Summary
ここでは、骨髄外植法について詳述し、サンプル調製から顕微鏡スライド解析まで、それらの生理環境において分化した巨核球がプロ血小板を形成する能力を評価する。
Abstract
巨核代の最後の段階は、成熟した巨核球、いわゆるプロ血小板からの細胞質拡張につながります。多くの体 外- 分化された巨核球を使用してプロ血小板形成について学んできました;しかし、従来の培養系では、骨髄の内部で起こる分化/成熟過程を忠実に再現していないという証拠が増えています。本稿では、1956年にティエリーとベシスが最初に述べた外植法を紹介し、その原生環境で成熟した巨核球を可視化し、潜在的な人工物や誤解を回避する。生骨マロウは、マウスの大腿骨を洗い流すことによって採取され、0.5mmの断面にスライスし、生理学的緩衝液を含む37°Cのインキュベーションチャンバーに入れる。巨核球は、外植周囲で徐々に見えるようになり、ビデオカメラに結合された反転顕微鏡の下で最大6時間観察されます。時間が経つにつれて、巨核球は形状を変化させ、球形を有する細胞もあれば、厚い伸長を発症する細胞や、広範な分岐を伴う多くの薄いプロ血小板を拡張する細胞もある。質的な調査と定量的な調査の両方が行われます。この方法は、多数の巨核球が存在するように単純で再現性があり、速く、そしてそれらの半分が培養マウス巨核球の4日間と比較して6時間でプロ血小板を形成するという利点を有する。変異マウスの研究に加えて、この方法の興味深い応用は、培養で起こり得る分化プロセスを妨げることなく、プロ血小板拡張プロセス上の薬理学的薬剤の簡単な評価である。
Introduction
骨髄外植技術は、血小板形成1における初期事象としてラット巨核球細胞質拡張の形成を記述するために、1956年にティエリーとベシスによって最初に開発された。これらの著者らは、位相コントラストと映画技術を用いて、成熟した円形巨核球を、伸びと収縮の動的な動きを示す細胞質拡張を有する「イカ様」血小板細胞細胞への変換を特徴付けた。これらの腕は、腕に沿って、先端に小さな腫れでフィリフォームになるまで徐々に薄くなります。これらの典型的な巨核球伸びは、インビトロおよび液体培地で得られ、固定骨髄で観察される血小板と一定の類似性を有し、そこで巨核球が血液循環2,3に正弦波壁を通って長い伸長を突き出ている。1994年のTPOの発見とクローニングにより、骨髄外植4、5、6に記載のものに似たプロ血小板拡張を形成できる培養物中の巨核球を区別することができた。しかしながら、巨核球成熟は培養条件においてはるかに効率が悪く、特に骨髄成熟した巨核球の広範な内膜網は培養された巨核球において未開発であり、血小板生物新生7,8のメカニズムに関する研究を妨げている。
ここでは、ティエリーとベシスに基づく骨髄外植モデルを、ネイティブ環境で完全に成熟したマウス巨核球のリアルタイムプロ血小板形成に従い、 体外 のアーティファクトや誤解の可能性を回避します。野生型成虫マウスで得られた結果は、巨核球がプロ血小板を拡張する能力、その形態およびプロ血小板の複雑さを示すために提示される。また、巨核球記録工程におけるデータの正確性と堅牢性を確保するための、品質検証のための迅速な定量化戦略も導入します。ここで紹介したプロトコルは、本の章として出版された最新バージョンの方法です 9.
