазера, достаточную для абляции слоя PVA. - В окне графического интерфейса A1plus MP установите лазерную линию на 750 нм.
- Настройка оптической конфигурации "Image"
ПРИМЕЧАНИЕ: NIS-Elements предоставляет пользователям несколько инструментов (графический интерфейс, конструктор рабочих процессов сбора JOBS, оптические конфигурации и макросы) для управления оборудованием микроскопа. В этом протоколе большая часть аппаратного управления достигается с помощью различных оптических конфигураций, а также модулей ND Acquisition и ND Stimulation.- На вкладке Калибровка нажмите Новая оптическая конфигурация. Назовите оптическую конфигурацию "Образ". Это базовая оптическая конфигурация, которая позволяет визуалить крышку через отражение. Оставьте все остальные параметры по умолчанию и выберите соответствующую цель.
- В окне A1plus MP GUI нажмите кнопку Настройки, чтобы настроить параметры оборудования в этой оптической конфигурации. Установите стимулирующий лазер на ИК-стимуляцию,поместите светоделитель (BS 20/80) в траекторию света, установите для блока сканера значение Galvano и выберите соответствующий десканированный детектор.
- В окне A1plus Compact GUI выберите размер сканирования и время ожидания, достаточные для захвата небольших объектов на обложке (1,1 мс и 1024 пикселя в нашей системе соответственно). Нажмите кнопку Normal, чтобы не выполнять усреднение строк или интеграцию строк. Убедитесь, что установлен флажок Использовать ИК-лазер. Настройте однонаправленное сканирование для простоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если скорость сканирования вызывает беспокойство, можно использовать двунаправленное сканирование. - В этом же окне отрегулируйте мощность лазера и чувствительность детектора, чтобы получить яркое, но не насыщенное изображение поверхности крышки. Установка мощности лазера на 3 - 5% от максимальной мощности и чувствительности детектора (ползунок HV) до 15 В является хорошей отправной точкой.
- В окне Область сканирования A1plus установите для настройки масштаб 1, чтобы захватить весь FOV.
- Сохраните оптическую конфигурацию.
- Настройка оптической конфигурации «Print_Fudiciary_Marker»
- Продублируйте оптическую конфигурацию «Изображение» и переименуйте ее в «Print_Fudiciary_Marker».
- В окне A1plus Compact GUI выберите наименьший размер сканирования и время ожидания (64 пикселя и 80,2 мс в нашей системе соответственно).
- Поскольку на этом этапе визуализация не требуется, установите чувствительность детектора на 0 и увеличьте мощность лазера до 30%. Более высокая мощность лазера термически удалит слой ПВА на крышке в нужных областях.
- В окне A1plus Scan Area установите для параметра Zoom значение maximum (15,87 для нашей системы) и поместите область сканирования в середину поля зрения.
- В окне ND Acquisition настройте эксперимент Z-стека. Установите движение в положении Z в значение Относительный и выберите соответствующее устройство Z. Установите размер шага на 2 мкм, а глубину стека на 10 мкм выше и ниже, чтобы учесть любые неровности в стадии микроскопа или поверхности ПВА между соседними ФОВ.
- Настройка оптической конфигурации "Автофокус"
- Продублируйте оптическую конфигурацию «Изображение» и переименуйте ее в «Автофокус».
- В окне A1plus Scan Area уменьшите коэффициент масштабирования, чтобы FOV был немного больше, чем фидуциарный маркер. Это гарантирует, что другие небольшие функции на крышке не будут мешать автофокусировке.
- В меню Устройства выберите Настройка автофокусировки. Установите толщину сканирования на толщину Z-стека в эксперименте Z-стека (см. шаг 3.5.5). Микроскоп будет сканировать этот диапазон и находить лучшую фокальную плоскость с помощью фидуциарного маркера. Оставьте размер шага по умолчанию.
- Настройка оптической конфигурации «Load_ROI»
- Продублируйте оптическую конфигурацию «Изображение» и переименуйте ее в «Load_ROI».
