Summary
Ici, nous détaillons la méthode d’explantation de moelle osseuse, de la préparation de l’échantillon à l’analyse microscopique des lames, afin d’évaluer la capacité des mégacaryocytes qui se sont différenciés dans leur environnement physiologique à former des proplaquettaires.
Abstract
La dernière étape de la mégacarylopoïèse conduit à des extensions cytoplasmiques à partir de mégacaryocytes matures, appelés proplaquettaires. On a beaucoup appris sur la formation de proplaquettaires à l’aide de mégacaryocytes différenciés in vitro; cependant, il existe de plus en plus de preuves que les systèmes de culture conventionnels ne récapitulent pas fidèlement le processus de différenciation/maturation qui a lieu à l’intérieur de la moelle osseuse. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode d’explantation initialement décrite en 1956 par Thiéry et Bessis pour visualiser les mégacaryocytes qui ont mûri dans leur environnement natif, contournant ainsi les artefacts potentiels et les mauvaises interprétations. Les moelles osseuses fraîches sont collectées en rinçant les fémurs des souris, tranchées en sections transversales de 0,5 mm et placées dans une chambre d’incubation à 37 °C contenant un tampon physiologique. Les mégacaryocytes deviennent progressivement visibles à la périphérie de l’explantation et sont observés jusqu’à 6 heures sous un microscope inversé couplé à une caméra vidéo. Au fil du temps, les mégacaryocytes changent de forme, certaines cellules ayant une forme sphérique et d’autres développant des extensions épaisses ou étendant de nombreuses proplaquettaires minces avec une ramification étendue. Des enquêtes qualitatives et quantitatives sont menées. Cette méthode a l’avantage d’être simple, reproductible et rapide car de nombreux mégacaryocytes sont présents, et classiquement la moitié d’entre eux forment des proplaquettaires en 6 heures contre 4 jours pour les mégacaryocytes de souris en culture. En plus de l’étude de souris mutantes, une application intéressante de cette méthode est l’évaluation simple des agents pharmacologiques sur le processus d’extension proplaquettaire, sans interférer avec le processus de différenciation qui peut se produire dans les cultures.
Introduction
La technique de l’explantation de moelle osseuse a été développée pour la première fois par Thiéry et Bessis en 1956 pour décrire la formation d’extensions cytoplasmiques mégacaryocytaires de rat comme un événement initial dans la formation de plaquettes1. En utilisant le contraste de phase et des techniques cinématographiques, ces auteurs ont caractérisé la transformation de mégacaryocytes ronds matures en cellules thrombocytogènes « semblables à des calmars » avec des extensions cytoplasmiques montrant des mouvements dynamiques d’allongement et de contraction. Ces bras deviennent progressivement plus minces jusqu’à ce qu’ils deviennent filiformes avec de petits gonflements le long des bras et aux extrémités. Ces allongements typiques des mégacaryocytes, obtenus in vitro et en milieu liquide, présentent certaines similitudes avec les plaquettes observées dans la moelle osseuse fixe, où les mégacaryocytes dépassent de longues extensions à travers les parois sinusoïdales dans la circulation sanguine2,3. La découverte et le clonage du TPO en 1994, ont permis de différencier les mégacaryocytes en culture capables de former des extensions proplaquettaires ressemblant à celles décrites dans les explantes de moelle osseuse4,5,6. Cependant, la maturation des mégacaryocytes est beaucoup moins efficace dans les conditions de culture, notamment le vaste réseau membranaire interne des mégacaryocytes matures de la moelle osseuse est sous-développé dans les mégacaryocytes en culture, entravant les études sur les mécanismes de la biogenèse plaquettaire7,8.
Nous détaillons ici le modèle d’explantation de moelle osseuse, basé sur Thiéry et Bessis, à suivre en temps réel la formation de proplaquettaires de mégacaryocytes de souris, qui ont complètement mûri dans leur environnement natif, contournant ainsi d’éventuels artefacts in vitro et des interprétations erronées. Les résultats obtenus chez des souris adultes de type sauvage sont présentés pour illustrer la capacité des mégacaryocytes à étendre les proplaquettaires, leur morphologie et la complexité des proplaquettaires. Nous introduisons également une stratégie de quantification rapide pour la validation de la qualité afin d’assurer l’exactitude et la robustesse des données pendant le processus d’enregistrement des mégacaryocytes. Le protocole présenté ici est la version la plus récente de la méthode publiée sous la forme d’un chapitre de livre précédemment9.
