Summary
这里描述的是光血栓中风模型，其中中风通过完整的头骨产生，在施用光敏染料后，使用激光照明诱导永久微血管闭塞。
Abstract
在发达国家，中风是导致死亡和成人残疾的主要原因。尽管对新的治疗策略进行了广泛的研究，但中风患者的治疗选择仍然有限。因此，需要对病理生理途径进行更多的研究，如中风后炎症、血管生成、神经元可塑性和再生。鉴于 体外 模型无法重现大脑的复杂性，实验性中风模型对于分析和随后评估这些机制的新药靶点至关重要。此外，迫切需要为克服所谓的复制危机而为所有程序制定详细的标准化模型。作为免疫冲程研究财团的一项努力，描述了一个标准化的光血栓小鼠模型，该模型使用玫瑰孟加拉的腹内注射和561纳米激光照亮完好的头骨。该模型允许在没有侵入性手术的情况下将中风的效果分配给大脑的任何皮质区域：因此，使中风的研究在大脑的各个区域。在本视频中，演示了光血栓模型中中风感应的手术方法以及理论分析。
Introduction
缺血性中风仍然是21世纪 发达国家的主要死因和成人残疾，2017年全球约有270万人死于缺血性中风。即使科学界作出巨大努力，也很少有治疗方法。此外，由于排除标准如此之高，许多患者无法获得这些已经有限的选择，因此迫切需要新的治疗方法来改善中风后的功能恢复。
考虑到 体外 模型无法复制大脑的复杂相互作用，动物模型对于临床前中风研究至关重要。老鼠是中风研究领域最常用的动物模型。这些小鼠模型大多旨在通过阻断中脑动脉（MCA）内的血流来诱导梗塞，因为大部分人类中风病变位于MCU区域2。虽然这些模型可以更好地回顾人类中风病变，但它们涉及高梗塞体积变异性的抽搐手术。
自从罗森布卢姆和艾尔-萨班于1977年提出光血栓模型3，后来该模型应用于老鼠沃森等人，它已成为广泛应用于缺血性中风研究5，6。光血栓中风模型诱导局部和定义的皮质梗塞，由于以前注入血液中的光敏染料的光活化。这会导致暴露在光线下的船只局部血栓。简言之，在接触注射光敏染料的光线后，诱发内皮细胞膜局部氧化损伤，导致血小板聚集和血栓形成，随后局部扰乱脑血流7。
这种技术的主要优点在于其执行的简单性和将病变引向所需区域的可能性。与其他实验性中风模型不同，执行光血栓中风模型需要少量的手术专业知识，因为病变是通过对完整头骨的照明诱导的。此外，划定良好的边界（图2A和图5B）和灵活性诱导病变到特定的大脑区域，可以促进研究细胞反应内缺血或完整的皮质区域8。由于这些原因，这种方法适用于皮质可塑性细胞和分子机制的研究。
在过去几十年中，人们越来越担心研究小组之间缺乏可复制性，这引发了所谓的复制危机。在2015年10月协调了第一个临床前随机对照多中心试验研究后，一个改进临床前研究的拟议工具11、12、13被证实，独立实验室临床前研究不重复的一个原因是实验性中风模型和结果参数缺乏足够的标准化。因此，当免疫中风联合体成立（https://immunostroke.de/）时，一个旨在了解中风恢复机械原理背后的大脑免疫相互作用的合作，每个研究小组中所有实验性中风模型的标准化至关重要。
这里描述的是上述研究联合体中使用的光血栓模型诱导的标准化程序。简言之，一只动物接受了麻醉，在腹内接受了玫瑰孟加拉注射（10μL/g），从布雷格玛留下的3毫米完整的头骨立即被561纳米激光照亮20分钟（图1）。此外，还报告了分析此模型中风结果的相关理论和行为方法。所有方法都基于实验室制定和使用的标准操作程序。
