Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

النمذجة السكتة الدماغية في الفئران: الآفات القشرية البؤرية عن طريق Photothrombosis

Published: May 6, 2021 doi: 10.3791/62536
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute for Stroke and Dementia Research, LMU Munich, 2Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)

Summary

الموصوف هنا هو نموذج السكتة الدماغية الضوئية ، حيث يتم إنتاج السكتة الدماغية من خلال الجمجمة سليمة عن طريق تحفيز انسداد الأوعية الدموية الدقيقة الدائمة باستخدام إضاءة الليزر بعد إدارة صبغة حساسة للضوء.

Abstract

السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي للوفاة وإعاقة البالغين المكتسبة في البلدان المتقدمة. على الرغم من التحقيق المكثف للاستراتيجيات العلاجية الجديدة ، لا تزال هناك خيارات علاجية محدودة لمرضى السكتة الدماغية. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من البحوث للمسارات المرضية مثل التهاب ما بعد السكتة الدماغية ، وتولد الأوعية ، واللدونة العصبية ، والتجديد. ونظرا لعدم قدرة النماذج المختبرية على إعادة إنتاج تعقيد الدماغ، فإن نماذج السكتة الدماغية التجريبية ضرورية لتحليل وتقييم أهداف الأدوية الجديدة لهذه الآليات وتقييمها لاحقا. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة ماسة إلى نماذج موحدة مفصلة لجميع الإجراءات للتغلب على ما يسمى بأزمة النسخ المتماثل. كجهد داخل اتحاد أبحاث ImmunoStroke ، يتم وصف نموذج ماوس فوتوثرومبوتيك موحد باستخدام حقنة داخل الصفاق من روز البنغال وإضاءة الجمجمة السليمة بليزر 561 نانومتر. يسمح هذا النموذج بأداء السكتة الدماغية في الفئران مع تخصيصها لأي منطقة قشرية في الدماغ دون جراحة جراحية غازية. وبالتالي، تمكين دراسة السكتة الدماغية في مناطق مختلفة من الدماغ. في هذا الفيديو ، يتم عرض الطرق الجراحية لتحريض السكتة الدماغية في النموذج الضوئي جنبا إلى جنب مع التحليل النسيجي.

Introduction

لا تزال السكتة الدماغية السبب الرئيسي للوفاة وإعاقة البالغين المكتسبة في البلدان المتقدمة فيالقرن الحادي والعشرين والتي تسبب ما يقرب من 2.7 مليون حالة وفاة في عام 2017 في جميع أنحاء العالم1. حتى مع الجهود الهائلة التي يبذلها المجتمع العلمي ، لا تتوفر سوى القليل من العلاجات. وعلاوة على ذلك، مع مثل هذه المعايير الاستبعاد عالية، وهذه الخيارات محدودة بالفعل ليست في متناول العديد من المرضى، مما أدى إلى حاجة ملحة لعلاجات جديدة لتحسين الانتعاش الوظيفي بعد السكتة الدماغية.

وبالنظر إلى عدم قدرة النماذج المختبرية على تكرار التفاعلات المعقدة للدماغ، فإن النماذج الحيوانية ضرورية لأبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية. الفئران هي النموذج الحيواني الأكثر استخداما في مجال أبحاث السكتة الدماغية. وتهدف غالبية هذه النماذج الماوس للحث على احتشاءات عن طريق منع تدفق الدم داخل الشريان الدماغي الأوسط (MCA) منذ تقع غالبية الآفات السكتة الدماغية البشرية في إقليم MCA2. على الرغم من أن هذه النماذج تلخص بشكل أفضل آفات السكتة الدماغية البشرية ، إلا أنها تنطوي على عمليات جراحية ملتصقة مع تباين كبير في حجم العقائد.

