Summary
将铝箔显微外科插入 Spodoptera litura 的睾丸之间，以阻碍睾丸的融合。该过程包括冷冻，固定，消毒，切口，放置屏障，缝合，术后喂养和检查。这种方法提供了一种干扰组织形成的方法。
Abstract
没有使用RNA干扰（RNAi）和簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）/ CRISPR相关的核酸内切酶Cas9等遗传方法，而是在 Spodoptera litura 的睾丸之间插入物理屏障，以研究这种显微手术对其生长和繁殖的影响。在睾丸之间插入铝箔后，昆虫在变质过程中的蜕皮正常进行。昆虫的生长和发育没有显着改变;然而，如果显微外科手术停止睾丸融合，精子束的数量就会发生变化。这些发现表明，阻断睾丸融合会影响男性生殖能力。该方法可进一步应用于中断器官之间的通信，以研究特定信号通路的功能。与传统手术相比，显微外科手术只需要冷冻麻醉，比二氧化碳麻醉更可取。显微外科手术还可以最大限度地减少手术部位区域并促进伤口愈合。但是，具有特定功能的材料的选择需要进一步研究。在手术过程中做切口时，避免组织损伤至关重要。
Introduction
融合是组织或器官发育中的常见现象。例子包括 果蝇1中的背侧闭合和胸部闭合以及小鼠和鸡的腭形态发生，神经管形态发生以及心脏形态发生2。CRISPR和RNAi已被应用于研究基因在融合过程中的作用2，3，4。
Spodoptera litura（S. litura，鳞翅目： Noctuidae）是一种有害的多食性害虫，广泛分布在亚洲的热带和亚热带地区，包括中国4，5，6。 S. litura 的广泛分布部分归因于其强大的生殖能力，这与性腺发育有关。男性不育症是控制这种害虫的一种方法。如睾丸结构示意图所示，睾丸被睾丸鞘包围，包括外鞘（腹膜鞘）和内基底层。基底层向内延伸以形成滤泡上皮，并将睾丸的内部区域分成四个称为卵泡的腔室（图1）。
在卵泡中，精子形成有丝分裂和减数分裂后发育成精子，然后精子囊中的精子朝同一方向排列形成精子束7。在精子发生过程中，初级精子细胞分化为真芘精子或芘精子。幼虫期的精子细胞发育成真芘精子，长尾巴连接到细长的细胞核的头部;这些可以使卵子受精。相反，蛹中期的精子细胞发育成具有废弃细胞核的芘精子;这些精子有助于芘啉精子的存活、运动和受精9，10。蛹的第 6天是睾丸具有丰富的真芘和芘精子束的时期。
图 1：鳞翅目昆虫睾丸结构示意图11。请单击此处查看此图的放大版本。
睾丸融合发生在鳞翅目的大多数昆虫11，12中，特别是在那些农业害虫中。睾丸融合是指一对睾丸在幼虫期双侧生长，彼此接近并粘附，最终整合成单个性腺11。在 Spodoptera litura 中 ，它发生在从幼虫到蛹阶段的过程中。从5龄（L5D1）的第 1天到6龄（L6D4）的第 4天，这对睾丸的大小逐渐增长，颜色从象牙白色变为浅黄色。当它到达前期（L6D5至L6D6）时，它会变成淡红色。两个双侧对称睾丸在前裆阶段相互接近，融合为一个，逆时针扭曲（多拉视图），在蛹期和成虫期产生单个睾丸11。这种现象不会发生在蚕身上，蚕具有相当大的经济重要性，并且已经驯化了5000年13。因此，假设睾丸的融合提高了生殖能力。
为了确定 踞 踤荠睾融合术的意义，重要的是要研究阻断该过程的影响。在该协议中，在睾丸之间微外科插入铝箔以保持它们分离，并研究了昆虫及其睾丸发育的相应变化。
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Protocol
1. 昆虫饲养与维护
- 用人工饲料在环境模拟室中培养 Spodoptera litura 幼虫，直到它们到达6龄 （L6D4）的第4天。当蠕虫进入6 龄（L6D0）的第一天时，根据八腹的三角形反三角形结构选择雄性幼虫14。
注：幼体饲养和保养技术以前发表过4，14。
2. 术前准备
- 将铝箔修剪成带有圆角的矩形片（1 mm x 2 mm， 图2）。
- 通过在手术平台和相关物品（桌子表面，显微镜，冰箱，昆虫盒，蜡盘，别针和线）表面喷洒75%酒精并将其擦拭来消毒。
- 用高压蒸汽灭菌器对手术工具（包括铝箔）灭菌30分钟，并将其置于120°C的加热和干燥烤箱中。
- 确保操作人员穿戴干净的实验室服装、外科口罩和无菌手套。
3. 在睾丸之间放置屏障的显微外科手术
注：一般工作流程如下：冷冻→固定→消毒→切口→屏障放置→缝合→术后喂养和检查
- 将雄性幼虫（L6D4）放在冰上10-30分钟，以使其在手术过程中麻醉。
- 将幼虫放在蜡盘上，背侧朝上，然后用销和线固定幼虫的头部和尾部，显示第 9个身体节段背表面的手术区域（图3A）。
