Summary
Protokollet som presenteras här möjliggör automatiserad tillverkning av mikromönster som standardiserar cellform för att studera cytoskeletala strukturer inom däggdjursceller. Denna användarvänliga teknik kan ställas in med kommersiellt tillgängliga bildsystem och kräver inte specialiserad utrustning som är otillgänglig för vanliga cellbiologiska laboratorier.
Abstract
Micropatterning är en etablerad teknik i cellbiologigemenskapen som används för att studera samband mellan morfologi och funktion av cellulära fack samtidigt som komplikationer som härrör från naturliga cell-till-cell variationer kringgås. För att standardisera cellformen är cellerna antingen begränsade i 3D-formar eller kontrollerade för självhäftande geometri genom självhäftande öar. Traditionella mikropapperstekniker baserade på fotolitografi och djup UV-etsning beror dock starkt på rena rum eller specialiserad utrustning. Här presenterar vi en infraröd laserassisterad mikropappersteknik (microphotopatterning) modifierad från Doyle et al. som bekvämt kan ställas in med kommersiellt tillgängliga bildsystem. I detta protokoll använder vi ett Nikon A1R MP + bildsystem för att generera mikromönster med mikronprecision genom en infraröd (IR) laser som brinner förinställda regioner på poly-vinyl alkoholbelagda täcken. Vi använder ett anpassat skript för att möjliggöra automatiserad mönstertillverkning med hög effektivitet och noggrannhet i system som inte är utrustade med en automatisk fokusering av hårdvara. Vi visar att detta IR-laserassisterade mikropappersprotokoll (microphotopatterning) resulterar i definierade mönster som celler fäster uteslutande och tar önskad form. Dessutom kan data från ett stort antal celler medelvärdesförst på grund av standardiseringen av cellformen. Mönster som genereras med detta protokoll, kombinerat med högupplöst bildbehandling och kvantitativ analys, kan användas för relativt höga data flödes skärmar för att identifiera molekylära spelare som förmedlar länken mellan form och funktion.
Introduction
Cellform är en viktig determinant för grundläggande biologiska processer som vävnadsmorfogenes1, cellmigration2, cellproliferation3, och genuttryck4. Förändringar i cellformen drivs av en invecklad balans mellan dynamiska omorganiseringar av cytoskelettet som deformerar plasmamembranet och extrinsiska faktorer som yttre krafter som utövas på cellen och geometrin hos cellcells- och cellmatrisandhesioner5. Migrerande mesenkymala celler, till exempel, polymeriserar ett tätt aktinnätverk i framkant som driver plasmamembranet framåt och skapar en bred lamellipodi6, medan aktomyosinkontraktilitet drar tillbaka cellens smala efterföljande kant för att lossa cellen från sin nuvarande position7,8. Störande signalhändelser som ger upphov till sådana specialiserade cytoskeletala strukturer stör form och polaritet och saktar cellmigration9. Dessutom kräver epitelial arkbockning under gastrulation actomyosin-baserad apical förträngning som gör att celler och deras grannar blir kilformade10. Även om dessa studier belyser vikten av cellform, har den inneboende heterogeniteten i cellformen belastat ansträngningarna att identifiera mekanismer som kopplar morfologi till funktion.
För detta ändamål har många metoder för att manipulera cellform utvecklats under de senaste tre decennierna. Dessa metoder uppnår sitt mål genom att antingen begränsa cellen med en tredimensionell form eller kontrollera cellulär vidhäftningsgeometri genom mönstrad nedfall av extracellulära matrisproteiner (ECM) på en antifoulingyta, en teknik som kallas mikropapper11. Här kommer vi att granska ett antal tekniker som har blivit populära genom åren.
Soft Litografi-baserade mikrokontakttryck var ursprungligen banbrytande som ett tillvägagångssätt för mikroelektroniska tillämpningar och har otvetydigt blivit en kultfavorit12. En master wafer tillverkas först genom att selektivt exponera områden av ett fotoresistbelagt kiselsubstrat till fotoirradiation och lämnar efter sig en mönstrad yta13. En elastomer, såsom PDMS, hälls sedan på huvudskivan för att generera en mjuk "stämpel" som överför ECM-proteiner till ett önskat substrat11,14. När den är tillverkad kan en master wafer användas för att gjuta många PDMS-stämplar som ger upphov till mycket reproducerbara mikromönster12. Mönstren kan dock inte justeras lätt på grund av den långa fotolitografiprocessen. Denna process kräver också högspecialiserad utrustning och renrum som vanligtvis inte är tillgängliga i biologiavdelningar.
På senare tid har direkttryck med djup UV rapporterats kringgå begränsningar som orsakas av traditionella litografibaserade metoder. Djupt UV-ljus riktas genom en fotomask till selektiva områden i ett glaslock belagt med poly-L-lysin-ympad-polyetylenglykol. Kemiska grupper som utsätts för djup UV är fotokonverterade utan användning av ljuskänsliga länkar för att möjliggöra bindning av ECM-proteiner15. Bristen på ljuskänsliga länkar gör det möjligt för mönstrade täcken att förbli stabila vid rumstemperatur i över sju månader15. Denna metod undviker användning av renrum och fotolitografiutrustning och kräver mindre specialiserad utbildning. Kravet på fotomasker utgör dock fortfarande ett betydande hinder för experiment som kräver lättillgängliga mönsterförändringar.