منذ روزبلوم واقتراح الصبان من نموذج photothrombotic في 19773, وتطبيق هذا النموذج في وقت لاحق للفئران واتسونوآخرون. نموذج السكتة الدماغية الضوئية يحفز احتشاء القشرية المحلية والمحددة نتيجة لphotoactivation صبغة حساسة للضوء حقن سابقا في تدفق الدم. وهذا يسبب تجلط الأوعية المحلية في المناطق المعرضة للضوء. لفترة وجيزة ، عند التعرض للضوء من الصبغة الحساسة للضوء المحقونة ، يتم تحريض الإصابة التأكسدية الموضعية لغشاء الخلية البطانية ، مما يؤدي إلى تجميع الصفائح الدموية وتشكيل الجلطة ، يليها اضطراب محلي لتدفق الدم الدماغي7.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في بساطتها في التنفيذ وإمكانية توجيه الآفة إلى المنطقة المرغوبة. على عكس نماذج السكتة الدماغية التجريبية الأخرى ، هناك حاجة إلى خبرة جراحية طفيفة لأداء نموذج السكتة الدماغية الضوئية حيث يتم تحريض الآفة من خلال إضاءة الجمجمة السليمة. وعلاوة على ذلك، فإن الحدود المحددة جيدا(الشكل 2A والشكل 5B)والمرونة للحث على الآفة إلى منطقة معينة في الدماغ يمكن أن تسهل دراسة الاستجابات الخلوية داخل المنطقة القشرية الإقفارية أو السليمة8. لهذه الأسباب، وهذا النهج هو مناسبة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية من اللدونة القشرية.

على مدى العقود القليلة الماضية ، والقلق المتزايد بشأن عدم إعادة الإنتاج بين مجموعات البحوث قد صاغ ما يسمى أزمة النسخ المتماثل9. بعد تنسيق أول دراسة تجريبية متعددة المراكز معشاة قبل السريرية في عام 201510، وهي أداة مقترحة لتحسين الأبحاث قبل السريرية11و12و13، تم التأكيد على أن أحد أسباب عدم الاستنساخ بين الدراسات قبل السريرية من مختبرات مستقلة هو عدم وجود توحيد كاف لنماذج السكتة الدماغية التجريبية ومعلمات النتائج14. وبناء على ذلك، عندما تم تأسيس اتحاد ضربة المناعة (https://immunostroke.de/)، وهو تعاون يهدف إلى فهم التفاعلات بين الدماغ والمناعة الكامنة وراء المبادئ الميكانيكية لاستعادة السكتة الدماغية، كان توحيد جميع نماذج السكتة الدماغية التجريبية بين كل مجموعة بحثية أمرا أساسيا.

وصف هنا هو الإجراء الموحد لتحريض نموذج فوتوثروثوتيك كما هو مستخدم في اتحاد البحوث المذكورة أعلاه. لفترة وجيزة، خضع التخدير، تلقى حقنة روز البنغال (10 ميكرولتر / ز) داخل الصفاق، والجمجمة سليمة، 3 ملم اليسار من bregma، أضاءت على الفور من قبل ليزر 561 نانومتر لمدة 20 دقيقة (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، يتم الإبلاغ عن طريقة الهسطولوجيا والسلوكية ذات الصلة لتحليل نتائج السكتة الدماغية في هذا النموذج. وتستند جميع الأساليب على إجراءات التشغيل القياسية التي وضعت واستخدمت في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت التجارب التي تم الإبلاغ عنها في هذا الفيديو وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية لاستخدام الحيوانات التجريبية، ووافقت اللجان الحكومية الألمانية على البروتوكولات (ريجيرونغ فون أوبربايرن، ميونيخ، ألمانيا). كانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من الذكور C57Bl/6J الفئران، 10-12 أسابيع من العمر، وأرسلت من قبل نهر تشارلز ألمانيا. تم إيواء الحيوانات تحت درجات حرارة خاضعة للرقابة (22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية) ، مع فترة دورة خفيفة داكنة مدتها 12 ساعة والوصول إلى الطعام المكريه والحصول على libitum الإعلانية المائية.

1. إعداد المواد والصكوك

  1. حل روز البنغال في محلول ملحي 0.9٪ للوصول إلى تركيز نهائي من 10 ملغم / مل. قم بتوصيل بطانية الحرارة للحفاظ على دفء منطقة العملية والحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس أثناء التخدير عند 37 درجة مئوية.
  2. إعداد مقص، ملقط، قطعة من القطن، مرهم العين dexpanthenol، ومواد خياطة. إعداد حقنة مع محلول ملحي (بدون إبرة) للحفاظ على منطقة العملية رطب. إعداد غاز التخدير (100٪ O2 + isoflurane).