- 通过将3%碘酊剂与棉签涂在表皮（第 9体段）上来消毒手术区域，然后用70%酒精除去碘（图3B）。
注意：通过手术显微镜的粗略和微调聚焦于幼虫（图3C）。将蜡盘放在装满冰块的较大培养皿上以保持麻醉。 - 在第9个身体节段的背表皮上做一个2毫米长的切口。接下来，使用无菌棉签去除任何泄漏的血淋巴和脂肪体，并获得手术区域的清晰视图。
注意：在手术过程中避免心脏是很重要的。这可以通过在第9个身体节段的中线旁边或在第9和第10个身体节段之间的关节处做切口，以防止睾丸由于幼虫内部压力而弹出来完成。使用手术刀时，首先用刀片做一个垂直的切口（图4A），然后将其朝向表皮转动45°，然后均匀连续地切开表皮（图4B）。 - 使用手术镊子在睾丸之间插入一块铝箔（图5）。
- 在手术结束时，关闭切口以避免感染，并让幼虫从手术中恢复过来。
- 用运行缝合线闭合表皮（图6）。
- 使用针头支架和手术镊子打一个手术方形结，需要两个相对的镜像简单结（图6D，E）。
- 使用剪刀从环尾剪下多余的缝合线，留下2毫米的线。
- 缝合后，轻轻地将幼虫放在饲养箱中，并将它们保持在干净的环境模拟室中。继续观察幼虫。
注意：伤口停止漏血淋巴，幼虫在手术后逐渐恢复。蠕虫继续完成它们的蜕变。
图 2：使用铝箔 （1 mm x 2 mm） 制备的物理屏障。请单击此处查看此图的大图。
图3：切口前。 （A）固定幼虫。（B）手术区域表皮消毒。（三）在显微镜下进行手术。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：切口 （A）用刀片垂直切开幼虫。（B）在切开之前将刀片朝向表皮转动45°。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：在睾丸之间插入物理屏障（铝箔）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 6：缝合。 （A） 插入针头。（B）拔出针头。（三）拔出并夹住针头。（D）打第一个简单的结。（E）系住相对的镜像简单结。（F）切掉多余的缝合线。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Representative Results
显微外科手术对鳞翅目生长发育的影响
显微手术在背侧幼虫表皮上留下了2毫米长的伤口，最终停止了血淋巴泄漏并愈合。幼虫经过前期和蛹期并关闭，表明显微手术对生长发育没有重大影响。当幼虫蜕皮成蛹时，缝合线与表皮一起被丢弃。接受手术和未接受手术的蛹的外观没有明显差异。在关闭后，成年雌性成功地与先前手术的成年雄配，导致受精卵和孵化幼虫（ 图 7 ）。
图7：显微外科手术后的 鳞翅目 发育。 （A）雄性幼虫在L6D4。（B）L6D4幼虫术后立即进行。（C） 前蛹 （L6D6）。（D）P0，红色箭头表示手术地点;黄色箭头表示丢弃的表皮与缝合线。（E）交配成虫。（ F ）与接受手术的雄配的雌性成年的卵和孵化幼虫。比例尺 = 1 厘米。 请单击此处查看此图的放大版本。
幼虫经过蛹阶段，并在睾丸之间微孔放置铝箔后关闭。此操作后的详细结果已于之前发布11。虽然屏障阻止了睾丸在一些幼虫中融合，但大多数幼虫在幼虫到蛹变质期间经历了睾丸融合。
在这项研究中，个体被分为三种治疗方法：实验性（Exp），假手术（Ctl-sham）和无手术（Ctl）。Exp组的个体接受了显微手术以插入物理屏障，并且在蛹和成虫阶段他们的睾丸保持分离。Ctl-sham小组的个体接受了相同的显微手术;然而，由于未知原因，他们的睾丸没有被阻塞和融合。Ctl组包含无需手术自然生长的幼虫;他们的两个睾丸在预眮阶段正常融合。
显微外科组包含两个亚组：接受显微手术以在两个睾丸之间放置屏障的幼虫（A组）和接受显微手术切除一个睾丸的幼虫（B组：在B-1组中切除左睾丸;在B-2组中切除右睾丸）。 表1 显示了不同群体中手术幼虫的数量，幼虫死亡率，蛹的数量，化蛹的百分比，成虫的数量，成虫出苗的百分比，成功交配的百分比和成功手术的百分比。A组包括接受显微手术以在睾丸之间插入屏障的幼虫。该手术的成功只能在解剖后确定，这是当他们进一步分为Exp和Ctl-sham组时。
如图8所示，手术组幼虫死亡率略高，而手术组幼化蛹、成虫出苗和成功交配的百分比略低于对照组。然而，这些差异均无显著差异，表明显微外科手术对鳞翅目幼虫幼虫的生长发育没有明显影响。
| 群 | 幼虫数量 | 幼虫死亡率/% | 蛹数量 | 化蛹百分比/% | 成人人数 | 成虫出苗率/% | 成功配接百分比/% | 成功操作百分比/% | |||||