- В окне A1plus Compact GUI задайте размер сканирования, идентичный размеру маски ROI. Эта оптическая конфигурация будет использоваться для захвата изображения, на которое будет загружена маска ROI. Мы использовали 2048 пикселей для достижения оптимального баланса между разрешением и скоростью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы это захваченное изображение было идентично по размеру маске ROI.
- Настройка оптической конфигурации "Micropattern"
- Продублируйте оптическую конфигурацию «Print_Fiduciary_Marker» и переименуйте ее в «Micropattern».
- Установите для коэффициента масштабирования значение один.
- В окне A1plus MP GUI увеличьте мощность стимулирующего лазера для абляции ПВА и выберите подходящую скорость сканирования (40% и 32 с/кадр в наших экспериментах соответственно).
- В окне Стимуляция ND настройте эксперимент по стимуляции ND. Добавьте несколько фаз в расписание и установите каждую как стимуляцию. Убедитесь, что область и продолжительность стимуляции являются правильными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество фаз может быть отрегулировано в соответствии с толщиной и гладкостью слоя ПВА, а также мощностью лазера, используемого в этой оптической конфигурации. - В этом же окне включите функцию StgMoveMainZ(-1.000,1) перед каждым этапом. Это опять же учитывает любые отклонения в Z-направлении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние и направление, в котором движется объектив, могут быть отрегулированы в соответствии с толщиной и гладкостью слоя ПВА.
- Настройка оптической конфигурации «Label_Surface»
- Продублируйте оптическую конфигурацию «Print_Fudiciary_Marker» и переименуйте ее в «Label_Surface».
- В окне A1plus Compact GUI значительно увеличьте мощность лазера и установите Zoom на один. Высокая мощность лазера, используемая здесь, физически повредит стеклянную крышку и создаст этикетку, видимую невооруженным глазом. Это помогает в обнаружении закономерностей в дальнейших экспериментах.
4. Генерация маски ROI и настройка макроса
- Создание маски ROI
- Используйте Adobe Photoshop или другое доступное программное обеспечение для создания изображения 2048 × RGB 2048. Изображение соответствует FOV под микроскопом(т.е. 532,48 × 532,48 мкм, 0,26 мкм на пиксель). Изображение должно иметь черный (0, 0, 0) фон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ряд коммерческих и бесплатных графических редакторов может использоваться для создания масок ROI для лазерного микроструктурирования. Хотя мы используем Adobe Photoshop для создания масок, GIMP и ImageJ / Fiji также доступны в качестве альтернативных бесплатных вариантов. - Нарисуйте 8 - 12 белых (255 255 255) узоров на черном фоне. Размер узора зависит от типа ячейки (~200 пикселей в диаметре). Оставьте 500 × 500 пустой области в центре изображения для автофокусировки. Оставьте достаточно места между соседними узорами (>200 пикселей) и на грани FOV для оптимальной абляции и прикрепления клеток. Шаблоны, представленные в этом протоколе, доступны на Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
- Используйте Adobe Photoshop или другое доступное программное обеспечение для создания изображения 2048 × RGB 2048. Изображение соответствует FOV под микроскопом(т.е. 532,48 × 532,48 мкм, 0,26 мкм на пиксель). Изображение должно иметь черный (0, 0, 0) фон.
- Настройка макроса
- Щелкните меню Макрос и выберите Новый макрос.
- Импортируйте код "Pattern_Stimulation", доступный на Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning), в окно "Новый макрос". Сохраните этот фрагмент кода в соответствующей папке.
- Откройте другое окно New Macro и импортируйте код "Stage_Movement", доступный на Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Убедитесь, что рабочий каталог "Stage_Movement" в этом коде идентичен каталогу на шаге 4.2.2. Сохраните код "Stage_Movement" в той же папке на шаге 4.2.2.
5. Генерация микроструктур с помощью фотоабляции
- Включите микроскоп и его аксессуары. Убедитесь, что ИК-лазер достаточно прогрелся до этого.
- Перенесите крышку с ПВА-покрытием на держатель. Для вертикального микроскопа убедитесь, что поверхность ПВА абляция обращена вниз.
- Добавьте воду в углы, чтобы стабилизировать крышку, и установите держатель на ступень микроскопа.
