Summary
Aqui, detalhamos o método de explanta da medula óssea, desde a preparação da amostra até a análise de slides microscópicas, para avaliar a capacidade de megacaiócitos que se diferenciaram em seu ambiente fisiológico para formar proplatelets.
Abstract
A última etapa da megacaripoiese leva a extensões citoplasmáticas de megacaiócitos maduros, os chamados proplatelets. Muito se tem aprendido sobre a formação proplatelet usando megacariócitos in vitro-diferenciados; no entanto, há uma evidência crescente de que os sistemas de cultura convencionais não recapitulem fielmente o processo de diferenciação/maturação que ocorre dentro da medula óssea. Neste manuscrito, apresentamos um método de explanta inicialmente descrito em 1956 por Thiéry e Bessis para visualizar megacaiócitos que amadureceram em seu ambiente nativo, contornando assim artefatos potenciais e interpretações erradas. As medulas ósseas frescas são coletadas lavando os fêmures de camundongos, fatiadas em seções transversais de 0,5 mm e colocadas em uma câmara de incubação a 37 °C contendo um tampão fisiológico. Megacariócitos tornam-se gradualmente visíveis na periferia explant e são observados até 6 horas sob um microscópio invertido acoplado a uma câmera de vídeo. Com o tempo, os megacaiócitos mudam de forma, com algumas células tendo uma forma esférica e outras desenvolvendo extensões grossas ou estendendo muitas proplatelets finas com ramificações extensas. Tanto investigações qualitativas quanto quantitativas são realizadas. Este método tem a vantagem de ser simples, reproduzível e rápido, pois numerosos megacaiócitos estão presentes, e classicamente metade deles forma proplatelets em 6 horas em comparação com 4 dias para megacariócitos de camundongos cultivados. Além do estudo de camundongos mutantes, uma aplicação interessante desse método é a avaliação direta dos agentes farmacológicos no processo de extensão proplatelet, sem interferir no processo de diferenciação que pode ocorrer nas culturas.
Introduction
A técnica de explant de medula óssea foi desenvolvida pela primeira vez por Thiéry e Bessis em 1956 para descrever a formação de extensões citoplasmáticas de megacariote de ratos como um evento inicial na formação de plaquetas1. Utilizando o contraste de fase e técnicas cinematográficas, esses autores caracterizaram a transformação de megacaiócitos redondos maduros em células trombocitopegênicas "semelhantes a lulas" com extensões citoplasmáticas mostrando movimentos dinâmicos de alongamento e contração. Estes braços ficam progressivamente mais finos até ficarem filiformes com pequenos inchaços ao longo dos braços e nas pontas. Estes alongamentos típicos de megacaiócitos, obtidos in vitro e em mídia líquida, têm certas semelhanças com plaquetas observadas em medula óssea fixa, onde megacariócitos se projetam extensões longas através das paredes sinusoides na circulação sanguínea2,3. A descoberta e clonagem de TPO em 1994 permitiu diferenciar megacariócitos na cultura capaz de formar extensões proplateletas semelhantes às descritas nas explantas de medula óssea4,5,6. No entanto, o amadurecimento do megacaito é muito menos eficiente em condições culturais, notadamente a extensa rede interna de membrana de megacariócitos amadurecidos de medula óssea é subdesenvolvida em megacaiócitos cultivados, dificultando estudos sobre os mecanismos da biogênese plaqueta7,8.
Detalhamos aqui o modelo de explante de medula óssea, baseado em Thiéry e Bessis, para seguir em formação proplatelet em tempo real de megacariócitos de camundongos, que amadureceram totalmente em seu ambiente nativo, contornando assim possíveis artefatos in vitro e interpretações erradas. Os resultados obtidos em camundongos adultos do tipo selvagem são apresentados para ilustrar a capacidade do megacariote de estender proplatelets, sua morfologia e a complexidade dos proplatelets. Também introduzimos uma estratégia de quantificação rápida para validação da qualidade para garantir a precisão e robustez dos dados durante o processo de gravação de megacariote. O protocolo aqui apresentado é a versão mais recente do método publicado como um capítulo de livro anteriormente9.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas europeias 2010/63/UE e o Comitê de Ética dos Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Preparação de reagentes
- Prepare os reagentes conforme descrito na Tabela 1.