Förutom metoder som manipulerar cellgeometri genom kontrollerad nedfall av ECM-proteiner på en 2D-yta, försöker andra kontrollera cellformen genom att begränsa celler i 3D-mikrostrukturer. Många studier har anpassat det mjuka litografibaserade tillvägagångssättet som beskrivs ovan för att generera 3D, snarare än 2D, PDMS-kammare för att undersöka formberoende biologiska processer i embryon, bakterier, jäst ochväxter 16,17,18,19. Två-foton polymerisation (2PP) har också tagit ledningen som en mikrofabriceringsteknik som kan skapa komplexa 3D-hydrogelställningar med nanometerupplösning20. 2PP förlitar sig på principerna om två-foton adsorption, där två fotoner levereras i femtosekonpulser absorberas samtidigt av en molekyl - fotoinitiator i detta fall - som möjliggör lokal polymerisering av fotopolymerer21. Denna teknik har använts starkt för att skriva ut 3D-byggnadsställningar som efterliknar de inhemska ECM-strukturerna i mänsklig vävnad och har visat sig inducera låg fotokemisk skada på celler22.
Debuten av mikrofotopapper för 10 år sedan gav forskare möjlighet att tillverka mikromönster samtidigt som otillgänglig och specialiserad utrustning undveks. Microphotopatterning skapar mönster på mikronskalan genom att termiskt ta bort selektiva områden av poly-vinylalkohol (PVA) belagd på aktiverade glasytor med en infraröd laser23,24. ECM-proteiner som endast fäster den underliggande glasytan och inte PVA fungerar sedan som biokemiska signaler för att möjliggöra kontrollerad spridningsdynamik och cellform. Denna metod erbjuder också överlägsen flexibilitet eftersom mönster lätt kan ändras i realtid. Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll för mikrofotopapper genom att använda ett kommersiellt multi-fotonavbildningssystem. Det beskrivna protokollet är utformat för snabb och automatiserad tillverkning av stora mönster. Vi visade att dessa mönster effektivt styr cellformen genom att begränsa geometrin hos cell-ECM vidhäftningar. Slutligen visar vi att den beskrivna mönstringstekniken modulerar organisationen och dynamiken i aktin cytoskeleton.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbearbetning av coverlip
- Förbered squeaky-clean coverlips enligt beskrivningen i Waterman-Storer, 199825.
- Förbered 1% (3-aminopropyl)trimetoxisilanlösning (APTMS) och inkubera täckglasen i lösningen i 10 minuter med mild agitation. Se till att täckglasen rör sig fritt i lösningen.
- Tvätta täcken två gånger med dH2O i 5 min vardera.
- Förbered 0,5% glutaraldehydlösning (GA) och inkubera täckglasen i lösningen i 30 minuter på en shaker. För 25 täcken, använd 50 ml glutaraldehydlösning. Se till att täckglasen rör sig fritt i lösningen.
- Tvätta täcken tre gånger med dH2O i 10 min vardera.
- Snurra torra täcken i 30 s med en specialbyggd täckspinnare. En detaljerad beskrivning av omslagsspinnaren har publicerats26 och finns tillgänglig online (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Aktiverade täcken kan förvaras i upp till en månad vid +4 °C i en låda med avdelare så att de skiljer sig från varandra.
2. PVA-beläggning
- Blanda PVA (98% hydrolyserad PVA, MW 98000) med dH2O för att göra en 5,6% lösning.
- Löslighet blandningen i ett 90 °C vattenbad och filtrera omedelbart genom ett 0,2 μm filter i ett biosäkerhetsskåp medan det är varmt. Filtrera lagerlösningen igen om den fälls ut. PVA-lösning kan förvaras i rumstemperatur i 3 månader.
- I ett 15 ml-rör, tillsätt en del HCl till åtta delar PVA. Vänd röret försiktigt några gånger för att blanda.
- Häll 2 ml av den blandade lösningen i en 35 mm Petri-skål och sänk ner ett rent, förbehandlat täckglas i vätskan, var försiktig så att täckena inte fastnar på botten. Inkubera i rumstemperatur i 5 minuter på en shaker.
- Ta försiktigt bort täckglasen från lösningen. Använd täckspinnaren för att snurra kappan i 40 s. Under tiden, rengör pincetten. Överför täckglaset till en låda och torka vid +4 °C över natten. PVA-belagda täcken kan förvaras vid +4 °C i upp till två veckor.