- Опустошите объектив и добавьте воду на крышку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь, оптимизирован для цели погружения в воду 25x/1.1 NA. Если используется цель сухого или масляного погружения, воду следует заменить соответствующей погружной средой. Когда цель погружения в воду используется для создания большого массива микроструктур, испарение может стать проблемой. Если это так, воду следует заменить GenTeal, безрецептурной смазкой для глаз, доступной в аптеках. - В программном обеспечении микроскопа включите ИК-лазерный затвор в окне A1plus MP GUI. Нажмите кнопку «Автовыравнивание», чтобы выровнять лазер перед выровнением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно выполнять лазерное автоагнировку в начале каждого сеанса паттернирования, так как небольшие отклонения в лазерном пути значительно повлияют на качество узоров. - Переключитесь на оптическую конфигурацию "Image". В окне A1plus Compact GUI нажмите кнопку Сканировать, чтобы отсканировать FOV, медленно перемещая объект ближе к крышке.
- Внимательно следите за изображением. Сначала изображение будет казаться крайне тусклым. Переместите объект ближе к крышке до тех пор, пока яркость изображения не увеличится. Это поверхность крышки, которая обращена к цели. Продолжайте перемещать объект до тех пор, пока яркость не уменьшится и не увеличится снова. Это поверхность ПВА, которая должна быть узорчатой. Сосредоточьтесь на любой небольшой особенности (несовершенства крышки, пыль и т. д.)на этой поверхности и установите ноль на Z-накопителе. Всегда устанавливайте ноль после фокусировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя обе поверхности крышки покрыты ПВА, оптические свойства стекла существенно не изменяются ПВА-покрытием. Мы регулярно изображаем такие обтекания с помощью сухих, водо- и масляных объективов и не находим необразованную поверхность ПВА, которая мешает визуализации. - Переключитесь на оптическую конфигурацию «Label_Surface». Нажмите на Захват. Вернитесь к оптической конфигурации «визуализации» и сканированию. Поверхность стекла должна быть повреждена и казаться аморфной. Поврежденный участок виден невооруженным глазом, что указывает на расположение узоров в дальнейших экспериментах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы увеличить размер видимой метки, повторите шаг 5.8 в нескольких соседних FOV. - Проверьте еще раз, что цель находится примерно в центре крышки. Убедитесь, что между целью и крышкой достаточно воды. Переместите ступень на 1-2 FOV, чтобы избежать частиц стекла и сканировать для подтверждения.
- В меню Устройства откройте макрос Stage_Movement. Проверьте правильность рабочего каталога Pattern_Stimulation; если нет, стимуляция не произойдет. Задайте для переменных "PatternLength" и "PatternHeight" нужное количество FOV, которые будут шаблонными. Сохраните и запустите макрос.
- После завершения создания шаблона переключитесь на оптическую конфигурацию «Визуализация». Опять же, убедитесь, что ИК-лазерный затвор открыт в окне A1plus MP GUI.
- Переместите рабочую область, чтобы просмотреть узоры. Просканируйте шаблоны, чтобы проверить их качество.
- Перенесите крышку в сетку с узорами, обращенными вверх.
- Храните узорчатые крышки при +4 °C в течение одной недели перед использованием.
6. Адсорбция фибронектина
- Сделать свежий 1 M NaBH4 в 1 M NaOH раствор. Добавляют в соотношении 1:100 к рН 8,0 фосфатного буфера, содержащего 0,2 М этаноламина.
- Перенесите узорчатые крышки на тарелку для культивирование тканей 35 мм. Инкубировать каждую крышку с 1 мл раствора выше в течение 8 мин для гашения автофлуоресценции, а затем промыть 3 раза PBS.
- Разбавляют фибронектин (FN) в PBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Инкубировать крышку в FN в течение 1 ч при +37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается существенное неспецифическое связывание белка ECM с субстратом, FN можно разбавлять в PBS, содержащем 0,1% Pluronic F-12724. - Промыть крышку 2 раза с помощью PBS. Если не используется сразу, храните в PBS при +4 °C в течение ночи.
7. Прикрепление клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол оптимизирован для первичных фибробластов ребров человека.