- Para o Estoque I, dissolva cada pó separadamente. Certifique-se de que a osmolaridade da preparação é superior a 295 mOsm/L. Esta solução pode ser armazenada a 4 °C durante um ano.
- Para a preparação do tampão da Tyrode, faça a solução conforme descrito na Tabela 1,ajuste o volume para 100 mL com água destilada e adicione 0,1 g de sacarose anidro D (+). Ajuste ao pH 7.3 usando 1 N HCl conforme necessário e o osmolaridade a 295 mOsm/L. Para evitar o crescimento bacteriano, adicione a penicilina G a 10 U/mL de concentração final e sulfato de estreptomicina a 0,29 mg/mL de concentração final. Filtre a solução final através de poros de 0,22 μm.
2. Preparação da configuração experimental
- No dia do experimento, aqueça o tampão do Tyrode a 37 °C, e ligue a câmara de aquecimento do microscópio para elevar a temperatura a 37 °C.
- Prepare todas as ferramentas necessárias, como um temporizador, câmaras de incubação, seringas de 5 mL, 21 G, fórceps, lâmina de barbear, pipetas Pasteur, lâminas de vidro e tubo de centrífugas de 15 mL(Figura 1A).
3. Isolamento da medula óssea do rato
- Euthanize C57BL/6 camundongos de 8 a 12 semanas por asfixia de CO2 e luxação cervical. Isso deve ser feito rapidamente por uma pessoa competente e qualificada.
- Para evitar contaminação microbiana, mergulhe o corpo do rato em 70% (v/v) etanol antes de remover os fêmures. Use instrumentos desinfetados em 70% de etanol para a dissecção. Colete os dois fêmures e limpe-os removendo qualquer tecido aderente. Após rápida imersão no etanol, coloque-os em tubo centrífugo de 15 mL contendo tampão tyrode de 2 mL.
- Corte as epífitas usando uma lâmina afiada e lave a medula óssea usando uma seringa de 5 mL preenchida com tampão de Tyrdode de 2 mL. Para isso, introduza uma agulha de 21 G na abertura do fêmur (no lado do joelho) e pressione lentamente o êmbolo para recuperar um cilindro de medula intacto(Figura 1B,C). Mantenha a sessão de coleta de medula o mais breve possível (menos de 10 min).
4. Secção e colocação de medula óssea na câmara de incubação
- Use uma pipeta de plástico de 3 mL para transferir cuidadosamente e suavemente a medula óssea intacta para uma lâmina de vidro. É importante que as amostras estejam cobertas com tampão para evitar a secagem(Figura 1D).
NOTA: Evite o fluxo de fluxo para minimizar tesouras que possam dissociar o tecido. - Sob um estereómico (10x), corte as extremidades da medula que podem ter sido compactadas no momento da descarga. Em seguida, corte as seções transversais com uma lâmina afiada. As seções devem ser finas o suficiente para permitir uma observação detalhada, mas garantir que os megacaiócitos não sejam danificados pela compressão (geralmente espessura em torno de 0,5 mm) (Figura 1E, F).
NOTA: As seções são feitas com uma lâmina afiada e sob uma lupa para ajustar sua espessura para cerca de 0,5 mm. Apenas as seções de espessura uniforme são selecionadas. Este procedimento não é complicado, mas sua padronização requer alguma experiência. - Usando uma pipeta plástica, colete 10 seções em tubo de 1 mL contendo tampão de Tyrode(Figura 1G).
- Transfira cuidadosamente as seções para uma câmara de incubação com diâmetro de 13 mm(Figura 1H).