3. Konfigurera multifotonmikroskopet
OBS: Det beskrivna protokollet är uppstämt för att skapa celllimmikromönster av önskad form och storlek på upprätt eller inverterade multi-fotonavbildningssystem, särskilt de som inte är utrustade med en hårdvara autofokus. För varje synfält (FOV) brinner således mönstringsskriptet ett litet område för att skapa en förvaltningsmarkör på omslagsglaset, använder en autofokus för programvara för att fokusera mikroskopet på täckplattans yta och sätter eld på önskat mönster. Om du kör det här skriptet i en slinga för intilliggande FOV:er skapas en stor mängd mikromönster (5 x 5 mm eller större) som begränsar cellformen och modulerar aktiviteten hos intracellulära biologiska processer. Det beskrivna protokollet utvecklades för Nikon A1R MP+ bildsystem som styrs av NIS-Elements programvara. Om ett bildsystem från en annan leverantör används för mönstring bör de optiska konfigurationerna och mönstringsskriptet justeras enligt tillverkarens instruktioner.
- Slå på mikroskopprogramvaran. Se till att målet "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" är monterat på mikroskopet.
OBS: Protokollet som beskrivs här är optimerat för ett 25x/1.1 NA vattensänkningsmål, men andra mål kan också användas för mönstring. Läsarna bör vara medvetna om att pattering med ett högförstoringsmål(t.ex.40x och 60x) tar längre tid eftersom det avsevärt minskar antalet mönster som ablated i varje FOV. Låga förstoringsmål kan användas för mönstring så länge de ger enhetlig belysning över FOV och laserkraft som är tillräcklig för att brinna PVA-skiktet. - I A1plus MP GUI-fönstret ställer du in laserlinjen på 750 nm.
- Ställa in den optiska konfigurationen "Image"
NIS-Elements ger användarna flera verktyg (grafiskt gränssnitt, ett arbetsflödesbyggare JOBS för förvärv, optiska konfigurationer och makron) för att styra mikroskopmaskinvaran. I det här protokollet uppnås det mesta av hårdvarukontrollen genom olika optiska konfigurationer samt ND Acquisition och ND Stimulationsmoduler.- Klicka på Ny optisk konfiguration på fliken Kalibrering. Namnge den optiska konfigurationen "Image". Detta är den optiska baslinjen konfigurationen som gör det möjligt att avbildning av täcklipet genom reflektans. Lämna alla andra alternativ som standard och välj lämpligt mål.
- I fönstret A1plus MP GUI klickar du på knappen Inställningar för att konfigurera maskinvaruinställningarna under den här optiska konfigurationen. Ställ in stimuleringslasern på IR-stim, placera stråldelaren (BS 20/80) i ljusvägen, ställ in skannerenheten på Galvano och välj lämplig descanned-detektor.
- I fönstret A1plus Compact GUI väljer du en skanningsstorlek och uppehållstid som är tillräcklig för att fånga små funktioner på täckglaset (1,1 ms respektive 1 024 pixlar på vårt system). Klicka på knappen Normal så att ingen linje i genomsnitt eller linjeintegration utförs. Kontrollera att rutan Använd IR-laser är markerad. Ställ in enkelriktad skanning för enkelhetens skull.
OBS: Om skanningshastigheten är oroande kan dubbelriktad skanning användas. - I samma fönster justerar du lasereffekt och detektorkänslighet för att få ljus men inte mättad bild av täckplattans yta. Att ställa in lasereffekten på 3 - 5% av maximal effekt- och detektorkänslighet ("HV"-skjutreglaget) till 15 V är en bra utgångspunkt.
- I fönstret A1plus Scan Area ställer du in Zoom på 1 för att fånga hela FOV.
- Spara den optiska konfigurationen.
- Ställa in den optiska Print_Fudiciary_Marker "Print_Fudiciary_Marker"
- Duplicera den optiska konfigurationen "Image" och byt namn på den till "Print_Fudiciary_Marker".
- I fönstret A1plus Compact GUI väljer du den minsta skanningsstorleken och uppehållstiden (64 pixlar respektive 80,2 ms på vårt system).
- Eftersom ingen avbildning krävs i det här steget ställer du in detektorkänsligheten på 0 och ökar lasereffekten till 30 %. Högre laserkraft tar termiskt bort PVA-skiktet på täckglaset i önskade regioner.
- I fönstret A1plus Scan Area ställer du in Zoom på max (15,87 för vårt system) och placerar skanningsområdet i mitten av FOV.
- I fönstret ND-förvärv ställer du in ett Z-stack-experiment. Ställ in rörelsen i Z-läget på Relativ och välj lämplig Z-enhet. Ställ in stegstorleken på 2 μm och stapeldjupet till 10 μm över och under för att ta hänsyn till eventuella ojämnheter i mikroskopsteget eller PVA-ytan mellan intilliggande FOV: er.
- Ställa in den optiska konfigurationen "Autofokus"
- Duplicera den optiska konfigurationen "Image" och byt namn på den till "Autofokus".
- I fönstret A1plus Scan Area minskar du zoomfaktorn så att FOV är något större än förvaltningsmarkören. Detta säkerställer att andra små funktioner på täckglaset inte stör autofokusering.