- Культивировать 10 см чашку из клеток до 70% слияемости.
- Разогрейте питаемую целлюлозу, PBS и 0,05% трипсина на водяной бане +37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеток, которые слабо прилипают к субстрату, непротеолитическая диссоциация с versene (0,48 мМ ЭДТА) или запатентованным буфером без ферментов может увеличить прикрепление клеток к паттернам и должна быть рассмотрена. - Перед посевом клеток переместите узорчатый покров в чистую 35-миллиметровую чашку для посева тканей, содержащую 1 мл теплого PBS.
- Аспирировать питательную целлюлозу из 10 см чашки для культуры тканей и вымыть один раз PBS.
- Добавьте в чашку 700 мкл 0,05% трипсина/ЭДТА и инкубируют клетки в инкубаторе +37 °C, 5% CO2 в течение 1 мин.
- В то же время аспирировать PBS, покрывая узорчатый покров, и добавить 1 мл клеточной культуры.
- Убедитесь, что ячейки отсоединены. Затем повторно суспендировать трипсинизированные клетки с 10 мл клеточной культуры и добавить 1 мл к узорчатой крышке.
- Культивируйте клетки в инкубаторе в течение 2 – 3 ч и проверяйте, достаточно ли количество клеток прикрепило к узорам. Если это так, измените носитель один раз, чтобы удалить неприкрепленные ячейки. Это сводит к минимуму вероятность того, что несколько клеток приземлятся на один и тот же шаблон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время вложения может варьироваться в зависимости от типа ячейки. - Еще через 3-4 ч, или когда достаточное количество клеток распространилось по узорам, клетки готовы к дальнейшим экспериментам. Не ждите слишком долго, чтобы избежать деления клеток.
8. Сбор данных
- Фиксируют клетки с 4% PFA в буфере цитоскелета27 в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Следуйте протоколам иммунофлуоресценции, установленным для интересующих белков. Покрытые ПВА чехлы хорошо работают с любым протоколом иммунофлуоресценции.
- Получайте изображения клеток с помощью соответствующего микроскопа. В зависимости от цели эксперимента, изображение одной или нескольких клеток на FOV.
9. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол позволяет пользователям получать средний флуоресцентный сигнал интересуемого белка над большим количеством клеток из Z-стеков микроскопических изображений.
- Откройте полученные изображения в NIS Elements и обрежьте изображения. Убедитесь, что каждое изображение содержит только одну хорошо распределенную ячейку. Подробную инструкцию по обработке изображений можно найти в скрипте ниже.
- Установите Anaconda и запустите Spyder через Anaconda Navigator.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сценарии .py могут быть запущены в любой среде с соответствующими пакетами, указанными в требованиях.txt. Мы рекомендуем Anaconda, потому что она содержит большинство необходимых пакетов для кодов ниже. - Скачайте скрипт с Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) и откройте в Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py"или "Pattern_Averaging_4Channels.py"для изображений с 3 каналами или 4 каналами соответственно).
- Задайте параметры на основе полученных изображений. Подробные описания см. в скрипте.
- Нажмите клавишу F5, чтобы запустить сценарий. Ход выполнения можно отслеживать на панели консоли.
- Извлеките выходные файлы, сохраненные в той же папке. Выходные изображения являются средним значением каждого канала для всех образцов. Лист Excel показывает среднюю интенсивность каждого канала в ячейке образца, что позволяет проводить дальнейший количественный анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Качество экспериментальных данных, полученных с помощью микроструктурирования, во многом зависит от качества паттернов. Чтобы определить качество рисунков, полученных с помощью приведенного выше метода, мы сначала использовали отражательную микроскопию для оценки формы и размера фотоаблированных областей покровного листа. Мы обнаружили, что каждый отдельный рисунок выглядел очень похожим на маску абляции и отображал четкие бордюры и поверхность, которая равномерно отражала свет(рисунок 2B). Различные формы и размеры могут быть напечатаны в зависимости от желаемой архитектуры цитоскелета, но мы использовали форму арбалета, которая наилучшим образом соответствует нашим целям. Атомно-силовая микроскопия (AFM) показала, что такие узоры были приблизительно 140 нм в высоту и имели гладкую поверхность с минимальными топологическими вариациями по всему(рисунок 2F). Неоптимальные настройки паттернов, такие как низкая мощность лазера и неправильная фокальная плоскость, привели к неполному удалению поверхности ПВА, которая проявляется как более темные, частичные узоры с неравномерной топологией(рисунок 2C). Установка слишком высокой мощности лазера приводила к «пузырьку» ПВА и при экстремальных повреждениях поверхности покрова, что также нежелательно(рисунок 2D).