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Protocol
本视频中报道的实验是根据使用实验动物的国家准则进行的，这些议定书得到了德国政府委员会的批准（德国慕尼黑，雷吉龙·冯·奥伯巴耶恩）。这项研究中使用的老鼠是雄性C57Bl/6J小鼠，10-12周大，由德国查尔斯河公司派遣。这些动物被安置在受控温度（22°C±2°C）下，周期为12小时，可获得颗粒食物和水 。
1. 材料和仪器的准备工作
- 溶解玫瑰孟加拉在0.9%盐水溶液，以达到10毫克/毫升的最终浓度。连接热毯，使手术区域保持温暖，并在麻醉期间将鼠标体温保持在 37 °C。
- 准备剪刀、钳子、棉片、扩张酚眼药膏和缝合材料。准备带盐水溶液（无针）的注射器，以保持操作区域水分。准备麻醉气体（100% O2 + 异黄酮）。
2. 动物的准备工作
- 手术前30分钟注射镇痛药（4毫克/千克卡洛芬和0.1毫克/千克丁丙诺啡）。
- 记录小鼠体重以调整注射的玫瑰孟加拉的剂量（10 μL/g，即100微克/克）。
- 将鼠标放在感应室中，异黄素流动率为 4%，使其麻醉，直到身体和活体的自发运动停止。
- 将鼠标转移到立体战术框架中，并将其置于易发位置，鼻子进入麻醉面罩。修复动物，将异黄素浓度保持在 4%， 1 分钟。然后将异黄素浓度降低并保持在 2%。
- 轻轻插入直肠探头，以监测整个外科手术的温度。设置相关的反馈控制加热垫，将鼠标体温保持在 37 °C。
- 将扩张酚眼药膏涂在眼睛上，用消毒剂清洁皮肤和周围的毛皮。
3. 光血栓模型
- 做一个2.0-2.5厘米的纵向切口和缩回暴露头骨。用一个切口进行头骨暴露，以避免伤口并发症。
- 用棉花轻轻取出腹膜，并识别冠状缝合线。
- 戴上防护眼镜，打开 561 nm 激光，并标记左侧的 3 mm。
- 关闭激光，在上面提到的标记坐标上贴上一个直径为 4 mm 的孔的贴纸。
- 在腹内向鼠标注射孟加拉玫瑰（10微升/克）。将激光束置于距离头骨 4-5 厘米处，打开 561 nm 激光并照亮头骨 20 分钟。
- 在头骨上涂上两滴0.9%的盐水，以补充水分，缝合伤口，并将动物置于37°C的恢复室，从麻醉中恢复过来。1小时后，将老鼠送回温度控制室的笼子里。
- 手术后每12小时注射一次镇痛药（4毫克/千克卡洛芬和0.1毫克/千克丁丙诺啡）。
4. 沙姆操作
- 执行第 4.1.1 和 4.1.2 步中描述的沙姆操作的两种不同程序。
- 执行与上述操作相同的所有程序。注射玫瑰孟加拉没有打开激光。麻醉20分钟后，让动物在康复室停留1小时恢复，然后被送回笼子。
- 执行与上述操作相同的所有程序，打开激光。不要注射玫瑰孟加拉。经过20分钟的激光照明，让动物在恢复室停留1小时，从麻醉中恢复过来，然后被送回笼子。
5. 激光斑点
- 连接加热的毯子，使手术区域保持温暖，并在麻醉期间将鼠标体温保持在 37 °C。
- 将鼠标放入感应室，其异黄素流动速率为 4%，使其麻醉，直到身体的自发运动和活体停止，然后将鼠标转移到立体定向框架中。
- 将鼠标置于易发位置，鼻子插入麻醉面罩。修复动物，将异黄素浓度保持在4%1分钟。
- 轻轻插入直肠探头，以监测整个外科手术的温度。设置相关的反馈控制加热垫，将鼠标体温保持在 37 °C，并将扩张酚眼药膏涂在两只眼睛上。用消毒剂清洁皮肤和周围的毛皮。