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Protocol
Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux normes européennes 2010/63/UE et au Comité CREMEAS d’Éthique de l’Expérimentation Animale de l’Université de Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Préparation des réactifs
- Préparer les réactifs comme décrit dans le tableau 1.
- Pour le Stock I, dissoudre chaque poudre séparément. S’assurer que l’osmolarité de la préparation est supérieure à 295 mOsm/L. Cette solution peut être conservée à 4 °C pendant un an.
- Pour la préparation tampon du Tyrode, faire la solution comme décrit dans le tableau 1,régler le volume à 100 mL avec de l’eau distillée et ajouter 0,1 g de saccharose D (+) anhydre. Ajuster à un pH de 7,3 à l’aide de 1 N HCl au besoin et de l’osmolarité à 295 mOsm/L. Pour prévenir la croissance bactérienne, ajouter la pénicilline G à la concentration finale de 10 U/mL et le sulfate de streptomycine à la concentration finale de 0,29 mg/mL. Filtrer la solution finale à travers des pores de 0,22 μm.
2. Préparation du dispositif expérimental
- Le jour de l’expérience, réchauffez le tampon du Tyrode à 37 °C et allumez la chambre chauffante du microscope pour porter la température à 37 °C.
- Préparez tous les outils nécessaires, tels qu’une minuterie, des chambres d’incubation, des seringues de 5 mL, 21 G, une pince, une lame de rasoir, des pipettes Pasteur, des lames en verre et un tube de centrifugeuse de 15 mL(Figure 1A).
3. Isolement de la moelle osseuse de la souris
- Euthanasier des souris C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines par asphyxie au CO2 et luxation cervicale. Cela devrait être fait rapidement par une personne compétente et qualifiée.
- Pour éviter la contamination microbienne, trempez le corps de la souris dans de l’éthanol à 70 % (v/v) avant de retirer les fémurs. Utilisez des instruments désinfectés dans de l’éthanol à 70% pour la dissection. Recueillez les deux fémurs et nettoyez-les en enlevant tout tissu adhérent. Après immersion rapide dans l’éthanol, placez-les dans un tube centrifuge de 15 mL contenant 2 mL de tampon tyrode.
- Coupez les épiphyses à l’aide d’une lame de rasoir tranchante et rincez la moelle osseuse à l’aide d’une seringue de 5 mL remplie de 2 mL de tampon Tyrdode. Pour ce faire, introduisez une aiguille de 21 G dans l’ouverture du fémur (du côté du genou) et appuyez lentement sur le piston pour récupérer un cylindre de moelle intact(Figure 1B,C). Gardez la séance de collecte de moelle osseuse aussi brève que possible (moins de 10 min).
4. Sectionnement et placement de la moelle osseuse dans la chambre d’incubation
- Utilisez une pipette en plastique de 3 mL pour transférer soigneusement et doucement la moelle osseuse intacte sur une lame de verre. Il est important que les échantillons soient recouverts d’un tampon pour éviter le dessèchement(Figure 1D).
REMARQUE: Évitez le flux-reflux pour minimiser les cisailles qui pourraient dissocier le tissu. - Sous un stéréomicroscope (10x), coupez les extrémités de la moelle qui peuvent avoir été comprimées au moment de la chasse d’eau. Coupez ensuite des sections transversales avec une lame de rasoir tranchante. Les sections doivent être suffisamment fines pour permettre une observation détaillée, mais s’assurer que les mégacaryocytes ne sont pas endommagés par la compression (généralement une épaisseur d’environ 0,5 mm)(Figure 1E,F).
REMARQUE: Les sections sont faites avec une lame de rasoir tranchante et sous une loupe pour ajuster leur épaisseur à environ 0,5 mm. Seules les sections d’épaisseur uniforme sont sélectionnées. Cette procédure n’est pas compliquée mais sa standardisation nécessite une certaine expérience. - À l’aide d’une pipette en plastique, recueillir 10 sections dans un tube de 1 mL contenant le tampon de Tyrode(Figure 1G).
