Summary
Her beskriver vi knoglemarvseksplantersmetoden, fra prøvepræparat til mikroskopisk diasanalyse, for at evaluere megakaryocytternes evne til at danne proplatelets.
Abstract
Den sidste fase af megakaryopoiesis fører til cytoplasmaiske udvidelser fra modne megakaryocytter, de såkaldte proplatelets. Meget er blevet lært om proplatelet formation ved hjælp af in vitro-differentieredemegakaryocytter; der er dog en stigende dokumentation for, at konventionelle kultursystemer ikke trofast generobrer den differentierings-/modningsproces, der finder sted inde i knoglemarven. I dette manuskript præsenterer vi en explant metode oprindeligt beskrevet i 1956 af Thiéry og Bessis at visualisere megakaryocytter, som er modnet i deres oprindelige miljø, og dermed omgå potentielle artefakter og fejlfortolkninger. Friske knoglemarv opsamles ved at skylle lårbenene på mus, skæres i 0,5 mm tværsnit og placeres i et inkubationskammer ved 37 °C, der indeholder en fysiologisk buffer. Megakaryocytter bliver gradvist synlige i eksplantens periferi og observeres op til 6 timer under et omvendt mikroskop koblet til et videokamera. Over tid ændrer megakaryocytter deres form, hvor nogle celler har en sfærisk form, og andre udvikler tykke udvidelser eller udvider mange tynde proplatelets med omfattende forgrening. Der gennemføres både kvalitative og kvantitative undersøgelser. Denne metode har den fordel at være enkel, reproducerbar, og hurtigt som mange megakaryocytter er til stede, og klassisk halvdelen af dem danner proplatelets i 6 timer i forhold til 4 dage for kultiverede mus megakaryocytter. Ud over studiet af mutantmus er en interessant anvendelse af denne metode den enkle evaluering af de farmakologiske agenser på proplateletudvidelsesprocessen uden at forstyrre den differentieringsproces, der kan forekomme i kulturer.
Introduction
Knoglemarvseksplanter teknik blev først udviklet af Thiéry og Bessis i 1956 til at beskrive dannelsen af rotte megakaryocyt cytoplasmaiske udvidelser som en indledende begivenhed i blodplade dannelse1. Ved hjælp af fasekontrast og filmiske teknikker karakteriserede disse forfattere omdannelsen af modne runde megakaryocytter til "blækspruttelignende" trombocytogene celler med cytoplasmaiske udvidelser, der viser dynamiske bevægelser af forlængelse og sammentrækning. Disse arme bliver gradvist tyndere, indtil de bliver filiform med små hævelser langs armene og ved spidserne. Disse typiske megakaryocyt forlængelser, opnået in vitro og i flydende medier, har visse ligheder med blodplader observeret i fast knoglemarv, hvor megakaryocytter stikker lange udvidelser gennem sinusoide vægge ind i blodcirkulationen2,3. Opdagelsen og kloning af TPO i 1994, lov til at differentiere megakaryocytter i kultur i stand til at danne proplatelet udvidelser ligner dem, der er beskrevet i knoglemarvs explants4,5,6. Men megakaryocyt modning er langt mindre effektiv i kulturforhold, især den omfattende interne membran netværk af knoglemarvs modnet megakaryocytter er underudviklet i kultiverede megakaryocytter, hæmmer undersøgelser af mekanismerne i blodplade biogenese7,8.
Vi detaljer her knoglemarvs explant model, baseret på Thiéry og Bessis, at følge i realtid proplatelet dannelse af mus megakaryocytter, som har fuldt modnet i deres oprindelige miljø, og dermed omgå mulige in vitro artefakter og fejlfortolkninger. Resultater opnået i vilde voksne mus præsenteres for at illustrere megakaryocyts evne til at udvide proplatelets, deres morfologi og kompleksiteten af proplatelets. Vi introducerer også en hurtig kvantificeringsstrategi for kvalitetsvalidering for at sikre datanøjagtighed og robusthed under megakaryocyt-optagelsesprocessen. Protokollen præsenteres her er den seneste version af den metode, der er udgivet som en bog kapitel tidligere9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med europæiske standarder 2010/63/EU og CREMEAS's komité for etik i dyreforsøg ved universitetet i Strasbourg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Tilberedning af reagenser
- Forbered reagenser som beskrevet i tabel 1.