2. إعداد الحيوان

  1. حقن مسكن 30 دقيقة قبل الجراحة (4 ملغم/كغ كاربروفين و0.1 ملغم/كغ بوبرينورفين).
  2. سجل وزن جسم الفأر لضبط جرعة روز البنغال ليتم حقنها (10 ميكرولتر / غرام أي 100 ميكروغرام / غرام).
  3. ضع الماوس في غرفة التعريفي مع معدل تدفق isoflurane من 4٪ لتخديره حتى تتوقف الحركة العفوية للجسم وvibrissae.
  4. نقل الماوس إلى الإطار المجسم ووضعه في موقف عرضة مع أنفه في قناع التخدير. إصلاح الحيوان والحفاظ على تركيز isoflurane في 4٪ لمدة دقيقة واحدة. ثم تقليل والحفاظ على تركيز ايزوفلوران في 2٪.
  5. أدخل مسبار المستقيم برفق لمراقبة درجة الحرارة طوال العمليات الجراحية. تعيين لوحة التدفئة ذات الصلة التي تسيطر عليها ردود الفعل للحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس في 37 درجة مئوية.
  6. تطبيق مرهم العين dexpanthenol على كل من العينين وتنظيف الجلد والفراء المحيطة بها مع عامل مطهر.

3. نموذج فوتوثيرومبوسيس

  1. إجراء شق طولي 2.0-2.5 سم والتراجع لفضح الجمجمة. إجراء التعرض للجمجمة بقطع واحد لتجنب مضاعفات الجرح.
  2. إزالة periosteum بلطف مع القطن وتحديد الغرز التاجية.
  3. وضع على النظارات الواقية، والتبديل على الليزر 561 نانومتر ووضع علامة على bregma +3 ملم اليسار.
  4. قم بإيقاف تشغيل الليزر، وارفق ملصقا مع ثقب قطره 4 مم يوضع في الإحداثيات المميزة المذكورة أعلاه.
  5. حقن الماوس مع البنغال روز (10 ميكرولتر / غرام)، intraperitoneally. ضع شعاع الليزر على بعد 4-5 سم من الجمجمة، وابدل ليزر 561 نانومتر وأضاء الجمجمة لمدة 20 دقيقة.
  6. تطبيق قطرتين من 0.9٪ المالحة على الجمجمة لترطيب، خياطة الجرح، ووضع الحيوان في غرفة الانتعاش في 37 درجة مئوية للتعافي من التخدير. بعد ساعة واحدة، أعد الفئران إلى أقفاصها في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها.
  7. حقن مسكن كل 12 ساعة لمدة 3 أيام بعد الجراحة (4 ملغم / كغ كاربروفين و 0.1 ملغ / كغ بوبرينورفين).

4. عملية الشام

  1. تنفيذ إجراءين مختلفين لعمليات الشام كما هو موضح في الخطوتين 4-1-1 و4-1-2.
    1. تنفيذ كافة الإجراءات مطابقة للعملية الموضحة أعلاه. حقن روز البنغال دون تشغيل الليزر. بعد 20 دقيقة تحت التخدير، والسماح للحيوانات البقاء في غرفة الانتعاش لمدة 1 ساعة للتعافي، قبل أن تعاد إلى أقفاصها.
    2. تنفيذ جميع الإجراءات مطابقة للعملية المذكورة أعلاه، والتبديل على الليزر. لا تحقن روز بنغال. بعد 20 دقيقة من إضاءة الليزر، اسمح للحيوانات بالبقاء في غرفة التعافي لمدة ساعة واحدة للتعافي من التخدير، قبل إعادتها إلى أقفاصها.

5. بقع الليزر

  1. قم بتوصيل البطانية الساخنة للحفاظ على دفء منطقة العملية والحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس أثناء التخدير عند 37 درجة مئوية.
  2. ضع الماوس في غرفة التعريفي بمعدل تدفق isoflurane من 4٪ لتخديره حتى تتوقف الحركة العفوية للجسم وvibrissae ثم نقل الماوس إلى الإطار المجسم.
  3. ضع الماوس في وضع عرضة لأنفه في قناع التخدير. إصلاح الحيوان والحفاظ على تركيز isoflurane في 4٪ لمدة 1 دقيقة.
  4. أدخل مسبار المستقيم برفق لمراقبة درجة الحرارة طوال العمليات الجراحية. تعيين لوحة التدفئة ذات الصلة التي تسيطر عليها ردود الفعل للحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس في 37 درجة مئوية وتطبيق مرهم العين dexpanthenol لكلا العينين. تنظيف الجلد والفراء المحيطة بها مع عامل مطهر.
  5. إجراء شق طولي 2.0-2.5 سم والتراجع لفضح الجمجمة. إجراء التعرض للجمجمة بقطع واحد لتجنب مضاعفات الجرح.
  6. ضع الإطار sterotactic تحت بقع الليزر وضبط الارتفاع للحصول على صورة حادة. ركز كاميرا التصوير بالتصوير الرصاني بالليزر (LSI) على النافذة القحفية. تكوين نظام التصوير الليزري عالي الدقة (LSI) كما هو موضح سابقا15.
  7. احصل على بيانات من حقل رؤية بطول سم واحد × 1 سم باستخدام طول موجي يبلغ 785 نانومتر و80 ميجاوات ليزر بمعدل إطار يبلغ 21 صورة/ثانية على مسافة عمل 1 سم لمدة دقيقة واحدة.
  8. بعد التصوير، ضعي قطرتين من 0.9٪ ملحية على الجمجمة لإعادة ترطيب الجرح وخياطة الجرح ووضع الحيوان في غرفة الإنعاش عند 37 درجة مئوية للتعافي من التخدير لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة، أعد الفئران إلى أقفاصها في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها.