- Välj Konfigurera automatiskt på menyn Enheter. Ställ in skanningstjockleken på Z-stacken i Z-stackexperimentet (se steg 3.5.5). Mikroskopet skannar genom detta intervall och hittar det bästa fokalplanet med hjälp av förvaltningsmarkören. Lämna stegstorleken som standard.
- Ställa in den optiska Load_ROI "Load_ROI"
- Duplicera den optiska konfigurationen "Image" och byt namn på den till "Load_ROI".
- I fönstret A1plus Compact GUI anger du skanningsstorleken som är identisk med ROI-maskens. Den här optiska konfigurationen används för att ta en bild som ROI-masken ska läsas in på. Vi använde 2048 pixlar för att uppnå en optimal balans mellan upplösning och hastighet.
OBS: Det är viktigt att den här tagna bilden är identisk i storlek med ROI-masken.
- Ställa in den optiska konfigurationen "Micropattern"
- Duplicera den optiska Print_Fiduciary_Marker "den optiska konfigurationen" och byt namn på den till "Micropattern".
- Ställ in zoomfaktorn på en.
- I A1plus MP GUI-fönstret, öka stimuleringslasereffekten för att bränna PVA och välj en lämplig skanningshastighet (40% respektive 32 s / ram i våra experiment).
- I ND Stimulering fönstret, ställa in ett ND stimulering experiment. Lägg till några faser i tidsschemat och ange var och en som stimulering. Se till att stimuleringsområdet och varaktigheten är korrekta.
OBS: Antalet faser kan justeras beroende på PVA-skiktets tjocklek och jämnhet samt den laserkraft som används i denna optiska konfiguration. - Aktivera funktionen StgMoveMainZ(-1.000,1) före varje fas i samma fönster. Detta står återigen för eventuella avvikelser i Z-riktningen.
OBS: Avståndet och riktningen där målet rör sig kan justeras beroende på PVA-skiktets tjocklek och jämnhet.
- Ställa in den optiska Label_Surface "Label_Surface"
- Duplicera den optiska Print_Fudiciary_Marker "Print_Fudiciary_Marker" och byt namn på den till "Label_Surface".
- I A1plus Compact GUI-fönstret ökar du lasereffekten avsevärt och ställer in Zoom på en. Hög laserkraft som används här kommer fysiskt att skada glaslocket och producera en etikett synlig för blotta ögat. Detta hjälper till att lokalisera mönstren i ytterligare experiment.
4. Generera ROI-masken och ställa in makrot
- Generera ROI-masken
- Använd Adobe Photoshop eller annan tillgänglig programvara för att generera en 2048 × 2048 RGB-bild. Bilden motsvarar en FOV under mikroskopet (dvs. 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm per pixel). Bilden ska ha en svart (0, 0, 0) bakgrund.
OBS: Ett antal kommersiella och fria bildredigerare kan användas för att generera ROI-masker för laserassisterad mikropapperning. Även om vi använder Adobe Photoshop för att generera maskerna, är GIMP och ImageJ / Fiji också tillgängliga som alternativa gratisalternativ. - Rita 8 - 12 vita (255 255 255) mönster på den svarta bakgrunden. Mönsterstorleken varierar beroende på celltyp (~200 pixlar i diameter). Lämna ett 500 × 500 tomt område i mitten av bilden för automatisk fokusering. Lämna tillräckligt med utrymme mellan intilliggande mönster (>200 pixlar) och vid FOV:s boarder för optimal ablation och celltillsats. Mönster som presenteras i det här protokollet är tillgängliga på Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
- Använd Adobe Photoshop eller annan tillgänglig programvara för att generera en 2048 × 2048 RGB-bild. Bilden motsvarar en FOV under mikroskopet (dvs. 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm per pixel). Bilden ska ha en svart (0, 0, 0) bakgrund.
- Konfigurera makrot
- Klicka på Makro-menyn och välj Nytt makro.
- Importera koden "Pattern_Stimulation" som är tillgänglig på Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) till fönstret Nytt makro. Spara den här koddelen i en lämplig mapp.
- Öppna ett annat nytt makrofönster och importera koden "Stage_Movement" som är tillgänglig på Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Se till att arbetskatalogen" Stage_Movement" i den här koden är identisk med den i steg 4.2.2. Spara koden "Stage_Movement" i samma mapp i steg 4.2.2.
5. Generera mikromönster med fotoablation
- Slå på mikroskopet och dess tillbehör. Se till att IR-lasern har värmts upp tillräckligt innan detta.
- Överför pva-belagda täcken på en hållare. För ett upprätt mikroskop, se till att PVA-ytan ablated ansikten ner.
- Tillsätt vatten i hörnen för att stabilisera täcket och montera hållaren på mikroskopstadiet.
- Sänk målet och tillsätt vatten på täcket.