- Transférer soigneusement les sections dans une chambre d’incubation d’un diamètre de 13 mm(Figure 1H).
- Aspirer le tampon et régler le volume à 30 μL du tampon de Tyrode complété par 5 % de sérum de souris.
NOTE: C’est à ce stade que des agents pharmacologiques peuvent être ajoutés pour évaluer leur impact sur la formation de proplaquettaires. - Positionnez les sections à distance. Scellez la chambre auto-adhésive avec un couvercle de dimension 22 x 55 mm. Inclinez le couvercle tout en collant pour éviter la formation de bulles d’air (Figure 1I).
- Placez la chambre dans la chambre de chauffage à 37 °C. À partir de ce moment, le chronomètre est démarré (T = 0 h). L’expérience dure 6 h à 37 °C (T= 6 h).
5. Observation en temps réel des explants de moelle osseuse
- Utilisez un microscope à contraste de phase inversé (lentille 40x pour le grossissement) couplé à une caméra vidéo pour observer les explants de moelle osseuse. Laissez les cellules incuber pendant 30 min avant de commencer l’observation. En observant, il est nécessaire d’ajuster la mise au point car les mégacaryocytes se déplacent.
REMARQUE: D’autres modes d’observation sont possibles (par exemple, DIC, fluorescence utilisant des souris dont les mégacaryocytes expriment un marqueur fluorescent endogène), mais la microscopie à contraste de phase est optimale pour visualiser clairement les extensions de mégacaryocytes longues et minces, permettant une quantification précise. Après 30 min, les cellules de la moelle migrent progressivement vers la périphérie de l’explante, formant une monocouche. Après 1 h d’incubation, les mégacaryocytes peuvent être identifiés par leur grande taille et leurs noyaux polylobulés (Figure 1J,K). Après 3 h d’incubation, le nombre de mégacaryocytes augmente et certains ont de longues extensions. - Faites des vidéos pour enregistrer la transformation des mégacaryocytes.
6. Quantification des mégacaryocytes proplaquettaires
- Dessinez une carte pour localiser chaque section dans la chambre d’incubation (Figure 1K).
- Après 1 h, identifiez les mégacaryocytes visibles (c’est-à-dire les cellules polylobulées géantes) à la périphérie de chaque section et tracez leurs positions sur le dessin. Répétez cette procédure après 3 et 6 h.
NOTE: Sur la base du dessin, chaque mégacaryocyte peut être facilement localisé au fil du temps et l’évolution de leur morphologie analysée (par exemple, taille, déformation, extension proplaquettaire, etc.). Une autre possibilité est l’utilisation d’un logiciel de navigation spécifique.
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Representative Results
Résultats qualitatifs. Au début de l’expérience, toutes les cellules sont compactées dans la section de la moelle osseuse. Il faut 30 min pour que les cellules deviennent clairement visibles à la périphérie des explants. Les mégacaryocytes sont alors reconnaissables à leur grande taille et leur évolution peut ensuite être étudiée dans le temps (taille, forme, dynamique, extension proplaquettaire et libération plaquettaire)(Figure 2A). Les petits mégacaryocytes ont un diamètre compris entre 20 et 30 μm et leurs noyaux sont polylobulés tandis que les mégacaryocytes ronds matures sont plus grands (> 30 μm de diamètre) avec un cytoplasme élargi. Quelques mégacaryocytes sombres peuvent être observés (Figure 2C). Il s’agit de cellules mortes dont la proportion ne doit pas dépasser 0,5%. Une proportion supérieure à cette valeur indique un problème de préparation de l’échantillon. La morphologie du noyau peut être facilement visualisée en faisant varier la mise au point.
Résultats quantitatifs. Les mégacaryocytes sont comptés manuellement comme décrit au point 6.2. et classés selon leur morphologie à 3 h et 6 h après scellement de la chambre d’incubation. La figure 2A résume les quatre classes essentielles de mégacaryocytes : (1) petits AM, (2) grands AM, (3) MK avec extensions épaisses, (4) MK avec extensions minces, allongées et ramifiées. Ce sont les mégacaryocytes typiques formant des proplaquettaires, avec les caractéristiques proéminentes de gonflements le long des proplaquettaires et la présence de bourgeons réfractifs à leurs extrémités. À l’aide de la cartographie(Figure 1K),leur évolution peut être suivie dans le temps. Les résultats sont exprimés en pourcentage de chaque classe à chaque moment d’observation. Classiquement, la moitié des mégacaryocytes visibles à la périphérie prolongent les proplaquettaires à 6 heures pour la moelle osseuse de souris de type sauvage C57BL/6(Figure 2B).