6. العصبية

ملاحظة: لتحليل العجز العصبي، يتم استخدام مقياس عصبي معدل نشرته إيكنشتاين وآخرون في عام 199715.

  1. تسجيل الحيوانات لعامة (الجدول 1) والعجز البؤري (الجدول 2). ويتراوح هذا المقياس المركب بين صفر (بدون عجز) و46 (انخفاضات شديدة).
  2. أداء العصبية في نفس الوقت كل يوم واستخدام الملابس الجراحية للحفاظ على رائحة محايدة.
  3. Habituate الفئران لمدة 30 دقيقة في الغرفة مع قفص مفتوح قبل الاختبار والسماح لهم لمراقبة كل بند لمدة 30 ق.

7. التخبط

  1. إعداد حقنة 20 مل تحتوي على PBS-الهيبارين (2 U/mL) ووضعها 1 متر فوق مقاعد البدلاء لتسهيل / ضمان الجاذبية يحركها التشوه.
  2. حقن intraperitoneally 100 ميكرولتر من الكيتامين وإكسيلازين (120/16 ملغ / كغ وزن الجسم، على التوالي). انتظر لمدة 5 دقائق، وتؤيد وقف حركة الجسم العفوية وvibrissae.
  3. إصلاح الحيوان في موقف سوبين وتطهير سطح الجسم البطن مع الإيثانول 100٪. إجراء شق 3 سم طويلة في البطن; قطع الحجاب الحاجز والأضلاع لتصور تماما القلب.
  4. إجراء شق صغير في الأذين الأيمن وإدراج قنية النتوئة في البطين الأيسر و perfuse مع 20 مل PBS-الهيبارين.
  5. بعد التشوه، وقطع رأس الحيوان وإزالة الدماغ، وتجميده باستخدام الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.

8. قياس حجم العقائد

  1. Cryosectioning: قطع الدماغ بشكل متسلسل على cryostat إلى 20 ميكرومتر أقسام سميكة كل 120 ميكرومتر وجبل على الشرائح. تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
  2. كريسيل البنفسجي (CV) تلطيخ
    1. لإعداد محلول التلطيخ، اخلط 0.5 غرام من خلات السيرة الذاتية في 500 مل من H2O. Stir والحرارة (60 درجة مئوية) حتى يتم إذابة البلورات. السماح للحل لتبرد وتخزينها في زجاجة داكنة. أعد تسخينه إلى 60 درجة مئوية وفلتر (فلتر الورق) قبل كل استخدام.
    2. جفف الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وضعها في الإيثانول 95٪ لمدة 15 دقيقة، تليها 70٪ الإيثانول لمدة دقيقة واحدة، وبعد ذلك في الإيثانول 50٪ لمدة دقيقة واحدة.
    3. ضع الشرائح في الماء المقطر لمدة دقيقتين، وأنعش الماء المقطر، وضع الشرائح في الماء مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة. ثم ضع الشرائح في محلول التلطيخ الذي تم تسخينه مسبقا لمدة 10 دقائق عند 60 درجة مئوية. غسل الشرائح مرتين في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
    4. ضع الشرائح في الإيثانول 95٪ لمدة 2 دقيقة. ثم وضعها في الإيثانول 100٪ لمدة 5 دقائق، وتحديث الإيثانول 100٪ ووضع الشرائح في الإيثانول 100٪ مرة أخرى لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك، قم بتغطية الشرائح باستخدام وسيطة متزايدة.
    5. تحليل: مسح الشرائح وتحليل حجم العقائد غير المباشرة من قبل طريقة سوانسون16 لتصحيح لذمة: المنطقة الإقفارية = (المنطقة الإقفارية)-((نصف الكرة الأرضية ipsilateral) - (نصف الكرة الأرضية)).