- 做一个2.0-2.5厘米的纵向切口和缩回暴露头骨。用一个切口进行头骨暴露，以避免伤口并发症。
- 将固醇框架置于激光斑点下，并调整高度以获得清晰的图像。将激光斑点灌注成像 （LSI） 相机聚焦在颅面窗口上。配置高分辨率激光斑点成像 （LSI） 相机系统，如前所述15。
- 使用 785 nm 波长和 80 mW 激光从 1 厘米 x 1 厘米的视野获取数据，帧速率为 21 图像/秒，工作距离为 1 厘米，工作距离为 1 分钟。
- 成像后，将两滴0.9%的盐水涂在头骨上补充水分，缝合伤口，并将动物置于37°C的恢复室中，从麻醉中恢复1小时。1小时后，将老鼠送回温度控制室的笼子里。
6. 神经分数
注：对于神经缺陷分析，Eckenstein等人于1997年发表的修改后的神经学量表使用了15。
- 得分的动物一般（表1）和焦点赤字（表2）。此复合刻度范围从 0（无赤字）到 46（严重减值）。
- 每天在同一时间执行神经分，并使用手术服保持中性气味。
- 在测试前，用一个开放的笼子在房间里对老鼠进行30分钟的隔离，并允许它们观察每只30秒。
7. 灌注
- 准备一个包含PBS-肝素（2 U/mL）的20mL注射器，并将其放在长凳上方1米处，以方便/确保重力驱动的灌注。
- 在腹内注射100微升氯胺酮和西拉津（分别为120/16毫克/千克体重）。等待5分钟，并证实停止自发的身体运动和活力。
- 将动物固定在苏平位置，用 100% 乙醇消毒腹部身体表面。在腹部做一个3厘米长的切口：切开隔膜和肋骨，使心脏完全可视化。
- 在右中庭做一个小切口，将灌注罐插入左心室，用20ml PBS-肝素灌注。
- 灌注后，斩首动物并取出大脑，用干冰将其冷冻，并储存在-80°C，直到进一步使用。
8. 梗塞体积
- 冷冻：每120μm将低温统计器上的大脑连续切割到20μm厚的部分，并安装在幻灯片上。将幻灯片存储在 -80 °C 下，直到进一步处理。
- 克雷西尔紫罗兰 （CV） 染色
- 要准备染色溶液，将 0.5 克 CV 醋酸盐混合在 500 mL 的 H2O. 搅拌和加热（60 °C）中，直到晶体溶解。让溶液冷却并存放在深色瓶子中。每次使用前重新加热至 60 °C 并过滤（纸张过滤器）。
- 在室温下干燥滑梯 30 分钟。将它们放于 95% 乙醇中 15 分钟，然后是 70% 乙醇 1 分钟，然后放 50% 乙醇 1 分钟。
- 将滑梯放入蒸馏水中 2 分钟，刷新蒸馏水，并将滑梯再次放入水中 1 分钟。然后，将幻灯片放在预加热染色溶液中，在 60 °C 下放置 10 分钟。 在蒸馏水中清洗滑梯两次，1分钟。
- 将幻灯片放入 95% 乙醇中 2 分钟。然后将它们放入 100% 乙醇中 5 分钟，刷新 100% 乙醇，并将幻灯片再次放入 100% 乙醇中 2 分钟。之后，用安装介质覆盖滑梯。
- 分析：扫描幻灯片，通过斯旺森方法16 分析间接梗塞体积，以纠正水肿：缺血区 = （缺血区域） -（（半球） - （反半球）。
9. Tunel 染色（原位 凋亡检测套件）
- 干燥幻灯片， 在 Pbs （ph 7.4） 中修复 4% 的副甲醛 10 - 20 分钟在 Rt. 洗涤在 Pbs， 修复后在预冷乙醇： 醋酸 2：1 5 分钟在 - 20 °C.