- For Stock I opløses hvert pulver separat. Sørg for, at præparatets svingninger er højere end 295 mOsm/L. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i et år.
- Til tyroderens bufferpræparat skal opløsningen fremstilles som beskrevet i tabel 1, lydstyrken justeres til 100 mL med destilleret vand og tilsættes 0,1 g vandfri D (+) saccharose. Juster til pH 7.3 ved hjælp af 1 N HCl efter behov og osmolarity til 295 mOsm / L. For at forhindre bakterievækst tilsættes penicillin G ved 10 U/mL endelig koncentration og streptomycinsulfat ved 0,29 mg/mL endelig koncentration. Den endelige opløsning filtreres gennem 0,22 μm porer.
2. Forberedelse af forsøgs-opsætningen
- På dagen for forsøget opvarmes tyroderens buffer ved 37 °C, og mikroskopets varmekammer tændes for at bringe temperaturen op på 37 °C.
- Forbered alle de nødvendige værktøjer, såsom en timer, inkubationskamre, 5 ML sprøjter, 21 G, sammenkædninger, barberblad, Pasteur pipetter, glasrutschebaner og 15 mL centrifugerør (Figur 1A).
3. Isolering af musen knoglemarv
- Aflive C57BL/6 mus i alderen 8-12 uger ved CO2 kvælning og cervikal dislokation. Dette bør gøres hurtigt af en kompetent og kvalificeret person.
- For at undgå mikrobiel forurening skal musens krop lægges i blød i 70% (v/v) ethanol, før lårbenet fjernes. Brug instrumenter desinficeret i 70% ethanol til dissektionen. Saml de to lårben og rense dem ved at fjerne enhver klæbende væv. Efter hurtig nedsænkning i ethanol, placere dem i 15 mL centrifuge rør, der indeholder 2 mL Tyrode buffer.
- Skær epifyserne væk ved hjælp af et skarpt barberblad og skyl knoglemarven ved hjælp af en 5 mL sprøjte fyldt med 2 mL Tyrdode buffer. For at opnå dette skal du indføre en 21 G nål i lårbenets åbning (på knæsiden) og langsomt trykke på stemplet for at hente en intakt marvscylinder (Figur 1B, C). Hold marvindsamlingen så kort som muligt (under 10 min).
4. Knoglemarvssektion og placering i inkubationskammeret
- Brug en 3 mL plast pipette til omhyggeligt og forsigtigt at overføre den intakte knoglemarv på en glasrutschebane. Det er vigtigt, at prøverne er dækket af buffer for at forhindre udtørring (Figur 1D).
BEMÆRK: Undgå flow-reflow for at minimere saks, der kan adskille vævet. - Under et stereomikroskop (10x) afskæres enderne af marven, der kan have været komprimeret på tidspunktet for skylningen. Skær derefter tværgående sektioner med et skarpt barberblad. Sektionerne skal være tynde nok til at muliggøre en detaljeret observation, men sikre, at megakaryocytter ikke beskadiges af kompression (normalt tykkelse omkring 0,5 mm) (Figur 1E,F).
BEMÆRK: Sektionerne er lavet med et skarpt barberblad og under en forstørrelsesglas for at justere deres tykkelse til ca. 0,5 mm. Kun sektioner af ensartet tykkelse vælges. Denne procedure er ikke kompliceret, men dens standardisering kræver en vis erfaring. - Ved hjælp af en plastpipette opsamles 10 sektioner i 1 mL rør, der indeholder Tyroders buffer (Figur 1G).
- Overfør forsigtigt sektionerne til et inkubationskammer med en diameter på 13 mm (Figur 1H).
- Aspirer bufferen og juster lydstyrken til 30 μL af Tyroders buffer suppleret med 5 % museserum.