| 显微外科组 A-1* | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| 显微外科组 A-2* | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| 显微外科组 A-3* | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| 显微外科组 A-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| 显微外科组 A-5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| 显微外科组 A-6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| 显微外科组 A-7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| 显微外科组 A-8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| 显微外科组 B-1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| 显微外科组 B-2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| 显微外科组平均值（平均值± SD） | 159 | 17±10.1 | 123 | 88.3±13.7 | 71 | 45.8±16.3 | 43±20.8 | 25.8±18.5 | |||||
| 对照组 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| 控制组 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| 对照组 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| 对照组 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| 对照组 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| 控制组 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| 对照组平均值（平均值±SD） | 385 | 5.4±6.2 | 351 | 96.4±2.7 | 286 | 65.6±15.1 | 50±9.5 | N | |||||
表1：显微外科手术对鳞翅目发育的影响。显微外科组B-1和B-2接受了显微外科手术以切除单侧睾丸（左在显微外科组B-1，右在显微外科组B-2）。注意：显微外科A-1至A-8组接受了显微外科手术，在睾丸之间插入屏障;显微外科B-1和B-2组接受了显微外科手术以切除单侧睾丸（左在显微外科组B-1，右在显微外科组B-2）;± 星号表示该组中的个体在蛹阶段被解剖，并且没有关于成虫数量，成虫出苗百分比或成功交配百分比的统计数据;N 表示无数据。
图8：显微外科手术对软翅目生长发育的影响（n ≥6）。请点击此处查看此图的放大图。
显微外科手术对鳞翅目精子束数量的影响
进行显微外科手术以插入物理屏障以停止睾丸融合或去除 Spodoptera litura中的单侧睾丸。 对蛮和芘精子束进行计数，以计算蛹期第6天真芘精子束的百分比。如上所述，这些个体按治疗分组。Exp组的精子束数量（芘精子束，芘精子束和总数）明显低于Ctl-sham组和Ctl组。Exp组中两个分离睾丸的真芘精子束的平均数量为2082±599。在具有融合睾丸的Ctl-sham和Ctl组中，纯芘精子束的数量从4652到6200不等。
Exp组中的芘精子束数量为1602±703，而Ctl-Sham和Ctl组中的芘精子束数量为3299至4632。Exp组中的精子束总数为3684±985;它的范围从9284到10832在Ctl-Sham和Ctl组。因此，芘精子束的百分比从50%到60%不等，所有三组之间没有显着差异。 图9 显示，当防止融合时，真芘和芘精子束的量减少，而纯芘精子束的百分比保持不变。
图9：不同组中的精子束数量和纯芘精子束的百分比（A）Exp组中的精子束数量明显低于Ctl-sham组和Ctl组。（B）三组真芘精子束百分比无显著差异。星号表示与 Ctl. P < 0.05、平均值 ± SD （n ≥5） 相比存在显著差异。请点击此处查看此图的放大版本。