- 在 PBS 中清洗并应用平衡缓冲（RT 最高 60 分钟为 10 秒），并应用工作强度 TdT 酶（加湿室中 37 °C 为 1 小时）
- 应用工作强度停止/洗涤酶（RT 10 分钟），在 PBS 中清洗并施用加热 （RT） 工作强度抗二恶英结合 （黑暗中 RT 30 分钟）
- 在 Pbs 中清洗， 在 Rt 与 Dapi 孵育 5 分钟， 然后用氟山介质安装幻灯片。
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Representative Results
此处描述的模型是玫瑰孟加拉注射的光血栓冲程模型，完整的头骨照明为 20 分钟，在光纤上恒定的 561 nm 波长和 25 mW 输出功率。虽然完整的光栓手术持续30分钟，但动物保持在低麻醉下，脑损伤适中。大约10分钟后，转移到他们的笼子，所有的动物都醒了，在笼子里自由移动，并与垃圾伙伴互动。
在中风诱导后24小时使用青紫罗兰色染色连续冠脑部分（图2A）进行梗塞体积测量。平均梗塞体积为29.3毫米3，占一个脑半球的23%。此外，此笔画模型的变异性非常低，标准偏差约为 3.5% （图 2B）。病变区包括运动皮层，没有皮下结构的感情。
光血栓形成导致中度、长期的传感器运动损伤，由复合神经分数17（图3）表示：手术后24小时、3天和7天测量了一般和焦点缺陷。一般神经分数有五个项目，包括毛皮，耳朵，眼睛，姿势和自发活动的评估，最高得分为18（表1）。焦点神经评分包括七个项目，包括身体对称性评估、步态、攀爬、盘旋行为、前肢对称性、强制骑自行车和胡须反应，最高得分为28分（表2）。与沙姆操作的动物相比，手术后24小时的复合神经分数发生了显著变化。这些差异仍然存在，虽然中风小鼠随着时间的推移而改善（图3）。
观察期间的死亡率很少发生在1-2%的动物身上。在这份报告中，所研究的10种动物都不得被排除在外，它们都存活了7天的观察期。在手术后24小时、3天和7天（图4A，B）监测小鼠的体重和温度变化。数据显示，只有玫瑰孟加拉照明组的体重和体温在手术后24小时下降，但在手术后3天内恢复到沙姆手术动物的水平。
为了确认缺血变化的诱导，手术后24小时，动物们接受了激光成像测试。激光斑点对比成像测量了皮层的血液灌注，持续时间为1分钟，为每只动物获得了平均颜色编码的图片。这表明，仅玫瑰孟加拉或激光照明不会产生病变，而同时应用玫瑰孟加拉和激光照明产生一个直径为4毫米的圆形低灌水区，周围环绕着一个狭窄的卵石区（图5A）。此外，手术后24小时用于评估梗塞体积的青紫罗兰和Tunyl染色显示，玫瑰孟加拉或激光照明手术均未发现组织损伤。另一方面，玫瑰孟加拉 - 激光照明产生了一个划线良好的病变（图5B）。
表1：一般神经分数。在测量的五个一般赤字中，动物可以根据严重程度获得 0 到 4 分。然后，对五个领域的分数进行汇总，以提供 0-18 的总总分。 请点击这里下载此表。
表2：焦点神经分数。在测量的七个一般赤字中，动物可以根据严重程度获得 0 到 4 分。然后，对五个领域的分数进行汇总，以提供 0-28 的总总分。 请点击这里下载此表。
图1： 光血栓形成 （PT）。 图描绘了照片血栓区域，距离布雷格玛 3 毫米。绿点表示激光的位置。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：体积梗塞分析及梗塞结果24小时后PT.（A）代表紫罗兰染色冠心脑，段每120微米在24小时后PT.虚线划定病变区。（B） PT 后 24 小时对 10 个大脑（每个点代表一个单个大脑）进行梗塞体积分析。水平红线表示平均值（29.32 mm3），误差条表示标准偏差（3.45 mm3）。请单击此处查看此图的较大版本。
图3： PT后功能缺陷的神经分数。 复合神经分数之前， 24 小时， 3 天， 7 天后 Pt. Bl = 之前 Pt， Rb = 玫瑰孟加拉。n = 每组 5 个。*p < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：PT.（A）体重和（B）体温后体重和（B）体温与24小时沙姆操作组相比略有下降，在PT.BL之后3天恢复=在PT、RB=玫瑰孟加拉之前。n = 每组 5 人。 *p < 0.05。请单击此处查看此图的较大版本。
图5： PT 后的病变确认。（A） 激光斑点成像（B） 克雷西尔紫罗兰 （上面板） 和 Tunel 染色 （下面板） 确认病变后， 只有在管理玫瑰孟加拉和随后的激光照明。Rb = 玫瑰孟加拉。比例尺条 = 上面板 B 中的 1，000 μm，下面板 B 中的刻度条 = 20 μm。