BEMÆRK: Det er på nuværende tidspunkt, at farmakologiske agenser kan tilføjes for at vurdere deres indvirkning på proplateletdannelsen. - Placer sektionerne på afstand. Forsegl det selvklæbende kammer med en dæksel af dimensionen 22 x 55 mm. Hæld dæksleren, mens den klæber, for at undgå dannelse af luftbobler (Figur 1I).
- Kammeret placeres i varmekammeret ved 37 °C. Fra dette øjeblik startes kronometeret (T= 0 h). Forsøget kører i 6 timer ved 37 °C (T= 6 h).
5. Realtidsobservation af marveksplanter
- Brug et omvendt fasekontrastmikroskop (40x linse til forstørrelse) koblet til et videokamera til at observere knoglemarvseksplanterne. Lad cellerne inkubere i 30 minutter, før observationen påbegyndes. Mens du observerer, er det nødvendigt at justere fokus, fordi megakaryocytter bevæger sig.
BEMÆRK: Andre observationstilstande er mulige (f.eks. DIC, fluorescens ved hjælp af mus, hvis megakaryocytter udtrykker en endogen fluorescerende markør), men fasekontrastmikroskopi er optimal til klart at visualisere de lange og tynde megakaryocytforlængelser, hvilket giver mulighed for præcis kvantificering. Efter 30 min migrerer marvcellerne gradvist til periferien af explant og danner en monolag. Efter 1 time inkubation kan megakaryocytter identificeres ved deres store størrelse og polylobulated kerner (Figur 1J,K). Efter 3 timers inkubation stiger antallet af megakaryocytter, og nogle har lange udvidelser. - Lav videoer for at optage transformationen af megakaryocytterne.
6. Kvantificering af de proplatelet-strakte megakaryocytter
- Tegn et kort for at lokalisere hvert afsnit i inkubationskammeret (Figur 1K).
- Efter 1 time skal du identificere de synlige megakaryocytter (dvs. gigantiske polylobulaterede celler) i hver sektions periferi og plotte deres positioner på tegningen. Gentag denne procedure efter 3 og 6 timer.
BEMÆRK: På grundlag af tegningen kan hver megakaryocyt nemt placeres over tid og udviklingen af deres morfologi analyseret (f.eks. størrelse, deformation, proplateletforlængelse osv.). En anden mulighed er brugen af en bestemt navigationssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvalitative resultater. I begyndelsen af eksperimentet komprimeres alle celler i knoglemarvssektionen. Det tager 30 min for cellerne at blive tydeligt synlige i periferien af explants. Megakaryocytterne kan derefter genkendes af deres store størrelse, og deres udvikling kan derefter studeres over tid (størrelse, form, dynamisk, proplatelet udvidelse og blodplade frigivelse) (Figur 2A). Små megakaryocytter har en diameter mellem 20 og 30 μm og deres kerner er polylobulated mens modne runde megakaryocytter er større (> 30 μm i diameter) med en forstørret cytoplasma. Et par mørke megakaryocytter kan observeres (Figur 2C). Disse repræsenterer døde celler, hvis andel ikke må overstige 0,5%. En andel, der er højere end denne værdi, angiver et problem med forberedelse af stikprøver. Kernens morfologi kan let visualiseres ved at variere fokus.
Kvantitative resultater. Megakaryocytter tælles manuelt som beskrevet i 6.2. og klassificeret efter deres morfologi ved 3 timer og 6 timer efter forsegling af inkubationskammeret. Figur 2A opsummerer de fire væsentlige megakaryocytter klasser: (1) små MKs, (2) store MKs, (3) MKs med tykke udvidelser, (4) MKs med tynde, aflange og forgrenede udvidelser. Disse senere er de typiske proplateletdannende megakaryocytter, med de fremtrædende egenskaber ved hævelser langs proplatelets og tilstedeværelsen af brydningsplader i deres ekstremiteter. Ved hjælp af kortlægning (Figur 1K) kan deres udvikling følges over tid. Resultaterne udtrykkes som en procentdel af hver klasse på hvert observationstidspunkt. Klassisk, halvdelen af megakaryocytter synlige i periferien udvide proplatelets på 6 timer for vilde type C57BL/6 mus knoglemarv (Figur 2B).