Il est possible de suivre le sort des VOIX rondes en capturant des images séquentielles au fil du temps pour imager comment elles forment des proplaquettaires (Vidéo 1). Fait intéressant, lorsque les 0M avec des extensions épaisses ont été surveillées sur une période de 3 h, il a été observé que les extensions épaisses pouvaient soit se détacher du corps cellulaire et se ramifier en proplaquettaires, soit se rétracter pour reformer de grandes PLAST rondes.
| Réactifs | H2O | ||||
| Stock I* | 16 g | 0,4 g | 2 g | 0,116 g | |
| NaCl | KCL | NaHCO3 | NaH2PO4, | à 100 mL | |
| (2,73 M) | (53,6 mM) | (238 mM) | (8,6 mM) | ||
| Stock II | 2,033 g MgCl2,6H2O (0,1 M) | ||||
| Stock III | 2,19 g caCl2,6H2O (0,1 m) | à 100 mL | |||
| Stock HEPES** | 119 g HEPES* (0,5 M) | à 1 L | |||
| Tampon de Tyrode*** | 5 mL Stock I | 1 mL Stock II | 2 mL Stock III | Stock HEPES de 1 mL | 1,8 mL d’albumine Stock |
Tableau 1 : Préparation du tampon du Tyrode. Chaque solution porte-actions est indiquée dans la première colonne du tableau. La composition ainsi que la quantité de réactif (donnée en grammes) requise pour chaque solution stock sont indiquées par rangée. Le numéro de catalogue et la société de chaque réactif sont indiqués dans le tableau des fournitures essentielles.
Figure 1: Représentations photographiques de la méthode de préparation de l’échantillon pour l’explantation de moelle osseuse. (A) Configuration expérimentale requise pour la préparation de la moelle osseuse. (B) Une aiguille montée sur seringue de calibre 21 est insérée dans l’os. (C) La moelle osseuse est rincée dans un tube contenant le tampon de Tyrode. (D) La moelle osseuse est ensuite déposée doucement sur une lame de verre. (E) Les extrémités de la moelle osseuse sont coupées. (F) Le cylindre de moelle est coupé en dix sections de 0,5 mm d’épaisseur. (G-H) Les dix sections sont transférées dans une chambre d’incubation et observées à 37 °C à l’aide d’un microscope inversé. (I) Photo représentative d’une chambre d’incubation contenant les dix sections de moelle osseuse. (J) Les cellules périphériques migrent pour former une couche dans laquelle les mégacaryocytes deviennent visibles. (K) Exemple de dessin illustrant les dix sections d’explantation dans la chambre d’incubation ainsi que l’emplacement des mégacaryocytes (X marque bleue) qui ont migré hors du tissu pour chaque section. La flèche montre un mégacaryocyte à la périphérie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Classification morphologique des mégacaryocytes dans les explantes au fil du temps. (A) Les mégacaryocytes sont classés comme « petits », « grands », avec « extension épaisse » ou « extension proplaquettaire ». Barres: 50 μm (B) La proportion de mégacaryocytes dans chaque classe a été déterminée à 1 h, 3 h et 6 h pour un total de 1 468 mégacaryocytes, montrant que la proportion de mégacaryocytes « petits » et « sphériques » diminue avec le temps tandis que, parallèlement, la proportion de mégacaryocytes étendant les proplaquettaires augmente (n = 6 souris). Typiquement, dans les explants d’une souris WT après 3 h, entre 8,3 et 11,5 mégacaryocytes sont observés par section. La barre d’erreur correspond à l’erreur-type de la moyenne pour chaque échantillon. (C) Image représentative d’un mégacaryocyte sombre. Barre: 50 μm (D) Image représentative d’un mégacaryocyte avec de la myosine II-A non musculaire marqué avec une protéine fluorescente verte. Barre: 50 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Vidéo time-lapse montrant un MK étendant des proplaquettaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode in vitro simple et peu coûteuse pour évaluer l’efficacité des mégacaryocytes pour étendre les proplaquettaires qui se sont développées dans la moelle osseuse. Le modèle d’explantation de moelle osseuse pour souris présente quatre avantages principaux. Tout d’abord, aucune compétence technique avancée n’est requise. Deuxièmement, le temps nécessaire pour obtenir des proplaquettaires étendant les mégacaryocytes est assez court, seulement 6 heures pour la méthode