OBS: Protokollet som beskrivs här är optimerat för ett 25x/1.1 NA vattensänkningsmål. Om ett torrt mål eller oljesänkningsmål används bör vatten ersättas med ett lämpligt nedsänkningsmedium. När ett vattensänkningsmål används för att generera en stor mikromönstermatris kan avdunstning bli ett problem. Om så är fallet bör vatten ersättas med GenTeal, ett over-the-counter ögonsmörjmedel som finns tillgängligt från apotek. - I mikroskopprogramvaran aktiverar du IR-laserluckan i A1plus MP GUI-fönstret. Klicka på knappen Automatisk justering för att justera lasern före mönstring.
OBS: Det är viktigt att utföra laser autoalignment i början av varje mönstringssession eftersom små avvikelser i laserbanan kommer att påverka mönstrens kvalitet avsevärt. - Växla till den optiska konfigurationen "Image". I fönstret A1plus Compact GUI klickar du på Skanna för att skanna FOV samtidigt som du långsamt flyttar målet närmare täckglaset.
- Övervaka bilden noggrant. Först kommer bilden att se extremt svag ut. Flytta målet närmare täckglaset tills bildens ljusstyrka ökar. Detta är täckplattans yta som står inför målet. Fortsätt att flytta målet tills ljusstyrkan minskar och ökar igen. Detta är PVA-ytan som ska mönstras. Fokusera på alla små funktioner (täcklip brister, damm etc.) på denna yta och ställ noll på Z-enheten. Ställ alltid in noll efter fokusering.
OBS: Även om båda ytorna på täckglaset är belagda med PVA, ändras glasets optiska egenskaper inte signifikant av PVA-beläggning. Vi avbildar rutinmässigt sådana täcken med torra, vatten- och oljesänkningsmål och hittade inte den icke-mönstrade PVA-ytan för att störa avbildningen. - Byt till den optiska Label_Surface "Label_Surface". Klicka på Fånga. Återgå till den optiska konfigurationen och skanningen av "imaging". Glasytan ska skadas och verka amorf. Det skadade området är synligt för blotta ögat, vilket indikerar placeringen av mönster i ytterligare experiment.
OBS: Om du vill öka storleken på den synliga etiketten upprepar du steg 5.8 i flera intilliggande FOV:er. - Kontrollera igen att målet är ungefär i mitten av täckglaset. Se till att det finns tillräckligt med vatten mellan målet och täckglaset. Flytta scenen med 1 till 2 FOV för att undvika glaspartiklar och skanna för att bekräfta.
- Öppna makrot Stage_Movement på menyn Enheter. Kontrollera att arbetskatalogen Pattern_Stimulation arbetskatalogen är korrekt. Om inte, kommer stimulering inte att ske. Ställ in variablerna "PatternLength" och "PatternHeight" på önskat antal FOV:er som ska mönstras. Spara och kör makrot.
- När mönstring är klar växlar du till den optiska konfigurationen "Imaging". Återigen, kontrollera att IR-laserluckan är öppen i A1plus MP GUI-fönstret.
- Flytta scenen för att visa mönstren. Skanna igenom mönstren för att kontrollera deras kvalitet.
- Överför täckglaset till rutnätslådan, med mönster uppåt.
- Förvara mönstrade täcken vid +4 °C i upp till en vecka före användning.
6. Fibronectin adsorption
- Gör fräsch 1 M NaBH4 i 1 M NaOH-lösning. Tillsätt vid ett förhållande på 1:100 till pH 8,0 fosfatbuffert innehållande 0,2 M etanolamin.
- Överför mönstrade täcken till en 35 mm vävnadskulturrätt. Inkubera varje täckglas med 1 ml av lösningen ovan i 8 min för att släcka autofluorescens och skölj sedan 3 gånger med PBS.
- Späd fibronectin (FN) i PBS till en slutlig koncentration på 10 μg/ml. Inkubera täckglaset i FN i 1 timme vid +37 °C.
OBS: Om betydande ospecificerad bindning av ECM-protein till substratet observeras kan FN spädas ut i PBS som innehåller 0,1% pluronisk F-12724. - Tvätta täcket 2 gånger med PBS. Om den inte används omedelbart, förvara i PBS vid +4 °C över natten.
7. Celltillbehör
OBS: Följande protokoll är optimerat för primära mänskliga gingival fibroblaster.
- Kultur en 10 cm skål med celler till 70% konfluens.
- Värm upp cellkultur media, PBS och 0,05% trypsin i ett +37 °C vattenbad.
OBS: För celler som svagt fäster vid substratet kan icke-proteolytisk dissociation med versen (0, 48 mM EDTA) eller en proprietär enzymfri buffert öka cellfästet till mönstren och bör övervägas. - Innan du sår celler, flytta det mönstrade täcket till en ren 35 mm vävnadskulturrätt som innehåller 1 ml varm PBS.
- Aspirera cellkulturmedierna från 10 cm vävnadskulturrätten och tvätta en gång med PBS.
- Tillsätt 700 μL 0,05% trypsin/EDTA i skålen och inkubera celler i en +37 °C, 5% CO2 inkubator i 1 min.
- Under tiden aspirerar du PBS som täcker det mönstrade täcket och lägger till 1 ml cellkulturmedier.