9. تلطيخ Tunel(في الموقع مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج)

  1. تجفيف الشرائح، بعد الإصلاح في 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني (ph 7.4) لمدة 10-20 دقيقة في RT. غسل في برنامج تلفزيوني، بعد الإصلاح في الإيثانول المبردة مسبقا: حمض الخليك 2:1 لمدة 5 دقائق في -20 درجة مئوية.
  2. غسل في برنامج تلفزيوني وتطبيق العازلة التوازن (10 ق إلى حد أقصى قدره 60 دقيقة في RT) وتطبيق قوة العمل انزيم TDT (1 ساعة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة)
  3. تطبيق قوة العمل وقف / غسل إنزيم (10 دقيقة في RT)، وغسل في برنامج تلفزيوني وتطبيق دافئ (RT) قوة العمل المضادة للديجوكسيجينين المترافق (30 دقيقة في RT في الظلام)
  4. اغسل في PBS، واحتضن DAPI لمدة 5 دقائق في RT وقم بتركيب الشرائح باستخدام وسائط الفلوروماونت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النموذج الموصوف هنا هو نموذج السكتة الدماغية الضوئية عن طريق حقن روز البنغال وإضاءة الجمجمة سليمة لمدة 20 دقيقة، في الطول الموجي ثابت 561 نانومتر و 25 كيلوواط قوة الانتاج في الألياف. على الرغم من أن الجراحة الفوتوثروبومبوتيك الكاملة تستمر 30 دقيقة ، إلا أن الحيوان يبقى تحت تخدير منخفض وتلف الدماغ معتدل. بعد حوالي 10 دقائق من نقلها إلى أقفاصها، كانت جميع الحيوانات مستيقظة، تتحرك بحرية في القفص، وتتفاعل مع زملاء القمامة.

تم إجراء قياس حجم العقش باستخدام كريميل البنفسجي الملون أقسام الدماغ التاجي المسلسل 24 ح بعد تحريض السكتة الدماغية(الشكل 2A). وكان متوسط حجم احتشاء 29.3 ملم3, تمثل 23٪ من نصف الكرة الدماغي واحد. وعلاوة على ذلك، فإن التباين في هذا النموذج السكتة الدماغية منخفضة بشكل استثنائي مع انحراف معياري من حوالي 3.5٪(الشكل 2B). منطقة الآفة تشمل القشرة الحركية دون المودة من الهياكل تحت القشرية.

تسبب Photothrombosis معتدلة, ضعف الحسية على المدى الطويل, المشار إليها من قبل Neuroscore مركب17 (الشكل 3); تم قياس العجز العام والتنسيقي بعد 24 ساعة و 3 أيام و 7 أيام بعد الجراحة. يحتوي Neuroscore العام على خمسة بنود ، بما في ذلك تقييم الفراء والأذنين والعينين والموقف والنشاط العفوي ، بحد أقصى 18 درجة(الجدول 1). وعصبية محورية تضم سبعة بنود ، بما في ذلك تقييم التماثل الجسم ، مشية ، التسلق ، وتدور السلوك ، التماثل الأمامي ، وركوب الدراجات الإلزامية ، واستجابة شعيرات ، مع درجة قصوى من 28 (الجدول 2). كان لحيوانات السكتة الدماغية تغيير كبير في النتيجة العصبية المركبة بعد الجراحة ب 24 ساعة مقارنة بالحيوانات التي تديرها الشام. استمرت هذه الاختلافات، على الرغم من الفئران السكتة الدماغية تحسنت مع مرور الوقت (الشكل 3).

نادرا ما يحدث الوفيات خلال وقت المراقبة في 1-2٪ من الحيوانات. في هذا التقرير، لم يكن من المطلوب استبعاد أي من الحيوانات العشرة التي تمت دراستها، وقد نجت جميعها من فترة المراقبة التي استمرت 7 أيام. تم رصد وزن الجسم والتغيرات في درجة الحرارة في الفئران في 24 ساعة، 3 أيام، و 7 أيام بعد الجراحة (الشكل 4A،B). وأظهرت البيانات أن وزن الجسم ودرجة الحرارة انخفضا 24 ساعة بعد الجراحة فقط في مجموعة روز البنغال + الإضاءة، لكنهما تعافيا إلى مستوى الحيوانات التي تعمل بالشام في 3 أيام بعد الجراحة.