В предварительных экспериментах мы попытались увеличить площадь паттерна, снизив несколько FOV на одном крышке. Мы обнаружили, что такой подход, хотя и работает в принципе, ненадежен и утомителен из-за Z-дрейфа подставки микроскопа и небольшого наклона крышки. Для достижения высококачественных шаблонов на большом количестве FOV в автоматическом режиме мы внедрили настраиваемый макрос, который улучшил точность фокусировки микроскопа во время процесса моделирования. В многофотонном микроскопе используется импульсный лазер, который эффективно разлагает ПВА с высокой мощностью в узкой фокальной плоскости, делая процесс моделирования чувствительным к любым неравномерности или наклону в образце. В результате важно определить точную фокальную плоскость в каждом ФОВ. Это еще более проблематично для систем, не имеющих идеального модуля фокусировки, поскольку отклонения всего от одного до двух микрон могут сделать процесс моделирования бесплодным. Чтобы решить эту проблему, настраиваемый макроскрипт сначала шаблонно шаблонизирует небольшой квадрат в центре каждого нового FOV, который должен быть только приблизительно в фокусе, сканируя через относительно толстый Z-стек (≈20 мкм). Затем микроскоп быстро сканирует стек изображений и использует функцию автофокусировки NIS Elements для определения оптимальной фокальной плоскости. Затем маска шаблона загружается и устанавливается в качестве стимуляции ROI для ИК-стимуляции. Стадия впоследствии переходит к следующему FOV и повторяет этот процесс. Кроме того, квадратно-волновой путь движения ступени микроскопа обеспечивал минимальное накопление ошибок между последовательными FOV. Используя этот протокол, мы обычно изготавливаем узоры, состоящие из 49 микроскопических FOV, покрывающих площадь 3,5 x 3,5 мм крышки менее чем за 3 ч.
Чтобы проверить, могут ли узорчатые участки, а не невозмутимый ПВА, адсорбировать белки ECM, мы покрыли узорчатые покровные листы 10 мкг / мл FN и окрасили их антителами против FN. Используя широкоугольную флуоресцентную микроскопию, мы обнаружили, что FN равномерно адсорбируется в узорчатых областях, где ПВА был удален лазерной абляцией(рисунок 2E).
Чтобы определить, может ли архитектура цитоскелета и распределение натяжения быть изменены, как ожидалось на паттернах, мы посеяли клетки на узорчатых покровных листах и визуализировали распределение легкой цепи миозина, маркера сократимости, с помощью флуоресцентной микроскопии. После первоначального посева клетки постепенно тяготели к покровному листу. Те, которые приземлились на узорчатые участки, со временем прикрепились и распространились в форму узора. Те, которые приземлились на ПВА, только слабо прикреплены и были удалены после нескольких стирок и смены среды. Мы обнаружили, что клетки, распределенные по паттернам, отображали фенотипические фибробластные структуры, включая актин-плотный край ламеллиподий, толстые вентральные напряженные волокна вдоль двух сторон и дорсальные напряженные волокна, исходящие из ламеллиподий, соединенных поперечными дугами(рисунок 3A). Легкая цепь миозина (MLC) сидела за плотным ободом ламеллиподии и демонстрировала полосатый рисунок вдоль пучков актина. Как показывают усредненные изображения многих клеток, этот фенотип был согласован по большому количеству паттернов(рисунок 3B).