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Protocol
すべての動物実験は、ヨーロッパの基準2010/63/EUとストラスブール大学動物実験倫理に関するCREMEAS委員会(コンテテ・レジオナル・デティク・アン・マティエール・デ・エクスペリメンテーション・アニマル・ストラスブール)に従って行われました。
1. 試薬の調製
- 表1に記載されているように試薬を準備する。
- ストックIの場合は、各粉末を別々に溶解します。準備の浸透性が295 mOsm/Lより高いことを確認してください。この溶液は、4°Cで1年間保存することができます。
- Tyrodeのバッファー調製のために、 表1に記載されているように溶液を作り、蒸留水で100 mLにボリュームを調整し、0.1 g無水D(+)スクロースを加えます。必要に応じて1 N HClを使用し、295 mOsm/Lにオスモルリティを使用してpH 7.3に調整します。細菌の増殖を防ぐために、ペニシリンGを10 U/mL最終濃度で加え、ストレプトマイシン硫酸塩を0.29mg/mLの最終濃度で添加します。0.22 μmの孔を通して最終溶液をフィルターします。
2. 実験の準備
- 実験の日に、37°Cでタイロードのバッファーを温め、顕微鏡の加熱室をオンにして温度を37°Cにします。
- タイマー、インキュベーションチャンバー、5 mLシリンジ、21G、鉗子、カミソリブレード、パスツールピペット、ガラススライド、および15 mL遠心チューブ(図1A)など、必要なすべての工具を準備します。
3. マウス骨髄の分離
- CO2窒息と子宮頸部脱臼により8-12週齢のC57BL/6マウスを安楽死させる。これは有能で有能な人によって迅速に行われるべきです。
- 微生物汚染を避けるために、大腿骨を除去する前に、マウスの体を70%(v/v)エタノールに浸してください。解剖のために70%エタノールで除菌された器具を使用してください。2つの大腿骨を収集し、任意の付着組織を除去することによってそれらをきれいにします。エタノールに急速に浸漬した後、2 mLタイローデのバッファーを含む15 mL遠心分離管に入れます。
- 鋭利なカミソリの刃を使用して骨端を切り取り、2 mL Tyrdodeのバッファーで満たされた5 mLシリンジを使用して骨髄を洗い流します。これを達成するために、大腿骨の開口部(膝側)に21Gの針を導入し、プランジャーをゆっくりと押して無傷の骨髄シリンダーを取り出す(図1B、C)。骨髄収集セッションはできるだけ簡潔にしてください(10分以内)。
4. 骨髄の切り離しとインキュベーションチャンバーへの配置
- 3 mLのプラスチックピペットを使用して、無傷の骨髄をガラススライドに慎重かつ穏やかに移します。乾燥を防ぐためにサンプルをバッファーで覆うことが重要です (図1D)。
注:組織の解酸塩を解除する可能性のあるせん断を最小限に抑えるために、フローリフローを避けてください。 - 実体顕微鏡(10x)下で、フラッシュ時に圧縮された可能性のある骨髄の端部を切り落とす。その後、鋭いカミソリの刃で横断的なセクションをカットします。セクションは、詳細な観察を可能にするほど薄くする必要がありますが、圧縮(通常は0.5mm前後の厚さ)によって巨核球が損傷していないことを確認してください(図1E,F)。
注:セクションは鋭いカミソリの刃で作られ、約0.5ミリメートルに厚さを調整するために拡大鏡の下で作られています。均一な厚さのセクションのみが選択されます。この手順は複雑ではありませんが、標準化には経験が必要です。 - プラスチック製のピペットを使用して、Tyrodeのバッファを含む1mLチューブに10個のセクションを集める(図1G)。
- 直径13mmのインキュベーションチャンバーに慎重に切片を移す(図1H)。
- バッファーを吸引し、5% マウス血清で補ったタイロードのバッファーの 30 μL にボリュームを調整します。
注:この段階では、薬理学的薬剤を添加して、プロ血ト形成への影響を評価することができます。 - 断面を距離に配置します。寸法22 x 55mmのカバースリップで自己接着室を密封します。気泡の形成を避けるために貼り付けながらカバースリップを傾斜させる(図1I)。
- チャンバーを37°Cの暖房室に置きます。 この瞬間から、クロノメーターが開始されます(T = 0 h)。実験は37°C(T=6 h)で6時間実行されます。
5. 骨髄外植のリアルタイム観測
- ビデオカメラに結合して、骨髄外植を観察するために反転相コントラスト顕微鏡(拡大のための40xレンズ)を使用します。観察を開始する前に細胞を30分間インキュベートさせます。観察しながら、巨核球が動いているので焦点を調整する必要があります。
注:他の観察モード(例えば、DIC、巨核球が内因性蛍光マーカーを発現するマウスを用いた蛍光)が可能ですが、位相コントラスト顕微鏡は、長くて薄い巨核球拡張を明確に可視化するのに最適であり、正確な定量化が可能です。30分後、骨髄細胞は外植の周囲に徐々に移動し、単層を形成する。1時間のインキュベーションの後、巨核球は、その大きなサイズおよびポリロブラ核によって同定することができる(図1J,K)。3時間のインキュベーションの後、巨核球の数が増加し、いくつかは長い拡張を有する。 - 巨核球の変容を記録するビデオを作る。