لتأكيد تحريض التغيرات الإقفارية ، بعد 24 ساعة من الجراحة ، خضعت الحيوانات لاختبار التصوير بالليزر. قام تصوير تباين بقع الليزر بقياس تغلغل الدم في القشرة لمدة دقيقة واحدة وتم الحصول على صورة مرمزة بالألوان لكل. وهذا يدل على أن روز البنغال أو إضاءة الليزر وحدها لا تنتج آفة، في حين أن التطبيق المتزامن لروز البنغال والإضاءة بالليزر يولد منطقة مستديرة hypoperfused من قطر 4 ملم محاطة منطقة oligemic ضيقة (الشكل 5A). وبالإضافة إلى ذلك، فإن البنفسجي كريسيل وتلطيخ Tunel لتقييم حجم احتشاء 24 ساعة بعد الجراحة كشفت أي تلف الأنسجة سواء في روز البنغال أو جراحات الإضاءة بالليزر. من ناحية أخرى ، ولدت روز البنغال + إضاءة الليزر آفة ترسيمها جيدا(الشكل 5B).

الجدول 1: الدرجة العصبية العامة. لكل من العجز العام الخمسة التي تم قياسها، يمكن أن تتلقى الحيوانات ما بين 0 و 4 نقاط اعتمادا على شدة. ثم يتم تلخيص الدرجات في المناطق الخمس لتوفير مجموع نقاط عامة تتراوح بين 0-18. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: البؤري العصبي. لكل من العجز العام السبعة التي تم قياسها، يمكن أن تتلقى الحيوانات ما بين 0 و 4 نقاط اعتمادا على شدة. ثم يتم تلخيص الدرجات في المناطق الخمس لتوفير مجموع نقاط عامة تتراوح بين 0-28. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Figure 1
الشكل 1: فوتوثيرومبوسيس (PT). رسم تخطيطي يصور المنطقة الضوئية، على بعد 3 ملم من بريغما. تشير النقطة الخضراء إلى موضع الليزر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليل احتشاء الحجمي والنتيجة العقائدية 24 ح بعد PT. (أ) ممثل كريسيل البنفسجي الملون الدماغ التاجي, أقسام كل 120 ميكرومتر في 24 ح بعد PT. خطوط متقطعة ترسيم منطقة الآفة. (ب) تحليل حجم احتشاء 10 أدمغة (كل نقطة تمثل دماغ واحد فردي) 24 ساعة بعد PT. يمثل الخط الأحمر الأفقي الوسط (29.32 مم3)،وتشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (3.45 مم3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: العصبية للعجز الوظيفي بعد PT. مركب العصبية قبل, 24 ح, 3 أيام, و 7 أيام بعد PT. BL = قبل PT, RB = روز البنغال. n = 5 لكل مجموعة. *p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: وزن الجسم وتحليل درجة الحرارة بعد PT. (أ) وزن الجسم و (ب) تم تخفيض درجة الحرارة قليلا في الحيوانات PT مقارنة مع المجموعات التي تديرها الشام في 24 ساعة وتعافى 3 أيام بعد PT. BL = قبل PT, RB = روز البنغال. n = 5 لكل مجموعة.*p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تأكيد الآفة بعد PT. (أ)الليزر سبيكلي التصوير(ب)كريسيل البنفسجي (الألواح العليا) وتلطيخ Tunel (الألواح السفلية) وأكد الآفة إلا بعد إدارة روز البنغال والإضاءة الليزر اللاحقة. RB = روز البنغال. شريط المقياس = 1000 ميكرومتر في اللوحة العلوية B، شريط المقياس = 20 ميكرومتر في اللوحة السفلى B. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف البروتوكول المقدم نموذج السكتة الدماغية التجريبي لداء الخلايا الضوئية من خلال إضاءة الجمجمة السليمة بالليزر 561 نانومتر ، مع حقنة سابقة داخل الصفاق من روز البنغال. وحتى وقت قريب، كان استخدام هذا النموذج منخفضا ولكنه آخذ في الازدياد باطراد.

الوفيات أثناء تحريض السكتة الدماغية في هذا النموذج غائبة. الوفيات الإجمالية أقل من 5٪ تنشأ أثناء العملية بسبب مضاعفات التخدير أو التضحية بعد استيفاء معايير الاستبعاد. 1- لتبرير التباين المنخفض لهذا النموذج وقابليته للاستنساخ، يقترح معايير الاستبعاد التالية: 1) وقت التشغيل أطول من 30 دقيقة؛ (2) مدة أطول من 30 دقيقة؛ (2) مدة أطول من 30 دقيقة؛ (2) مدة أطول من 30 دقيقة؛ (2) مدة أطول من 30 دقيقة؛ (2) فترة أطول من 30 دقيقة؛ (2) مدة 2) عدوى خياطة؛ 3) لدغة الجرح؛ و 4) لا يوجد عدم تماثل في التماثل في 24 ساعة بعد PT.