- Bekräfta att cellerna har lossnat. Återanvänd sedan de trypsiniserade cellerna med 10 ml cellkulturmedier och lägg till 1 ml till det mönstrade täckglaset.
- Kulturceller i inkubatorn i 2- 3 h och kontrollera om ett tillräckligt antal celler har fästs vid mönstren. Om så är så är möjligt ändrar du mediet en gång för att ta bort obundna celler. Detta minimerar risken för att flera celler landar på samma mönster.
Observera: Den bifogade tiden kan variera beroende på celltyp. - Efter ytterligare 3-4 h, eller när ett tillräckligt antal celler har spridit sig på mönster, är cellerna redo för ytterligare experiment. Vänta inte för länge för att undvika celldelning.
8. Datainsamling
- Fixera celler med 4% PFA i cytoskeletonbuffert27 i 10 min vid rumstemperatur.
- Följ immunofluorescensprotokoll som upprättats för proteiner av intresse. PVA-belagda täcklips fungerar bra med alla immunofluorescens protokoll.
- Skaffa bilder av celler med lämpligt mikroskop. Beroende på experimentets mål kan du avbilda antingen en eller flera celler per FOV.
9. Bildanalys
OBS: Följande protokoll gör det möjligt för användare att få den genomsnittliga fluorescenssignalen av proteinet av intresse över ett stort antal celler från Z-staplar av mikroskopbilder.
- Öppna de förvärvade bilderna i NIS Elements och beskär bilderna. Kontrollera att varje bild bara innehåller en cell med bra spridning. Detaljerade instruktioner om bildbehandling finns i skriptet nedan.
- Installera Anaconda och starta Spyder via Anaconda Navigator.
OBS: .py skript kan köras i alla miljöer med lämpliga paket som identifieras i .txt. Vi rekommenderar Anaconda eftersom det innehåller de flesta av de nödvändiga paketen för koderna nedan. - Ladda ner manuset från Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) och öppna i Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py" eller "Pattern_Averaging_4Channels.py" för bilder med 3 kanaler respektive 4 kanaler).
- Ange parametrar baserat på de förvärvade bilderna. Se skriptet för detaljerade beskrivningar.
- Tryck på F5 för att köra skriptet. Förloppet kan spåras på konsolpanelen.
- Hämta utdatafilerna som sparats i samma mapp. Utdatabilderna är genomsnittet för varje kanal för alla exempel. Excel-bladet visar medelintensiteten för varje kanal i en exempelcell, vilket möjliggör ytterligare kvantitativ analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten på de experimentella data som erhålls genom mikropapperering är till stor del beroende av mönstrens kvalitet. För att bestämma kvaliteten på mönster som genereras med metoden ovan använde vi först reflektansmikroskopi för att bedöma formen och storleken på de fotoabla områdena på täckglaset. Vi fann att varje enskilt mönster såg mycket ut som ablationsmasken och visade tydliga boarders och en yta som reflekterade ljus enhetligt (Figur 2B). En mängd olika former och storlekar kan skrivas ut beroende på önskad cytoskeletonarkitektur, men vi använde armborstformen som bäst passar våra syften. Atomkraftmikroskopi (AFM) visade att sådana mönster var cirka 140 nm höga och hade en slät yta med minimal topologisk variation i hela (Figur 2F). Suboptimala mönstringsinställningar, såsom låg lasereffekt och felaktigt brännplan, resulterade i ofullständigt avlägsnande av PVA-ytan som manifesterar sig som mörkare, partiella mönster med ojämn topologi (Figur 2C). Att ställa in lasereffekten för hög resulterade i att PVA "bubblade" och när det är extremt täcker ytskador som också är oönskade (Figur 2D).
I preliminära experiment försökte vi öka mönstringsområdet genom att avta flera FOV på ett enda omslag. Vi fann att detta tillvägagångssätt, även om det fungerar i princip, är opålitligt och tråkigt på grund av Z-drift av mikroskopstativet och liten lutning av täckglaset. För att uppnå högkvalitativa mönster över ett stort antal FOV:er på ett automatiserat sätt implementerade vi ett anpassat makro som förbättrade precisionen i mikroskopet med fokusering under mönstringsprocessen. Multifotonmikroskopet använder en pulslaser som effektivt försämrar PVA med hög effekt i ett smalt brännviddsplan, vilket gör mönstringsprocessen känslig för ojämnheter eller lutning i provet. Som ett resultat är det viktigt att identifiera det exakta fokalplanet i varje FOV. Detta är ännu mer problematiskt för system som saknar en perfekt fokusmodul, eftersom avvikelser så lite som en till två mikron kan göra mönstringsprocessen fruktlös. För att lösa det här problemet mönstrar det anpassade makroskriptet först en liten kvadrat i mitten av varje ny FOV som bara behöver vara ungefär i fokus genom att skanna igenom en relativt tjock Z-stack (≈20 μm). Mikroskopet skannar sedan snabbt igenom bildstacken och använder funktionen NIS Elements autofokus för att identifiera det optimala fokalplanet. Mönstermasken laddas sedan och ställs in som stimulering ROI för IR-stimulering. Scenen flyttas därefter till nästa FOV och upprepar denna process. Dessutom säkerställde den fyrkantiga vågformade banan för mikroskopstegets rörelse minimal felackumulering mellan sekventiella FOV: er. Genom att använda detta protokoll tillverkar vi rutinmässigt mönster som består av 49 mikroskop-FOV som täcker 3,5 x 3,5 mm yta av täcket på mindre än 3 timmar.