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Discussion
提交的协议描述了光血栓形成的实验性中风模型，用561纳米激光照亮完好的头骨，并进行了玫瑰孟加拉的腹内注射。直到最近，这种模式的使用一直很低，但正在稳步增加。
此模型中中风诱导期间的死亡率不存在。手术过程中，由于麻醉并发症或在符合排除标准后做出牺牲，总死亡率低于5%。为保证该模型的低变异性和可重复性，建议以下排除标准：1） 操作时间超过 30 分钟：2） 缝合线感染：3） 咬伤;和 4） 在 Pt 之后 24 小时没有梗塞或没有前部不对称。
广泛使用的实验性中风模型是MCU的短暂闭合，使用缝合丝，这是引入内部胡萝卜动脉，直到硅涂层尖端遮挡MCAR的起源。该模型允许通过去除灯丝进行再灌注，并模拟人类临床场景，其中在自发或治疗（rtPA）溶解后，脑血流的恢复是18，19。然而，它涉及一个复杂的手术与高变异性的最终梗塞和高死亡率10。相比之下，通过凝固动脉20，21，诱导局部定义的病变在新皮质22中，可以实现扁豆动脉的MCO永久闭合。虽然这个模型有较低的死亡率，它需要侵入性手术的动物通过在MCA的头骨颤动，以后来凝固它23。因此，在活体中风研究中，成功和公正的手术技能是必需的。
与其他脑缺血模型相比，本视频中进行的光血栓模型具有无颅骨切除术或动物大手术的优点，不像其他涉及复杂手术或脑颅切除术的模型。此外，模型的简单执行使许多手术可以进行，培训时间较长。低死亡率，中度梗塞量，和灵活性，诱导病变到特定的大脑区域，强调这个实验范式的优势，大脑再生和中风研究24，25，26，27。
尽管有明显的优点，但应考虑此笔画模型的一些局限性。麻醉剂长时间暴露在动物身上可能是一个关键因素，因为麻醉剂对神经保护和中风结果的影响已经是众所周知的。虽然这种外科手术的持续时间大约需要30分钟，但由于在20分钟的激光照明期间动物的微小操作，动物的麻醉浓度可能很低。由于此模型会诱发中度脑损伤，因此只能检测到轻微的行为缺陷。因此，更先进的测试系统具有更高的灵敏度和定性测试参数，如熟练达到测试29和神经分数17，如这里所述，也许更适合检测长期功能结果在这个模型。最后，由于血小板永久聚集到发光的血管中，无法获得再灌注，这是在大量中风患者中观察到的一个特征，由于自发凝块裂解或治疗30。
2013年，拉巴特-盖斯特和托马西发布了类似的光晕中风模型，描述了使用冷光灯而不是561纳米绿色激光8的PT协议。激光和冷光源都可用于诱导玫瑰孟加拉激发。与冷光灯比冷光灯更具有激光光源的优点是，激光可用于瞄准单独的表面动脉 ，用于体内 血管特异性凝固31。虽然我们没有针对特定的动脉，但我们使用 561 nm 绿色激光进行脑照明和光粒体感应，因为玫瑰孟加拉语的吸血峰值为 562 nm。为了确保照明期间的激光强度，使用 Cobolt 监视器软件-6.1.0.0 校准激光。此外，在本研究中，玫瑰孟加拉剂量为10微升/克（100微克/克）足以诱发光粒体病，而以前的协议报告剂量较高（150微克/克）8。此外，该协议提供了一个行为方法来分析中风结果（神经分数）和一个额外的假对照组（激光照明），以证明激光本身不会产生任何组织损伤，所以只有玫瑰孟加拉语的组合 - 激光照明诱发脑损伤。
总的来说，这种非侵入性的简单外科手术使中风病变对大脑具有很高的可重复性和方向性，同时由于死亡率极低而有可能进行长期观察。这种光血栓中风模型被誉为基础和转化性中风研究的宝贵实验范式。
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Disclosures
作者没有相互竞争的利益可以披露。
Acknowledgments
我们感谢免疫中风联盟（FOR 2879，从免疫细胞到中风恢复）的所有合作伙伴的建议和讨论。这项工作由德国福松斯格梅因沙夫特（DFG，德国研究基金会）在德国系统神经学集群（EXC 2145 SyNergy - ID 390857198）框架内的卓越战略下，以及根据LI-2534/6-1、LI-2534/7-1和LL-112/1-1的赠款资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
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