切除幼虫单侧睾丸后，计算真芘和芘精子束的数量，以计算蛹期第6天真芘精子束的百分比。芘和芘精子束的数量分别为1286至1638和720至850，这意味着总数从2006年到2488年不等，对应于63%至65%的纯芘精子束百分比。 图10 显示，单侧睾丸切除后精子束数量显著减少（减少60%~70%），对真芘精子束的百分比没有太大影响。
图10：切除单侧睾丸后精子束数和芘烯单侧睾丸百分比 （A）三组蛹中接受单侧睾丸切除的蛹精子束数量差异显著（分别在显微外科B-1组和显微外科B-2组切除左睾和右睾丸）（B）与Ctl相比，蛹中接受单侧睾丸切除的芘中纯芘精子束的百分比没有显着差异。星号表示与 Ctl. P < 0.05、平均值 ± SD （n ≥8） 相比存在显著差异。对照组=无手术，睾丸在预眮期自然融合;Ctl-Sham组=手术不成功，显微手术后睾丸融合;Exp. 组 = 进行显微手术以在两个睾丸之间插入物理屏障。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
在 对Spodoptera litura的睾丸融合进行显微外科手术后，精子束的数量减少，这支持了这种融合有利于生殖能力的假设。自20世纪初 以来，外科手术一直被用于研究昆虫的生理发育。为了确定颅神经是否受到昆虫的调节，一些研究人员对不同的昆虫（包括半翅目 Rhodnius prolixus ，鳞翅目中的 Lymantria dispar ）进行了结扎和斩首等程序 15 ， 16 。斩首过程包括用手术刀取下头部，用抗生素消毒，手术后石蜡密封伤口17。在提取和移植 Bombyx mori的胸前腺体后，用石蜡密封伤口18。然而，这些常规治疗的不可避免的后果是感染和高死亡率，这使得很难分析昆虫发育后期的生理状态。
因此，该协议旨在确保在显微镜下进行微创手术，以尽量减少伤口。而且，与二氧化碳麻醉相比，冷冻麻醉更加可行和方便。用作阻碍物的铝箔被切割成1 mm x 2 mm的尺寸，相当于睾丸之间的空间。显微外科手术后，缝合线在蜕皮过程中随早期表皮脱落，使蜕变和发育正常进行。繁殖结果表明，成功的显微外科手术并没有显著影响昆虫的发育。当睾丸没有融合时，总精子，芘和芘精子束的数量明显低于Ctl组。这些结果表明，男性生殖能力受睾丸融合的影响。评估精子细胞质量和活力在各种动物中具有不同的指标和方法，包括哺乳动物的精子异体状态19，精子活力20，线粒体活性21，质膜完整性22和其他标志物23，24 。由于昆虫独特的精子细胞发育，未来的研究需要检查繁殖能力（交配，孵化25）的变化。
该协议中的关键步骤需要特别注意，以确保可靠的结果。在做切口时，避免对其他组织的损伤很重要。其次，阻隔材料的选择必须基于其无毒和无菌性能以及缺乏尖锐的边界。最后，用跑步缝合线和手术方结封闭切口，然后在手术区域密封，有效预防术后感染。仍然可以对昆虫的内部结构进行移植，提取和施用药物等手术，然后在手术区域进行密封。
高成功率需要熟练的技能，这种技术有一些缺点。首先，它效率不高，因为操作是一个接一个地完成的，因此个体差异是不可避免的。初步研究表明，当使用医用静脉输血管，橡胶隔膜，吸收珠和牙科材料分离睾丸时，结果并不像预期的那样成功。此外，当阻塞者漂流时，该技术不成功。手术成功率下降的可能原因包括昆虫在裱前阶段移动，收缩，蜕皮和重新组织器官时屏障滑落。或者，铝箔可以插入太靠近润滑肠，导致屏障漂浮开来。因此，应进一步优化合适的材料。
尽管显微外科手术存在局限性，但它提供了一种在建立转基因模型系统之前获得有关生物现象的初步结果的方法。Sweeney和Waterson通过插入钽箔块26分析了雏鸡胚胎的脱落发育，而Wilde和Logan使用铝箔作为不可渗透的屏障来研究视黄酸信号传导在诱导和随后启动前肢和后肢中的作用27。在无脊椎动物 Spodoptera litura中，这种显微手术成功地实现了蠕虫的正常生长和发育，为研究生理现象提供了一种方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（Nos.：31772519，31720103916;）和西南大学蚕基因组生物学国家重点实验室（编号：sklsgb2013003）的公开资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
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