För att testa om mönstrade områden, inte ostörd PVA, kunde adsorbera ECM-proteiner, belade vi mönstrade täcken med 10 μg/mL FN och färgade dem med anti-FN-antikroppar. Med hjälp av bred fältfluorescerande mikroskopi fann vi att FN enhetligt adsorberade till de mönstrade områdena där PVA hade avlägsnats genom laserablation (Figur 2E).
För att avgöra om cytoskeletton arkitektur och spänningsfördelning kunde ändras som förväntat på mönstren, sådde vi celler på mönstrade täcklips och visualiserade fördelningen av myosin ljuskedja, en markör för kontraktilitet, genom fluorescensmikroskopi. Efter inledande sådd graviterade cellerna gradvis mot täcket. De som landade på mönstrade områden kopplade och spridda till mönstrets form över tid. De som landade på PVA fästes endast löst och togs bort efter flera tvättar och medieförändringar. Vi fann att celler sprids på mönster som visas fenotypiska fibroblaststrukturer inklusive en aktintät kant av lamellipodi, tjocka ventrala stressfibrer längs de två sidorna och dorsala stressfibrer som härrör från lamellipodin ansluten av tvärgående bågar (Figur 3A). Myosin ljuskedja (MLC) satt bakom den täta lamellipodiakanten och visade ett strimmigt mönster längs aktinbuntar. Som framgår av genomsnittliga bilder av många celler var denna fenotyp konsekvent över ett stort antal mönster (figur 3B).
Figur 1. Schematisk för IR-laserassisterad mikropapperning (mikrofotopapper). A)Glaslock konjugeras kemiskt med APTMS, GA och PVA i respektive ordning. PVA-ytan är icke-lim till celler och proteiner. (B) PVA avlägsnas i förinställda mönster med en IR-laser. C)Mönstrade täcken är belagda med ett ECM-protein som endast adsorberar till mönstrade områden. D)Cellerna pläteras på täcklips, fasta och immunstained för proteiner av intresse. Celler som landar på mönstrade öar sprider sig till formen av mönstret som ger upphov till karakteristiska cytoskeletala strukturer, medan de som landar på PVA förblir sfäriska. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Mikromönstervalidering och karakterisering. ( A) IR-laserassisterad mikropappersinstallation (microphotopatterning) på ett mikroskopstadium. IR-lasern brinner termiskt PVA i flera FOV. B)En reflektansmikroskopibild av mikromönster som har tydliga boarders och är identiska med ROI-maskerna. C)En reflektansmikroskopibild av ofullständigt avlägsnande av PVA till följd av suboptimal lasereffekt. (D) En reflektansmikroskopibild av PVA som bubblar till följd av överskott av laserkraft. (E) Immunofluorescensbilder av FN-belagda mönstrade täcken färgade med anti-FN primära antikroppar och fluorophore-konjugerade sekundära antikroppar. (F) En AFM topologi skanning linje och en representativ AFM bild av ett armborst mönster. För att mäta mikroskopets topologi utfördes kontaktlägesavbildning med hjälp av en Bruker AFM-sond (MLCT-B) monterad på ett NanoWizard 4 atomkraftmikroskop. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3. Representativa bilder av celler pläterade på mikromönster. A)Representativa bilder av en primär human gingival fibroblast pläterad på armborstmönster immunostained för aktin och MLC. Bilder förvärvades med ett konfokalt mikroskop utrustat med ett 100x mål. (B) Genomsnittliga immunofluorescensbilder av aktin och MLC i celler pläterade på armborstmönster som genereras av ett anpassat Python-skript. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultaten ovan visar att det beskrivna IR-laserassisterade mikropatterning (microphotopatterning) protokollet ger reproducerbara vidhäftande mönster av olika former som möjliggör manipulering av cellform och cytoskeletal arkitektur. Även om många mikropappersmetoder har utvecklats både före och efter debuten av mikrofotopatterning, har denna metod flera fördelar. För det första kräver det inte specialiserad utrustning och renrum som vanligtvis bara finns inom tekniska avdelningar. Faktum är att eftersom multifotonmikroskop blir en vanligare syn på biologiavdelningar, utökar mikrofotopatterning tillämpningarna av multifotonmikroskopet och lägger till den potentiella poolen av användare. Mönster kan också ändras på begäran och skrivas ut omedelbart, istället för att behöva tillverka en ny master wafer som innebär en lång litografiprocess.