- Aspire o buffer e ajuste o volume para 30 μL do buffer da Tyrode complementado com 5 % de soro do mouse.
NOTA: É nesta fase que os agentes farmacológicos podem ser adicionados para avaliar seu impacto na formação de proplatelet. - Posicione as seções à distância. Sele a câmara autoadesiva com uma mancha de cobertura da dimensão 22 x 55 mm. Incline o deslizamento de tampas enquanto gruda para evitar a formação de bolhas de ar(Figura 1I).
- Coloque a câmara na câmara de aquecimento a 37 °C. A partir deste momento, o cronômetro é iniciado (T= 0 h). O experimento funciona por 6 h a 37 °C (T= 6 h).
5. Observação em tempo real de explants de medula
- Use um microscópio de contraste de fase invertida (lente 40x para ampliação) acoplado a uma câmera de vídeo para observar as explantas da medula óssea. Deixe as células incubarem por 30 minutos antes de iniciar a observação. Durante a observação, é necessário ajustar o foco porque os megacaiócitos estão se movendo.
NOTA: Outros modos de observação são possíveis (por exemplo, DIC, fluorescência usando camundongos cujos megacariócitos expressam um marcador fluorescente endógeno), mas a microscopia de contraste de fase é ideal para visualizar claramente as extensões de megacaiócte longos e finos, permitindo quantificação precisa. Após 30 min, as células de medula migram gradualmente para a periferia da explanta, formando uma monocamada. Após 1h de incubação, megacariócitos podem ser identificados pelo seu grande tamanho e núcleos polilobulados(Figura 1J,K). Após 3h de incubação, o número de megacaiócitos aumenta e alguns têm extensões longas. - Faça vídeos para gravar a transformação dos megacariócitos.
6. Quantificação dos megacaitos que estendem a propolato
- Desenhe um mapa para visualizar cada seção na câmara de incubação(Figura 1K).
- Após 1h, identifique os megacariócitos visíveis (ou seja, células polilobuladas gigantes) na periferia de cada seção e plote suas posições no desenho. Repita este procedimento depois das 3 e 6 horas.
NOTA: Com base no desenho, cada megacaiócito pode ser facilmente localizado ao longo do tempo e a evolução de sua morfologia analisada (por exemplo, tamanho, deformação, extensão proplatelet, etc.). Outra possibilidade é o uso de um software de navegação específico.
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Representative Results
Resultados qualitativos. No início do experimento, todas as células são compactadas na seção de medula óssea. Leva 30 minutos para as células se tornarem claramente visíveis na periferia das explantas. Os megacaiócitos são então reconhecíveis pelo seu grande tamanho e sua evolução pode então ser estudada ao longo do tempo (tamanho, forma, extensão dinâmica, extensão de proplato e liberação de plaquetas)(Figura 2A). Pequenos megacaiócitos têm um diâmetro entre 20 e 30 μm e seus núcleos são polilobulados, enquanto megacariócitos redondos maduros são maiores (> 30 μm de diâmetro) com um citoplasma ampliado. Alguns megacaiócitos escuros podem ser observados(Figura 2C). Elas representam células mortas cuja proporção não deve exceder 0,5%. Uma proporção maior do que esse valor indica um problema de preparação da amostra. A morfologia do núcleo pode ser facilmente visualizada variando o foco.
Resultados quantitativos. Megacariócitos são contados manualmente como descrito em 6.2. e classificado de acordo com sua morfologia às 3h e 6h após a vedação da câmara de incubação. A Figura 2A resume as quatro classes essenciais de megacaiócitos: (1) MKs pequenos, (2) MKs grandes, (3) MKs com extensões grossas, (4) MKs com extensões finas, alongadas e divagificadas. Estes mais tarde são os megacaiócitos típicos formadores de proplatelet, com as características proeminentes dos inchaços ao longo dos proplatelets e a presença de botões refrativos em suas extremidades. Com a ajuda do mapeamento(Figura 1K),sua evolução pode ser seguida ao longo do tempo. Os resultados são expressos em uma porcentagem de cada classe em cada momento de observação. Classicamente, metade dos megacaiócitos visíveis na periferia estendem proplatelets em 6 horas para medula óssea do tipo selvagem C57BL/6(Figura 2B).