نماذج السكتة الدماغية التجريبية المستخدمة على نطاق واسع هو انسداد عابر من MCA، وذلك باستخدام خيوط خياطة، والتي يتم إدخالها في الشريان السباتي الداخلي حتى طرف المغلفة السيليكون يحجب أصل MCA. هذا النموذج يسمح للرواية عن طريق إزالة خيوط ويحاكي السيناريو السريري البشري، الذي هناك استعادة تدفق الدم الدماغي بعد تحلل عفوية أو علاجية (RTPA) من جلطة انصمام18،19. ومع ذلك ، فإنه ينطوي على عملية جراحية معقدة مع تباين كبير في العقش النهائي وارتفاع معدل الوفيات10. في المقابل ، يمكن تحقيق الانسداد الدائم لفصيل MCA من الشرايين العدسية عن طريق تخثر الشريان20،21، مما يحفز الآفات المحددة محليا في القشرة الجديدة22. على الرغم من أن هذا النموذج لديه معدل وفيات أقل، فإنه يتطلب جراحة الغازية للحيوان عن طريق تريب الجمجمة على MCA لتخثر في وقت لاحق23. وبالتالي، هناك حاجة إلى مهارات جراحية عالية لدراسة السكتة الدماغية الحية الناجحة وغير المتحيزة.

بالمقارنة مع نماذج نقص التروية الأخرى في الدماغ ، فإن النموذج الضوئي كما هو الحال في هذا الفيديو لديه ميزة عدم استئصال القحف أو الجراحة الكبرى على الحيوان ، على عكس النماذج الأخرى التي تنطوي على عمليات جراحية معقدة أو استئصال القحف الدماغي. وعلاوة على ذلك، فإن التنفيذ البسيط للنموذج يجعل الجراحة في متناول الكثيرين الذين يعانون من انخفاض وقت التدريب. انخفاض معدل الوفيات، وحجم العقائد المعتدل، والمرونة للحث على الآفة إلى منطقة معينة في الدماغ، والتأكيد على ميزة هذا النموذج التجريبي لتجديد الدماغ ودراسات السكتة الدماغية24،25،26،27.

على الرغم من المزايا الواضحة، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار بعض القيود على هذا النموذج السكتة الدماغية. قد يكون التعرض الطويل للالتخدير للحيوان عاملا حاسما يجب مراعاته ، حيث أن تأثير التخدير على الحماية العصبية ونتائج السكتة الدماغية معروف بالفعل28. على الرغم من أن مدة هذا الإجراء الجراحي تستغرق حوالي 30 دقيقة ، يمكن أن يكون الحيوان تحت تركيزات مخدرة منخفضة بسبب الحد الأدنى من التلاعب بالحيوان خلال 20 دقيقة من إضاءة الليزر. لأن هذا النموذج يؤدي إلى إصابات الدماغ المعتدلة، فقط العجز السلوكي الطفيفة يمكن الكشف عنها. وهكذا، فإن أنظمة الاختبار الأكثر تقدما مع حساسية أعلى ومعلمات الاختبار النوعي، مثل الوصول المهرة اختبار29 و Neuroscore17، كما هو موضح هنا، ربما أكثر ملاءمة للكشف عن النتائج الوظيفية على المدى الطويل في هذا النموذج. وأخيرا ، بسبب التجميع الدائم للصفائح الدموية في الأوعية الدموية المضيئة ، لا يمكن الحصول على أي إعادة التروية ، وهي ميزة لوحظت في نسبة كبيرة من مرضى السكتة الدماغية بسبب تحلل الجلطة العفوية أو العلاج30.