Рисунок 1. Схема микроструктурирования С помощью ИК-лазера (микрофотопа). (A) Стеклянные крышки химически сопряжены с APTMS, GA и PVA в соответствующем порядке. Поверхность ПВА не адгезивна к клеткам и белкам. (B)ПВА удаляется в заданных паттернах ИК-лазером. (C) Узорчатые покровные листы покрыты белком ECM, который будет адсорбироваться только в узорчатых областях. (D) Клетки покрыты на обшивках, фиксированными и иммуноокраженными для белков, представляющих интерес. Клетки, которые приземляются на узорчатых островах, распространяются в форме узора, который дает начало характерным цитоскелетным структурам, в то время как те, которые приземляются на ПВА, остаются сферическими. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Валидация и характеристика микроструктур. (A)ИК-лазерная установка микроструктурирования (микрофотопа) на сцене микроскопа. ИК-лазер термически аблаирует ПВА в нескольких FOV. (B)Изображение микроскопии отражательной микроскопии микроструктур, которые имеют четкие бордюры и идентичны маскам ROI. (C) Изображение отражательной микроскопии неполного удаления ПВА в результате неоптимальной мощности лазера. (D) Изображение отражательной микроскопии пузырьков ПВА в результате избыточной мощности лазера. (E)Иммунофлуоресцентные изображения покрытых FN узорчатых покровных слипов, окрашенных первичными антителами против FN и флуорофорно-конъюгированных вторичными антителами. (F) Линия сканирования топологии AFM и репрезентативное изображение AFM шаблона арбалета. Для измерения топологии микрошаблонного изображения в контактном режиме выполняли с помощью зонда Bruker AFM (MLCT-B), установленного на атомно-силовом микроскопе NanoWizard 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Репрезентативные изображения клеток, покрытых микропаттернами. (A) Репрезентативные изображения первичного фиброблата человека, покрытого арбалетными узорами, иммуноокрашивающимися для актина и MLC. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа, оснащенного 100-кратным объективом. (B) Усредненные иммунофлуоресцентные изображения актина и MLC в клетках, покрытых арбалетными узорами, сгенерированными пользовательским скриптом Python. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Приведенные выше результаты демонстрируют, что описанный протокол микроструктурирования (микрофотопа) с помощью ИК-лазера обеспечивает воспроизводимые адгезивные паттерны различных форм, что позволяет манипулировать формой клеток и цитоскелетной архитектурой. Хотя многочисленные методы микроструктурирования были разработаны как до, так и после дебюта микрофотопирования, этот метод обладает рядом преимуществ. Во-первых, он не требует специализированного оборудования и чистых помещений, которые обычно встречаются только в инженерных отделах. Фактически, поскольку многофотонные микроскопы становятся все более распространенным явлением в отделах биологии, микрофотопирование расширяет применение многофотонного микроскопа и добавляет к потенциальному пулу пользователей. Узоры также могут быть изменены по требованию и напечатаны немедленно, вместо того, чтобы изготавливать новую мастер-пластину, что влечет за собой длительный процесс литографии.
По сравнению с ранее существовавшей протоколом микрофотопирования, одним из улучшений в нашем протоколе является устранение нескольких трудоемких этапов отверждения во время подготовки укрытия. Мы показываем, что качество крепления ПВА-чехла остается ненарушенным, поскольку узоры все еще были неповрежденными и могли связывать клетки даже через две недели после изготовления. Что еще более важно, мы улучшили автоматизацию процесса моделирования, исключив необходимость предустановки положения каждого FOV24. Вместо этого мы реализуем понятный макрос, который позволяет моделирует большую площадь, точно определяя оптимальную фокальную плоскость каждого FOV.
Хотя макросы в протоколе позволяют автоматизировать шаблоны в нашей системе, мы понимаем, что каждый коммерческий лазерный сканирующий микроскоп поставляется со своим собственным проприетарным программным обеспечением, которое редко совместимо с другими, что затрудняет реализацию нашего точного протокола на других системах. Тем не менее, общий рабочий процесс может быть хорошо адаптирован к другим коммерческим системам для облегчения автоматизированного микроструктурирования, а именно к процессу сосредоточения внимания на каждом отдельном FOV, загрузке маски, абляции PVA и перемещению ступени микроскопа в новый FOV.