Jämfört med det befintliga mikrofotopappersprotokollet är en förbättring av vårt protokoll eliminering av flera tidskrävande härdningssteg under coverlip-förberedelse. Vi visar att kvaliteten på PVA-coverlip bilaga förblir ostört eftersom mönstren fortfarande var intakta och kunde binda celler även två veckor efter tillverkning. Ännu viktigare är att vi förbättrade automatiseringen av mönstringsprocessen genom att eliminera behovet av att förinställda positionen för varje FOV24. Istället implementerar vi ett förståeligt makro som möjliggör mönstring av ett stort område samtidigt som vi exakt identifierar det optimala fokalplanet för varje FOV.
Även om makrona i protokollet möjliggör automatisering av mönstring på vårt system, förstår vi att varje kommersiellt laserskanningsmikroskop levereras med sin egen proprietära programvara som sällan är kompatibel med andra, vilket gör det svårt att implementera vårt exakta protokoll på andra system. Det övergripande arbetsflödet kan dock vara väl anpassat till andra kommersiella system för att underlätta automatiserad mikroskopering, nämligen processen att fokusera på varje enskild FOV, ladda masken, brinna PVA och flytta mikroskopstadiet till en ny FOV.
Flera steg i mönstringsprotokollet bör vidtas med stor försiktighet för att säkerställa effektiv mönstring. Det mest kritiska steget är att optimera stimuleringsförhållandena innan du genererar mönster. I multi-fotonmikroskopi måste två eller flera fotoner anlända nästan samtidigt till en fluorescerande molekyl och kombinera sin energi för att excite fluorescens. Denna låg sannolikhetshändelse skapar en extremt tunn optisk sektion som ökar signal-till-brusförhållandet28. Även om den är fördelaktig för avbildning, gör denna funktion avlägsnandet av den tunna PVA-beläggningen extremt känslig för provets Z-läge. Flera åtgärder kan vidtas för att motverka detta. För det första bör lasereffekt finjusteras för att säkerställa noggrann borttagning av PVA utan att "koka" polymeren eller skada glaslocket. Om PVA-borttagningen är konsekvent ofullständig rekommenderar vi att du kontrollerar laserjusteringen eftersom detta vanligtvis ökar lasereffekten. För det andra bör mikroskopstadiet jämnas för att undvika provlutning, vilket kan resultera i ofullständiga mönster. IR-stimuleringar i flera Z-lägen bör också inrättas för att säkerställa att PVA-skiktet är riktat. Alternativt, om mikroskopet är utrustat med en perfekt fokusmodul, kan preliminära tester utföras för att bestämma den optimala förskjutningen i Z-position för PVA-inriktning. Ett annat viktigt steg är att ställa in ett mikroskopmakro som möjliggör mönsterstimulering på ett automatiserat sätt. Makrot bör hitta fokalplanet för varje ny FOV för att undvika komplikationer från provlutning eller ytjämförhet. Det bör också tillåta scenen att röra sig i en S-form från rad till rad, analog med den bana som tas i dubbelriktad skanning, för att minimera avvikelser i Z mellan på varandra följande FOV: er.
En begränsning av det beskrivna protokollet är den tid som krävs för att producera ett stort antal mönstrade täcklips, en oöverträffad fördel som erbjuds av litografibaserad mikrokontakttryck29,30. Som ett resultat är detta protokoll bäst lämpat för experiment där ett begränsat antal villkor krävs, eller de som kräver lättillgängliga justeringar i mönsterform och storlek. För system som saknar en autofokusmodul för hårdvara integrerar vi dessutom en serie stimuleringshändelser i olika Z-plan för att säkerställa automatiserad och effektiv PVA-borttagning. Eftersom IR-stimulering är det mest tidskrävande steget förlänger tillägget av varje stimuleringshändelse (~ 30 sek) avsevärt mönstringsprocessen. Om tiden är oroande föreslår vi finjustering av autofokus genom att minska stegstorleken. Detta underlättar identifieringen av det bästa fokalplanet vilket kommer att minska antalet IR-stimuleringshändelser som krävs. I våra experiment minskar antalet stimuleringshändelser från fem till två tiden med hälften (1,5 timmar).
Sammanfattningsvis kan IR-laserassisterad mikroskopering (microphotopatterning) som vi beskriver användas i alla labb som har tillgång till ett IR-laserutrustat mikroskop. Förutom att studera cytoskeletal arkitektur och signalvägar som ansluter form till funktion, kan denna teknik också tillämpas på läkemedelsscreening och andra applikationer som är känsliga för cell-till-cell variabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna avslöjar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Connaught Fund New Investigator Award till S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (grants RGPIN-2015-05114 och RGPIN-2020-05881), University of Manchester och University of Toronto Joint Research Fund och University of Toronto XSeed Program. C.T. stöddes av NSERC USRA-stipendiet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
References
- Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
- Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
- Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
- Paluch, E., Heisenberg, C. -P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
- Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
- Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
- Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
- Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
- Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
- Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
- Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
- Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
- Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
- Waterman-Storer, C. M.
- Inoué, S., Spring, K. R. Video Microscopy: The Fundamentals. , Springer. US. (1997).
- Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
- Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0-14 (2013).