6. 原血小板伸長巨核球の定量化
- インキュベーションチャンバー内の各セクションをローカライズするための地図を描く(図1K)。
- 1時間後、各セクションの周辺に目に見える巨核球(すなわち、巨大なポリロブラ細胞)を特定し、その位置を図面上にプロットします。3 時間と 6 時間後にこの手順を繰り返します。
注:図面に基づいて、各巨核細胞は時間の経過とともに容易に見分けることができ、その形態の進化(例えば、サイズ、変形、プロ血小板拡張など)を分析します。別の可能性は、特定のナビゲーションソフトウェアの使用です。
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Representative Results
定性的な結果。 実験の開始時に、すべての細胞は骨髄セクションで圧縮されます。細胞が外植の周囲にはっきりと見えるようになるのに30分かかります。その後、巨核球は大きなサイズで認識され、その進化は時間の経過とともに(サイズ、形状、動的、プロ血小板拡張および血小板放出)研究することができる(図2A)。小さな巨核球は直径20~30μmで、その核はポリロブレートされ、成熟した丸型巨核球は大きく(直径30μm)大きく >、細胞質が拡大します。暗い巨核球がいくつか観察される可能性がある(図2C)。これらは、0.5%を超えてはならない死細胞を表します。この値より高い比率は、サンプル調製の問題を示します。核の形態は、焦点を変えることで容易に可視化することができる。
定量的な結果:巨核球は6.2に記載されているように手動で数えられる。インキュベーションチャンバーの密封後3時間6時間で形態に従って分類される。図2Aは、(1)小さなMK、(2)大きなMK、(3)太い拡張を有する(3)MK、(4)薄く、伸び、および突出した拡張を有する4つの必須の巨核球クラスを要約する。これらは後に典型的なプロ血小板形成巨核球であり、プロ血小板に沿った腫脹の顕著な特徴と、その四肢に屈折芽の存在を有する。マッピング(図1K)の助けを借りて、その進化は時間の経過とともに続けることができます。結果は各観測時間における各クラスの割合で表されます。古典的に、周囲に見える巨核球の半分は、野生型C57BL/6マウス骨髄に対して6時間でプロ血小板を拡張する(図2B)。
時間の経過とともに連続画像をキャプチャしてプロメトレットを形成する方法を画像化することで、ラウンドMの運命をたどることができます(ビデオ1)。興味深いことに、太いエクステンションを持つMKが3時間にわたって監視されたとき、厚いエクステンションが細胞体から切り離されてプロメダレットに分岐するか、大きな丸いMKを改革するために撤回することができることが観察されました。
| 試薬 | H2O | ||||
| 株式 I* | 16 g | 0.4グラム | 2 g | 0.116 g | |
| ナクル | KCL | ナフコ3 | NaH2PO4, | 100 mLに | |
| (2.73 M) | (53.6 mM) | (238 mM) | (8.6 mM) | ||
| ストックII | 2.033 g MgCl2.6H2O (0.1 M) | ||||
| ストックIII | 2.19 g CaCl2.6H2O (0.1 M) | 100 mLに | |||
| ヘップスストック** | 119 g ヘペス* (0.5M) | 1 Lに | |||
| タイロードのバッファ*** | 5 mL ストック I | 1 mL ストック II | 2 mL ストック III | 1 mL ヘペス ストック | 1.8 mL アルブミン ストック |
表1:タイロードのバッファーの準備。 各ストックソリューションは、表の最初の列に示されます。各ストック溶液に必要な試薬量(グラム単位)と組成は、行ごとに示されます。カタログ番号と各試薬の会社は、必須の供給の表に示されています。
図1:骨髄外植のサンプル調製方法の写真表現(A)骨髄製剤に必要な実験用設定(B)21ゲージの注射器取り付け針を骨に挿入する。(C) 骨髄は、タイロードの緩衝液を含むチューブに流される。(D) 骨髄は、ガラススライド上にそっと堆積する。(E) 骨髄の四肢が切り取られる(F)骨髄シリンダーは、厚さ0.5mmの10個に切り取られる。(G-H)10個の切片はインキュベーションチャンバーに移され、逆顕微鏡を用いて37°Cで観察される。(I)骨髄の10切片を含むインキュベーションチャンバーの代表的な写真。(J)末梢細胞は巨核球が見える層を形成するために移動する。(K)インキュベーションチャンバー内の10の外植部と、各切片の組織から移行した巨核球(X青マーク)の位置を図示する例。矢印は周辺に巨核球を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:眼球の眼種分類(A)メガカルミヨサイトは、「太い拡張」または「プロ血小板拡張」を有する「小」「大」に分類される。