É possível seguir o destino dos MKs redondos capturando imagens sequenciais ao longo do tempo para imaginar como eles formam proplatelets(Vídeo 1). Curiosamente, quando os MKs com extensões grossas foram monitorados durante um período de 3h, observou-se que as extensões grossas poderiam se desprender do corpo celular e do ramo em proplatos ou retrair-se para reformar grandes MKs redondos.
| Reagentes | H2O | ||||
| Estoque I* | 16 g | 0,4 g | 2 g | 0,116 g | |
| NaCl | KCL | NaHCO3 | NaH2PO4, | a 100 mL | |
| (2,73 M) | (53,6 mM) | (238 mM) | (8,6 mM) | ||
| Estoque II | 2.033 g MgCl2.6H2O (0.1 M) | ||||
| Estoque III | 2.19 g CaCl2.6H2O (0.1 M) | a 100 mL | |||
| ESTOQUE DE HEPES** | 119 g HEPES* (0,5M) | a 1 L | |||
| Tampão de Tyrode | 5 mL Estoque I | 1 mL Estoque II | Estoque DE 2 mL III | 1 mL HEPES Estoque | 1,8 mL albumin Stock |
Tabela 1: Preparação do tampão do Tyrode. Cada solução de estoque é indicada na primeira coluna da tabela. A composição, bem como a quantidade de reagente (dada em gramas) necessária para cada solução de estoque é indicada por linha. O número do catálogo e a empresa de cada reagente são dados na tabela de suprimentos essenciais.
Figura 1: Representações fotográficas do método de preparação da amostra para a explanta da medula óssea. (A) Configuração experimental necessária para a preparação da medula óssea. (B) Uma agulha montada em seringa de calibre 21 é inserida no osso. (C) A medula óssea é lavada em um tubo contendo o tampão de Tyrode. (D) A medula óssea é então gentilmente depositada em um deslizamento de vidro. (E) As extremidades da medula óssea são cortadas. (F) O cilindro de medula é cortado em dez seções de 0,5 mm de espessura. (G-H) As dez seções são transferidas para uma câmara de incubação e observadas a 37 °C usando um microscópio invertido. (I) Foto representativa de uma câmara de incubação contendo as dez seções de medula óssea. (J) As células periféricas migram para formar uma camada na qual os megacaiócitos se tornam visíveis. (K) Exemplo de desenho ilustrando as dez seções de explanta na câmara de incubação, bem como a localização dos megacaiócitos (marca azul X) que migraram para fora do tecido para cada seção. A seta mostra um megacaiócito na periferia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Classificação morfológica de megacaiócitos em explantes ao longo do tempo. (A) Os megacariócitos são classificados como "pequenos", "grandes", com "extensão grossa" ou "proplatelet-extending". Barras: 50 μm(B) Proporção de megacaiócitos em cada classe foi determinada em 1 h, 3 h e 6 h para um total de 1.468 megacariócitos, mostrando que a proporção de megacariócitos "pequenos" e "esféricos" diminui com o tempo enquanto, em paralelo, a proporção de megacaitos que estendem os propletlatos aumenta (n=6 ratos). Normalmente, nas explantas de um mouse WT após 3h, entre 8,3 e 11,5 megacariócitos são observados por seção. A barra de erro corresponde ao erro padrão da média para cada amostra. (C) Imagem representativa de um megacaiócito escuro. Barra: 50 μm(D) Imagem representativa de um megacaiócito com minosina não muscular II-A rotulada com uma proteína fluorescente verde. Barra: 50 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Vídeo de lapso de tempo mostrando um MK estendendo proplatelets. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Aqui descrevemos um método in vitro simples e de baixo custo para avaliar a eficiência dos megacaiócitos para estender proplatelets que cresceram na medula óssea. O modelo de explant de medula óssea para mouse tem quatro principais vantagens. Primeiro, não são necessárias habilidades técnicas avançadas. Em segundo lugar, o tempo necessário para obter proplatelets de prolatos de extensão de megacaito é bastante curto, apenas 6 horas para o método de explant, em comparação com um mínimo de 4 dias para um método de cultura convencional a partir de progenitores de camundongos. Em terceiro lugar, dado que apenas uma pequena quantidade de tecido é necessária e que os resultados obtidos são reprodutíveis, reduz o número de camundongos necessários ao mínimo (geralmente 6 camundongos por condição experimental), tornando esses experimentos economicamente e eticamente eficientes. Por fim, mas importante, a força deste método reside no uso de megacaitos que se desenvolveram plenamente em seu ambiente natural, o que pode ser inestimável na revelação de fenótipos que poderiam ser mascarados in vitro por artefatos potenciais das condições culturais. Isso foi previamente documentado em camundongos com a inativação MYH9 restrita ao megacaito, onde foram encontrados resultados opostos na formação de proplatelet in vitro (formação aumentada)10 e in vivo (formação reduzida) megacariócitos diferenciados11. Esses resultados paradoxais têm sido explicados pela exigência da miose IIA para diferenciação normal de megacadito em um ambiente de restrição, enquanto a minosina IIA é dispensável para diferenciação de megacariocito na cultura líquida7.
Uma aplicação interessante do modelo de explant de medula óssea é a possibilidade de estudar o impacto de mutações genéticas ou deficiências em camundongos transgênicos e/ou agentes farmacológicos exclusivamente no processo de extensão plaqueteira, sem interferir no processo de diferenciação como no caso da cultura in vitro12. A situação ideal é usar a medula óssea de um fêmur como amostra tratada e sua contrapartida como controle. Além disso, o uso de camundongos transgênicos que permitem fluorescência espontânea nos megacaitos facilita a visualização do processo de extensão plaqueta. Para visualizar megacaiócitos fluorescentes, uma possibilidade poderia ser adicionar anticorpos rotulados de fluorescência contra marcadores específicos de megacaiócitos na câmara de cultura. Outra possibilidade poderia ser o uso de modelos de camundongos geneticamente modificados expressando uma proteína fluorescente, especificamente na linhagem megacariocítica, como camundongos com YFP rotulado com CD41 já relatado na literatura13, ou em todas as células como camundongos onde o GFP está ligado ao N-terminus de minosina não muscular II-A14 como ilustrado na Figura 2D.
Este método de explanta, portanto, fornece informações qualitativas e quantitativas para uma melhor compreensão da formação de plaquetas em seu ambiente natural. Vale ressaltar que, embora este método seja simples e rápido, permanece complementar aos estudos realizados utilizando cultura líquida clássica. Cada um traz conhecimentos separados de acordo com as etapas de proliferação, maturação, extensão das plaquetas e liberação de plaquetas que se deseja estudar. Por exemplo, quando o método de explantação fornece informações sobre a capacidade de extensão de proplatelets por megacaiócitos que cresceram em um contexto fisiológico, a cultura in vitro fornece informações sobre a importância do microambiente da medula óssea, como o impacto da ridigidade celular7 ou dependência da matriz extracelular15. Assim, culturas in vitro de megacaitos possibilitam modular os parâmetros do microambiente em termos de rigidez e proteínas adesivas7,16. Consulte o artigo "Cultura de megacaiócito em hidrogel tridimensional à base de metilcelulose para melhorar a maturação celular e estudar o impacto da rigidez e confinamento" por J. Boscher et al., apresentado nesta edição para obter mais informações.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesses.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer a Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 e ANR-18-CE14-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