Несколько шагов в протоколе шаблонирования должны быть предприняты с большой осторожностью для обеспечения эффективного шаблонирования. Наиболее важным шагом является оптимизация условий стимуляции перед генерацией паттернов. В многофотонной микроскопии два или более фотона должны почти одновременно прибывать к флуоресцентной молекуле и объединять свою энергию для возбуждения флуоресценции. Это событие с низкой вероятностью создает чрезвычайно тонкий оптический участок, который увеличивает отношение сигнал/шум28. Хотя эта функция полезна для визуализации, она делает удаление тонкого ПВА-покрытия чрезвычайно чувствительным к Z-положению образца. Для противодействия этому можно принять ряд мер. Во-первых, мощность лазера должна быть точно настроена, чтобы обеспечить тщательное удаление ПВА без «кипения» полимера или повреждения стеклянной крышки. Если удаление ПВА постоянно является неполным, мы рекомендуем проверить лазерное выравнивание, так как это обычно увеличивает мощность лазера. Во-вторых, стадия микроскопа должна быть выровняна, чтобы избежать наклона образца, что может привести к неполным картинам. ИК-стимуляция в нескольких Z-положениях также должна быть настроена, чтобы гарантировать, что слой ПВА является целевым. В качестве альтернативы, если микроскоп оснащен идеальным модулем фокусировки, могут быть проведены предварительные испытания для определения оптимального смещения в Z-положении для нацеливания на ПВА. Другим важным шагом является настройка макроскопа, который позволяет автоматически интенсировать паттерн. Макрос должен находить фокальную плоскость каждого нового FOV, чтобы избежать осложнений от наклона образца или неровности поверхности. Это также должно позволять сцене перемещаться в S-образной форме от строки к строке, аналогично траектории, прочерченной при двунаправленном сканировании, чтобы свести к минимуму отклонения в Z между последовательными FOV.
Одним из ограничений описанного протокола является время, необходимое для производства большого количества узорчатых обложек, что является беспрецедентным преимуществом, предлагаемым микроконтактной печатью наоснове литографии 29,30. В результате этот протокол лучше всего подходит для экспериментов, в которых требуется ограниченное количество условий или тех, которые требуют легкодоступных корректировок формы и размера узора. Кроме того, для систем, в которых отсутствует аппаратный модуль автофокусировки, мы интегрируем серию событий стимуляции в разных Z-плоскостях, чтобы обеспечить автоматизированное и эффективное удаление ПВА. Поскольку ИК-стимуляция является наиболее трудоемким шагом, добавление каждого события стимуляции (~ 30 секунд) значительно удлиняет процесс моделирования. Если время вызывает беспокойство, мы предлагаем тонкую настройку автофокуса путем уменьшения размера шага. Это облегчает определение наилучшей фокальной плоскости, которая уменьшит количество необходимых событий ИК-стимуляции. В наших экспериментах уменьшение количества событий стимуляции с пяти до двух сокращает время вдвое (1,5 ч).
В заключение, протокол микроструктурирования (microphotopatterning) с помощью ИК-лазера, который мы описываем, может использоваться в любой лаборатории, которая имеет доступ к микроскопу, оснащенного ИК-лазером. В дополнение к изучению цитоскелетной архитектуры и сигнальных путей, которые связывают форму с функцией, этот метод также может быть применен к скринингу лекарств и другим приложениям, чувствительным к межклеточной изменчивости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не раскрывают конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана премией Connaught Fund New Investigator Award для S.P., Канадским фондом инноваций, Грантовой программой NSERC Discovery (гранты RGPIN-2015-05114 и RGPIN-2020-05881), Объединенным исследовательским фондом Манчестерского университета и Университета Торонто и Программой XSeed Университета Торонто. C.T. был поддержан стипендией NSERC USRA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
References
- Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
- Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
- Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
- Paluch, E., Heisenberg, C. -P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
- Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
- Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
- Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
- Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
- Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
- Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
- Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
- Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
- Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
- Waterman-Storer, C. M.
- Inoué, S., Spring, K. R. Video Microscopy: The Fundamentals. , Springer. US. (1997).
- Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
- Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0-14 (2013).