explantation, contre un minimum de 4 jours pour une méthode de culture conventionnelle à partir de progéniteurs de souris. Troisièmement, étant donné que seule une petite quantité de tissu est nécessaire et que les résultats obtenus sont reproductibles, cela réduit le nombre de souris nécessaires au minimum (généralement 6 souris par condition expérimentale), ce qui rend ces expériences économiquement et éthiquement efficaces. Enfin, mais surtout, la force de cette méthode réside dans l’utilisation de mégacaryocytes qui se sont pleinement développés dans leur environnement naturel, ce qui peut s’avérer inestimable pour révéler des phénotypes qui pourraient être masqués in vitro par des artefacts potentiels des conditions de culture. Cela a déjà été documenté chez des souris avec une inactivation myH9 restreinte aux mégacaryocytes où des résultats opposés ont été trouvés sur la formation de proplaquettaires in vitro (formation accrue)10 et in vivo (formation réduite) mégacaryocytes différenciés11. Ces résultats paradoxaux ont été expliqués par l’exigence de la myosine IIA pour la différenciation normale des mégacaryocytes dans un environnement de contrainte, tandis que la myosine IIA est dispensable pour la différenciation des mégacaryocytes en culture liquide7.
Une application intéressante du modèle d’explant de moelle osseuse est la possibilité d’étudier l’impact des mutations génétiques ou des déficiences chez les souris transgéniques et/ou les agents pharmacologiques exclusivement sur le processus d’extension plaquettaire, sans interférer avec le processus de différenciation comme dans le cas de la culture in vitro12. La situation idéale est d’utiliser la moelle osseuse d’un fémur comme échantillon traité et son homologue comme témoin. De plus, l’utilisation de souris transgéniques permettant une fluorescence spontanée dans les mégacaryocytes facilite la visualisation du processus d’extension plaquettaire. Pour visualiser les mégacaryocytes fluorescents, une possibilité pourrait être d’ajouter des anticorps marqués par fluorescence contre des marqueurs mégacarytaires spécifiques dans la chambre de culture. Une autre possibilité pourrait être l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés exprimant une protéine fluorescente, soit spécifiquement dans la lignée mégacaryocytaire comme les souris avec YFP marquée CD41 déjà rapportées dans la littérature13, soit dans toutes les cellules comme les souris où la GFP est liée à la N-terminus de la myosine II-A14 non musculaire comme illustré à la figure 2D.
Cette méthode d’explantation fournit donc des informations qualitatives et quantitatives pour une meilleure compréhension de la formation plaquettaire dans leur environnement naturel. Il convient de noter que, bien que cette méthode soit simple et rapide, elle reste complémentaire des études réalisées à l’aide de la culture liquide classique. Chacun apporte des connaissances distinctes selon les stades de prolifération, de maturation, d’extension des plaquettes et de libération plaquettaire que l’on souhaite étudier. Par exemple, lorsque la méthode explant donne des informations sur la capacité d’extension des proplaquettaires par des mégacaryocytes qui se sont développés dans un contexte physiologique, la culture in vitro fournit des informations sur l’importance du microenvironnement de la moelle osseuse comme l’impact de la ridigité cellulaire7 ou la dépendance à la matrice extracellulaire15. Ainsi, les cultures de mégacaryocytes in vitro permettent de moduler les paramètres du microenvironnement en termes de rigidité et de protéines adhésives7,16. Veuillez vous référer à l’article « Megakaryocyte culture in three-dimensional methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement » de J. Boscher et al., présenté dans ce numéro pour plus d’informations.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par la bourse ANR (Agence Nationale de la Recherche) ANR-17-CE14-0001-01 et ANR-18-CE14-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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