バー:50μm(B)各クラスの巨核球の割合は、合計1,468個の巨核球に対して1時間、3時間、6時間で決定され、「小」および「球状」の巨核球の割合は時間とともに減少し、並行してプロ血滴を拡張する巨核球の割合は増加する(n=6マウス)。典型的には、3時間後のWTマウスの外植において、8.3と11.5メガ核球の間がセクションごとに観察される。誤差範囲は、各サンプルの平均の標準誤差に対応します。(C) 暗黒巨核球の代表的な画像。Bar: 50 μm (D) 緑色蛍光タンパク質で標識された非筋肉ミオシン II-A を有する巨核球の代表的な画像。バー:50 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:MKがプロ血滴を拡張するタイムラプスビデオ。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
ここでは、骨髄で増殖したプロ血小板を拡張する巨核球の効率を評価する簡単で低コストの インビトロ 法について説明する。マウスの骨髄外植モデルには、4つの主な利点があります。第一に、高度な技術スキルは必要ありません。第2に、巨核球拡張プロ血小板を得るのに必要な時間は、マウス前駆物質から始まる従来の培養法に対して最低4日間に比べ、外植法に対して6時間という非常に短い時間である。第3に、少量の組織しか必要とされず、得られた結果が再現可能であることを考えると、必要なマウスの数を最小限に抑え(通常は実験状態当たり6匹のマウス)、これらの実験を経済的かつ倫理的に効率的にする。最後に、重要なのは、この方法の強さは、自然環境で完全に発達した巨核球の使用にあり、培養条件の潜在的なアーティファクトによって インビトロで 覆い隠すことができる現象を明らかにする上で非常に貴重なものになる可能性があります。これは、巨核球制限 MYH9 不活性化を有するマウスにおいて、 インビトロ (増加形成)10 および 生体内 (減少形成)におけるプロ血小板形成に対して反対の結果が見つかり、分化された巨核球11に既に記載されている。これらの逆説的な結果は、制約環境における正常な巨核球分化に対するミオシンIIAの要件によって説明されているが、一方、ミオシンIIAは、液体培養7における巨核球分化のために分注可能である。
骨髄外植モデルの興味深い応用は、インビトロ培養12の場合のように分化プロセスを妨害することなく、トランスジェニックマウスおよび/または薬理薬の遺伝子変異または欠乏が血小板延長プロセス上で排他的に及ぼす影響を研究する可能性である。理想的な状況は、1つの大腿骨の骨髄を処理されたサンプルとして使用し、その対応する骨髄を対照として使用することです。さらに、巨核球における自発的な蛍光を可能にするトランスジェニックマウスの使用は、血小板延長プロセスの可視化を容易にする。蛍光巨核球を可視化するために、培養室の特定の巨核球マーカーに対して蛍光標識抗体を添加することが考えられる。もう一つの可能性は、特にCD41標識YFPを有するマウスのような巨核球系で、特に文献13で報告されている巨核球系、またはGFPが非筋ミオシンII-A14のN末端にリンクされているマウスなどのすべての細胞において、図2Dに示すように、蛍光タンパク質を発現する遺伝子操作マウスモデルの使用である可能性がある。
したがって、この外植法は、自然環境における血小板形成をより深く理解するための定性的情報と定量的情報の両方を提供する。注目に値する, この方法は単純で高速ですが、古典的な液体培養を使用して行われた研究に補完的なまま.それぞれが、研究したい血小板と血小板放出の増殖、成熟、拡張の段階に応じて別々の知識をもたらします。例えば、外植法が生理的文脈で成長した巨核球によるプロ血小板の拡張の能力に関する情報を提供する場合、インビトロ培養は細胞リジディシー7または細胞外マトリックス依存性15の影響などの骨髄微小環境の重要性に関する情報を提供する。このように、体外の巨核球培養は、粘性および粘着タンパク質7,16の観点から微小環境のパラメータを調節することを可能にする。J.Boscherらの記事「細胞成熟を改善し、剛性と閉じ込めの影響を研究するための三次元メチルセルロース系ヒドロゲルにおける巨核球培養」を参照してください。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、ジャン=イヴ・リンケル、ジュリー・ボッシャー、パトリシア・レーファー、モニーク・フロイント、ケティ・クネズ=ヒッパートの技術支援に感謝したいと考えている。この作品は、ANR(アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ)グラントANR-17-CE14-0001-01とANR-18-CE14-0037によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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