Det er muligt at følge skæbnen for runde MKs ved at fange sekventielle billeder over tid for at forestille sig, hvordan de danner proplatelets (Video 1). Interessant, når MKs med tykke udvidelser blev overvåget over en periode på 3 timer, blev det observeret, at de tykke udvidelser enten kunne løsne sig fra cellekroppen og grenen i proplatelets eller trække sig tilbage for at reformere store runde MKs.
| Reagenser | H2O | ||||
| Lager I* | 16 g | 0,4 g | 2 g | 0,116 g | |
| NaCl | KCL | NaHCO3 | NaH2PO4, | til 100 mL | |
| (2,73 M) | (53,6 mM) | (238 mM) | (8,6 mM) | ||
| Lager II | 2,033 g MgCl2,6H2O (0,1 M) | ||||
| Lager III | 2,19 g CaCl2,6H2O (0,1 M) | til 100 mL | |||
| HEPES Lager** | 119 g HEPES* (0,5 M) | til 1 L | |||
| Tyroders buffer*** | 5 mL Lager I | 1 mL Lager II | 2 mL Lager III | 1 mL HEPES Lager | 1,8 mL albumin Stock |
Tabel 1: Forberedelse af Tyroders buffer. Hver lageropløsning er angivet i tabellens første kolonne. Sammensætningen samt mængden af reagens (givet i gram), der kræves for hver lageropløsning, er angivet pr. Række. Katalognummeret og virksomheden for hvert reagens er angivet i tabellen over væsentlige forsyninger.
Figur 1: Fotografiske gengivelser af prøveforberedelsesmetoden for knoglemarvseksplanten. (A) Eksperimentel opsætning, der kræves til knoglemarvspræparatet. (B) Der indsættes en 21-gauge sprøjtemonteret nål i knoglen. (C) Knoglemarven skylles ind i et rør der indeholder Tyroders buffer. (D) Knoglemarven deponeres derefter forsigtigt på en glasrutschebane. (E) Knoglemarvens ekstremiteter afskæres. (F) Marvcylinderen skæres i ti 0,5 mm tykke sektioner. (G-H) De ti sektioner overføres til et inkubationskammer og observeres ved 37 °C ved hjælp af et omvendt mikroskop. (I) Repræsentativt foto af et inkubationskammer, der indeholder de ti dele knoglemarv. (J) Perifere celler migrerer for at danne et lag hvor megakaryocytterne bliver synlige. (K) Eksempel på tegning, der illustrerer de ti explant sektioner i inkubationskammeret samt placeringen af megakaryocytter (X blå mærke), der har migreret ud af vævet for hver sektion. Pilen viser en megakaryocyt i periferien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Morfologisk klassificering af megakaryocytter i explants over tid. (A) Megakaryocytter klassificeres som "små", "store", med "tyk udvidelse" eller "proplatelet-udvidelse". Stænger: 50 μm (B) Andelen af megakaryocytter i hver klasse blev bestemt til 1 h, 3 timer og 6 timer for i alt 1.468 megakaryocytter, hvilket viser, at andelen af "små" og "sfæriske" megakaryocytter falder med tiden, mens andelen af megakaryocytter, der udvider proplatelets, stiger (n= 6 mus). Typisk observeres mellem 8,3 og 11,5 megakaryocytter i explants af en WT-mus efter 3 timer pr. Sektion. Fejllinjen svarer til standardfejlen for gennemsnittet for hvert eksempel. (C) Repræsentativt billede af en mørk megakaryocyt. Bar: 50 μm (D) Repræsentativt billede af en megakaryocyt med ikke-muskuløs myosin II-A mærket med et grønt fluorescerende protein. Bar: 50 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Time-lapse video, der viser en MK udvide proplatelets. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en enkel og billig in vitro-metode til at evaluere effektiviteten af megakaryocytter for at udvide proplatelets, der er vokset i knoglemarven. Knoglemarven explant model for mus har fire vigtigste fordele. For det første er der ingen avancerede tekniske færdigheder, der kræves. For det andet er den tid, der er nødvendig for at opnå megakaryocyt-udvidelse proplatelets ganske kort, kun 6 timer for explant metode, sammenlignet med mindst 4 dage for en konventionel kultur metode startende fra musen forfædre. For det tredje, da der kun er behov for en lille mængde væv, og at de opnåede resultater er reproducerbare, reducerer det antallet af mus, der er nødvendige, til et minimum (normalt 6 mus pr. Forsøgsbetingelse), hvilket gør disse eksperimenter økonomisk og etisk effektive. Endelig, men vigtigere, styrken af denne metode ligger i brugen af megakaryocytter, der har fuldt udviklet sig i deres naturlige miljø, som kan vise sig uvurderlig i at afsløre fænotyper, der kunne maskeres in vitro af potentielle artefakter af kulturforholdene. Dette er tidligere blevet dokumenteret hos mus med megakaryocyt-begrænset MYH9 inaktivering, hvor der er fundet modsatrettede resultater på proplateletdannelse i in vitro (øget dannelse)10 og in vivo (nedsat formation) differentierede megakaryocytter11. Disse paradoksale resultater er blevet forklaret ved kravet om myosin IIA for normal megakaryocyt differentiering i et begrænsningsmiljø, mens myosin IIA kan undværes for megakaryocyt differentiering i flydende kultur7.
En interessant anvendelse af knoglemarvs explantmodellen er muligheden for at studere virkningen af genetiske mutationer eller mangler hos transgene mus og/eller farmakologiske agenser udelukkende på blodpladeforlængelsesprocessen uden at forstyrre differentieringsprocessen som i tilfældet med in vitro-kultur12. Den ideelle situation er at bruge knoglemarven i et lårben som en behandlet prøve og dens modstykke som kontrol. Derudover letter brugen af transgene mus, der tillader spontan fluorescens i megakaryocytterne, visualiseringen af blodpladeforlængelsesprocessen. For at visualisere fluorescerende megakaryocytter kunne en mulighed være at tilføje fluorescensmærkede antistoffer mod specifikke megakaryocytmarkører i kulturkammeret. En anden mulighed kunne være brugen af genetisk manipulerede musemodeller, der udtrykker et fluorescerende protein, enten specifikt i den megakarycytiske afstamning, såsom mus med CD41-mærket YFP, der allerede er rapporteret i litteraturen13, eller i alle celler som mus, hvor GFP er knyttet til N-terminus af ikke-muskuløs myosin II-A14 som illustreret i figur 2D.
Denne explant metode giver derfor både kvalitative og kvantitative oplysninger til en bedre forståelse af blodpladedannelse i deres naturlige miljø. Bemærkelsesværdigt, selv om denne metode er enkel og hurtig, forbliver den komplementær til de undersøgelser, der udføres ved hjælp af klassisk flydende kultur. Hver enkelt bringer separat viden i henhold til stadier af spredning, modning, udvidelse af blodplader og blodplade frigivelse, som man ønsker at studere. For eksempel, når explant-metoden giver oplysninger om kapaciteten af udvidelse af proplatelets med megakaryocytter, der er vokset i en fysiologisk sammenhæng, giver in vitro-kulturen oplysninger om betydningen af knoglemarvsmikromiljøet, såsom virkningen af celledigitet7 eller ekstracellulær matrixafhængighed15. Således gør in vitro megakaryocyt kulturer det muligt at modulere parametrene for mikromiljøet med hensyn til stivhed og klæbende proteiner7,16. Se artiklen "Megakaryocyt kultur i tre-dimensionelle methylcellulose-baserede hydrogel at forbedre celle modning og studere virkningen af stivhed og indespærring" af J. Boscher et al., præsenteret i dette nummer for mere information.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert for teknisk bistand. Dette arbejde er blevet støttet af ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 og ANR-18-CE14-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