تم نشر نموذج السكتة الدماغية الضوئية مماثلة في عام 2013 من قبل Labat-gest وتوماسي، واصفا بروتوكول PT باستخدام مصباح الضوء البارد بدلا من ليزر أخضر 561 نانومتر8. يمكن استخدام مصادر الليزر والضوء البارد للحث على إثارة روز البنغال. ميزة مصادر الضوء القائمة على الليزر على مصابيح الضوء البارد هو أنه يمكن استخدام أشعة الليزر لاستهداف الشرايين السطحية الفردية لتخثر في الجسم الحي السفينة محددة31. على الرغم من أننا لم نكن استهداف الشرايين محددة، استخدمنا ليزر أخضر 561 نانومتر لإضاءة الدماغ والتعريف الضوئي، وذلك بسبب ذروة absortion روز البنغال في 562 نانومتر. لضمان كثافة الليزر المناسبة أثناء الإضاءة، تم استخدام برنامج مراقبة كوبولت-6.1.0.0 لمعايرة الليزر. وعلاوة على ذلك، في هذه الدراسة جرعة روز البنغال من 10 ميكرولتر / غرام (100 ميكروغرام / غرام) كانت كافية للحث على الفوتوترومبوسيس، في حين أن البروتوكول السابق أبلغ عن جرعة أعلى (150 ميكروغرام / غرام)8. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر البروتوكول طريقة سلوكية لتحليل نتيجة السكتة الدماغية (Neuroscore) ومجموعة إضافية للتحكم الصوري (إضاءة الليزر) من أجل إثبات أن الليزر نفسه لا ينتج أي تلف في الأنسجة ، لذلك فإن الجمع بين روز البنغال + إضاءة الليزر فقط يحفز آفة الدماغ.

بشكل عام ، يتيح هذا الإجراء الجراحي المباشر غير الغازي إمكانية الاستنساخ العالية واتجاه آفة السكتة الدماغية إلى الدماغ إلى جانب إمكانية الملاحظة على المدى الطويل بسبب الحد الأدنى من الوفيات. يتميز نموذج السكتة الدماغية الضوئية هذا كنموذج تجريبي قيم لأبحاث السكتة الدماغية الأساسية والترجمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا توجد مصالح متنافسة بين أصحاب البلاغ للكشف عنها.

Acknowledgments

نشكر جميع شركائنا في التعاون في اتحادات ضربة المناعة (FOR 2879 ، من الخلايا المناعية إلى استرداد السكتة الدماغية) على الاقتراحات والمناقشات. تم تمويل هذا العمل من قبل دويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية) في إطار استراتيجية التميز الألمانية في إطار مجموعة ميونيخ لطب الأعصاب النظم (EXC 2145 SyNergy - الهوية 390857198) وبموجب المنح LI-2534/6-1، LI-2534/7-1 و LL-112/1-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
561 nm wavelenght laser Solna Cobolt HS-03
Acetic Acid Sigma Life Science 695092
Anesthesia system for isoflurane Drager
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100
Bepanthen pomade Bayer 1578681
C57Bl/6J mice Charles River 000664
Collimeter Thorlabs F240APC-A
Cotons NOBA Verbondmitel Danz 974116
Cresyl violet Sigma Life Science C5042-10G
Cryostat Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70% CLN Chemikalien Laborbedorf 521005
Ethanol 96% CLN Chemikalien Laborbedorf 522078
Ethanol 99% CLN Chemikalien Laborbedorf ETO-5000-99-1
Filter paper Macherey-Nagel 432018
Fine Scissors FST 15000-00
Forceps FST 11616-15
Heating blanket FHC DC Temperature Controller  40-90-8D
Isoflurane Abbot B506
Isopentane Fluka 59070
Ketamine Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Speckle Perimed PeriCam PSI HR
Mayor Scissors FST 1410-15
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 Apotheke Innestadt Uni Munchen P32799
Protective glasses Laser 2000 NIR-ZS2-38
Rose Bengal Sigma Aldrich 198250-5G
Roti-Histokit mounting medium Roth 6638.1
Saline solution Braun 131321
Stereomikroskop Zeiss Stemi DV4
Stereotactic frame Stoelting 51500U
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Xylacine Albrecht

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
  2. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
  3. Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
  4. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
  5. Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).
  6. Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
  7. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
  8. Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
  9. McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
  10. Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
  11. Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
  12. Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
  13. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
  14. Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
  15. Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
  16. Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
  17. Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
  18. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  19. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
  20. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
  21. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
  22. Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
  23. Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
  24. Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
  25. Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
  26. Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
  27. Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
  28. Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
  29. Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
  30. Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
  31. Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).

Tags

علم الأعصاب، العدد 171، السكتة الدماغية، نقص التروية في الدماغ، نموذج الحيوان، photothrombotic، دائم، روز البنغال، إضاءة الليزر
النمذجة السكتة الدماغية في الفئران: الآفات القشرية البؤرية عن طريق Photothrombosis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Llovera, G., Pinkham, K., Liesz, A.… More

Llovera, G., Pinkham, K., Liesz, A. Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis. J. Vis. Exp. (171), e62536, doi:10.3791/62536 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter