Summary
Hier beschreven is het fototrombotische beroertemodel, waarbij een beroerte wordt geproduceerd door de intacte schedel door permanente microvasculaire occlusie op te wekken met behulp van laserverlichting na toediening van een lichtgevoelige kleurstof.
Abstract
Beroerte is een belangrijke doodsoorzaak en verworven volwassen invaliditeit in ontwikkelde landen. Ondanks uitgebreid onderzoek naar nieuwe therapeutische strategieën, blijven er beperkte therapeutische opties voor beroertepatiënten. Daarom is meer onderzoek nodig voor pathofysiologische trajecten zoals post-beroerte ontsteking, angiogenese, neuronale plasticiteit en regeneratie. Gezien het onvermogen van in vitro modellen om de complexiteit van de hersenen te reproduceren, zijn experimentele beroertemodellen essentieel voor de analyse en daaropvolgende evaluatie van nieuwe medicijndoelen voor deze mechanismen. Bovendien zijn gedetailleerde gestandaardiseerde modellen voor alle procedures dringend nodig om de zogenaamde replicatiecrisis te overwinnen. Als een inspanning binnen het immunostroke onderzoeksconsortium wordt een gestandaardiseerd fototrombotisch muismodel beschreven met behulp van een intraperitoneale injectie van Rose Bengal en de verlichting van de intacte schedel met een 561 nm-laser. Dit model maakt de prestaties van beroerte bij muizen mogelijk met toewijzing aan elk corticale gebied van de hersenen zonder invasieve chirurgie; dus, waardoor de studie van beroerte in verschillende gebieden van de hersenen mogelijk is. In deze video worden de chirurgische methoden van beroerte-inductie in het fototrombotische model samen met histologische analyse gedemonstreerd.
Introduction
Ischemische beroerte blijft een belangrijkste doodsoorzaak en verworven volwassen invaliditeit in ontwikkelde landen in de 21e eeuw goed voor ongeveer 2,7 miljoen sterfgevallen in 2017 wereldwijd1. Zelfs met de enorme inspanningen van de wetenschappelijke gemeenschap zijn er weinig behandelingen beschikbaar. Bovendien zijn deze reeds beperkte opties met zulke hoge uitsluitingscriteria niet toegankelijk voor veel patiënten, wat resulteert in een dringende behoefte aan nieuwe behandelingen om het functionele herstel na een beroerte te verbeteren.
Gezien de onbekwaamheid van in vitro modellen om de complexe interacties van de hersenen te repliceren, zijn diermodellen essentieel voor preklinisch beroerteonderzoek. Muizen zijn het meest gebruikte diermodel op het gebied van beroerteonderzoek. De meeste van deze muismodellen zijn gericht op het induceren van infarcten door het blokkeren van de bloedstroom in de middelste cerebrale slagader (MCA), omdat de meerderheid van de menselijke beroerte laesies zich in het MCA-gebiedbevinden 2. Hoewel deze modellen de laesies van menselijke beroertes beter samenvatten, omvatten ze geconvuleerde operaties met een hoge variabiliteit van het infarctvolume.
Sinds Rosenblum en El-Sabban's voorstel van het fototrombotische model in 19773, en later de toepassing van dit model op ratten Watson et al.4, is het op grote schaal gebruikt in ischemisch beroerteonderzoek5,6. Het fototrombotische beroertemodel induceert een lokaal en gedefinieerd corticale infarct als gevolg van de fotoactivatie van een lichtgevoelige kleurstof die eerder in de bloedstroom werd geïnjecteerd. Dit veroorzaakt lokale trombose van de vaten in de gebieden die aan licht worden blootgesteld. Kortom, bij blootstelling aan licht van de geïnjecteerde lichtgevoelige kleurstof wordt gelokaliseerd oxidatief letsel van het endotheelcelmembraan geïnduceerd, wat leidt tot trombocytenaggregatie en trombusvorming, gevolgd door lokale verstoring van de cerebrale bloedstroom7.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ligt in de eenvoud van uitvoering en de mogelijkheid om de laesie naar het gewenste gebied te leiden. In tegenstelling tot andere experimentele beroertemodellen is kleine chirurgische expertise nodig om het fototrombotische beroertemodel uit te voeren, omdat de laesie wordt geïnduceerd door verlichting van de intacte schedel. Bovendien kunnen de goed afgebakende grenzen ( figuur 2A en figuur 5B) en de flexibiliteit om de laesie naar een specifiek hersengebied te induceren, de studie van cellulaire reacties binnen het ischemische of intacte corticale gebiedvergemakkelijken 8. Om deze redenen is deze aanpak geschikt voor de studie van cellulaire en moleculaire mechanismen van corticale plasticiteit.
In de afgelopen decennia is de groeiende bezorgdheid over het gebrek aan reproduceerbaarheid tussen onderzoeksgroepen bedacht als de zogenaamde replicatiecrisis9. Na de coördinatie van de eerste preklinische gerandomiseerde gecontroleerde multicenter studie in 201510, een voorgesteld instrument om preklinisch onderzoek11,12,13te verbeteren , werd bevestigd dat een van de oorzaken van falende reproduceerbaarheid tussen preklinische studies van onafhankelijke laboratoria het ontbreken van voldoende standaardisatie van experimentele beroertemodellen en uitkomstparameters14was . Toen het ImmunoStroke-consortium werd opgericht (https://immunostroke.de/), een samenwerking die tot doel heeft hersen-immuuninteracties te begrijpen die ten grondslag liggen aan de mechanistische principes van beroerteherstel, was de standaardisatie van alle experimentele beroertemodellen tussen elke onderzoeksgroep essentieel.
Hier wordt de gestandaardiseerde procedure beschreven voor de inductie van het fototrombotische model zoals gebruikt in het bovengenoemde onderzoeksconsortium. Kortom, een dier onderging verdoving, kreeg intraperitonaal een Rose Bengal injectie (10 μL/g) en de intacte schedel, 3 mm links van bregma, werd onmiddellijk verlicht door een 561 nm laser gedurende 20 min (Figuur 1). Bovendien wordt een gerelateerde histologische en gedragsmatige methode gerapporteerd om het resultaat van de beroerte in dit model te analyseren. Alle methoden zijn gebaseerd op standaard operationele procedures die in het laboratorium zijn ontwikkeld en gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten die in deze video worden gerapporteerd, werden uitgevoerd volgens de nationale richtlijnen voor het gebruik van proefdieren en de protocollen werden goedgekeurd door de Duitse regeringscommissies (Regierung von Oberbayern, München, Duitsland). De muizen die in deze studie werden gebruikt, waren mannelijke C57Bl/6J muizen, 10-12 weken oud, en verzonden door Charles River Germany. De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde temperaturen (22 °C ± 2 °C), met een licht-donkere cyclusperiode van 12 uur en toegang tot geplet voedsel en water ad libitum.
1. Voorbereiding van het materiaal en de instrumenten
- Los Rose Bengal op in 0,9% zoutoplossing om een uiteindelijke concentratie van 10 mg/ml te bereiken. Sluit de warmtedeken aan om het operatiegebied warm te houden en de lichaamstemperatuur van de muis tijdens anesthesie op 37 °C te houden.
- Bereid scharen, tangen, stukjes katoen, dexpanthenol oogzalf en hechtmateriaal voor. Bereid een spuit met zoutoplossing (zonder naald) om het operatiegebied gehydrateerd te houden. Bereid het anesthesiegas voor (100% O2 + isofluraan).
2. Bereiding van het dier
- Injecteer analgesie 30 min voor de operatie (4 mg/kg Carprofen en 0,1 mg/kg Buprenorfine).
- Noteer het lichaamsgewicht van de muis om de dosis roos bengalen aan te passen die moet worden geïnjecteerd (10 μL/g, d.w.z. 100 μg/g).
- Plaats de muis in de inductiekamer met een isofluraandebiet van 4% om hem te verdoven totdat de spontane beweging van het lichaam en vibrissae stopt.
- Breng de muis over in het stereotactische frame en plaats deze in een gevoelige positie met zijn neus in het anesthesiemasker. Bevestig het dier en handhaaf de isofluraanconcentratie gedurende 1 min op 4%. Verminder en handhaaf vervolgens de isofluraanconcentratie op 2%.
- Plaats de rectale sonde voorzichtig om de temperatuur tijdens de chirurgische ingrepen te controleren. Stel het bijbehorende feedbackgestuurde verwarmingskussen in om de lichaamstemperatuur van de muis op 37 °C te houden.
- Breng dexpanthenol oogzalf aan op beide ogen en reinig de huid en de omliggende vacht met een ontsmettingsmiddel.
3. Fototrombosemodel
- Maak een longitudinale incisie van 2,0-2,5 cm en trek je terug om de schedel bloot te leggen. Voer de schedelblootstelling uit met een enkele snede om wondcomplicaties te voorkomen.
- Verwijder het periosteum voorzichtig met katoen en identificeer de coronale hechtingen.
- Zet de veiligheidsbril op, schakel de 561 nm laser in en markeer de bregma +3 mm links.
- Schakel de laser uit, bevestig een sticker met een gat met een diameter van 4 mm geplaatst op de hierboven genoemde gemarkeerde coördinaten.
- Injecteer de muis met Bengaalse roos (10 μL/g), intraperitonaal. Plaats de laserstraal op 4-5 cm van de schedel, schakel de 561 nm laser in en verlicht de schedel gedurende 20 minuten.
- Breng twee druppels van 0,9% zoutoplossing aan op de schedel om te rehydrateren, hecht de wond en plaats het dier in een herstelkamer op 37 °C om te herstellen van anesthesie. Breng de muizen na 1 uur terug naar hun kooien in een temperatuurgecontroleerde kamer.
- Injecteer analgesie om de 12 uur gedurende 3 dagen na de operatie (4 mg/kg Carprofen en 0,1 mg/kg Buprenorfine).
4. Schijnoperatie
- Voer twee verschillende procedures uit voor schijnoperaties zoals beschreven in de stappen 4.1.1 en 4.1.2.
- Voer alle procedures identiek uit als de hierboven beschreven bewerking. Injecteer Rose Bengal zonder de laser in te schakelen. Laat de dieren na 20 minuten onder narcose 1 uur in de herstelkamer blijven om te herstellen, voordat ze worden teruggebracht naar hun kooien.
- Voer alle procedures identiek uit als de hierboven beschreven bewerking en schakel de laser in. Injecteer Rose Bengal niet. Na 20 minuten laserverlichting, laat de dieren 1 uur in de herstelkamer blijven om te herstellen van anesthesie, voordat ze worden teruggebracht naar hun kooien.
5. Laser spikkel
- Sluit de verwarmde deken aan om het operatiegebied warm te houden en de lichaamstemperatuur van de muis tijdens anesthesie op 37 °C te houden.
- Plaats de muis in de inductiekamer met een isofluraandebiet van 4% om deze te verdoven totdat de spontane beweging van het lichaam en vibrissae stopt en breng de muis vervolgens over in het stereotactische frame.
- Plaats de muis in een gevoelige positie met zijn neus in het anesthesiemasker. Fixeer het dier en handhaaf de isofluraanconcentratie op 4% gedurende 1 min. T kip verminderen en handhaven op 2%.
- Plaats de rectale sonde voorzichtig om de temperatuur tijdens de chirurgische ingrepen te controleren. Stel het bijbehorende feedbackgestuurde verwarmingskussen in om de lichaamstemperatuur van de muis op 37 °C te houden en breng dexpanthenol oogzalf aan op beide ogen. Reinig de huid en de omliggende vacht met een ontsmettingsmiddel.
- Maak een longitudinale incisie van 2,0-2,5 cm en trek je terug om de schedel bloot te leggen. Voer de schedelblootstelling uit met een enkele snede om wondcomplicaties te voorkomen.
- Plaats het sterotactische frame onder de laservlek en pas de hoogte aan om een scherp beeld te krijgen. Richt de LSI-camera (Laser Speckle Perfusion Imaging) op het schedelvenster. Configureer het LSI-camerasysteem (High Resolution Laser Speckle Imaging) zoals eerder beschreven15.
- Verkrijg gegevens uit een gezichtsveld van 1 cm x 1 cm met behulp van een golflengte van 785 nm en lasers van 80 mW met een framesnelheid van 21 beelden/s op een werkafstand van 1 cm gedurende 1 min.
- Breng na beeldvorming twee druppels van 0,9% zoutoplossing aan op de schedel om te rehydrateren, hecht de wond en plaats het dier in een herstelkamer bij 37 °C om gedurende 1 uur te herstellen van anesthesie. Breng de muizen na 1 uur terug naar hun kooien in een temperatuurgecontroleerde kamer.
6. Neuroscore
OPMERKING: Voor de neurologische tekortanalyse wordt een gewijzigde neurologische schaal gebruikt die in 1997 door Eckenstein et al. is gepubliceerd15.
- Score van de dieren voor algemene (tabel 1) en focale tekorten (tabel 2). Deze samengestelde schaal varieert van 0 (geen tekorten) tot 46 (ernstige bijzondere waardeverminderingen).
- Voer de neuroscore elke dag op hetzelfde tijdstip uit en gebruik chirurgische kleding om een neutrale geur te behouden.
- Bewoon de muizen gedurende 30 minuten in de kamer met een open kooi voorafgaand aan de test en laat ze elk item gedurende 30 s observeren.
7. Perfusie
- Bereid een spuit van 20 ml met PBS-heparine (2 U/ml) voor en plaats deze 1 m boven de bank om de door de zwaartekracht aangedreven perfusie te vergemakkelijken/garanderen.
- Injecteer intraperitoneaal 100 μL ketamine en xylazine (respectievelijk 120/16 mg/kg lichaamsgewicht). Wacht 5 minuten en bevestig het stoppen van spontane lichaamsbeweging en vibrissae.
- Bevestig het dier in een liggende positie en desinfecteer het buiklichaam met 100% ethanol. Maak een 3 cm lange incisie in de buik; snijd het middenrif en de ribben door om het hart volledig te visualiseren.
- Maak een kleine incisie in het rechter atrium en steek de perfusie canule in de linkerventrikel en perfuseer met 20 ml PBS-heparine.
- Na perfusie onthoofdt u het dier en verwijdert u de hersenen, vriest u het in met droog ijs en bewaart u het bij -80 °C tot verder gebruik.
8. Infarct volumetry
- Cryosectioning: Snijd de hersenen serieel op een cryostaat tot 20 μm dikke secties om de 120 μm en monteer op dia's. Bewaar de dia's bij -80 °C tot verdere verwerking.
- Cresyl violet (CV) kleuring
- Om de kleuroplossing te bereiden, mengt u 0,5 g CV-acetaat in 500 ml H2O. Roer en verwarm (60 °C) totdat de kristallen zijn opgelost. Laat de oplossing afkoelen en bewaar deze in een donkere fles. Verwarm voor elk gebruik opnieuw op 60 °C en filter (papierfilter).
- Droog de dia's 30 minuten op kamertemperatuur. Plaats ze 15 minuten in 95% ethanol, gevolgd door 70% ethanol gedurende 1 min en daarna in 50% ethanol gedurende 1 min.
- Plaats de dia's 2 minuten in gedestilleerd water, ververs het gedestilleerde water en plaats de glijbanen 1 minuut in water. Plaats vervolgens de dia's in de voorverwarmde kleuroplossing gedurende 10 minuten bij 60 °C. Was de dia's twee keer in gedestilleerd water gedurende 1 minuut.
- Plaats de dia's 2 min in 95% ethanol. Plaats ze vervolgens 5 minuten in 100% ethanol, ververs de 100% ethanol en plaats de dia's weer 2 minuten in 100% ethanol. Bedek daarna de dia's met een montagemedium.
- Analyse: Scan de dia's en analyseer het indirecte infarctvolume met de Swanson-methode16 om te corrigeren voor oedeem: Ischemisch gebied = (ischemisch gebied)-((ipsilaterale hemisfeer) - (contralaterale hemisfeer)).
9. Tunel kleuring(in situ apoptosis detectie kit)
- Droog de dia's, nafix in 4% paraformaldehyde in PBS (ph 7.4) gedurende 10-20 min bij RT. Wassen in PBS, na-fix in voorgekoelde ethanol: azijnzuur 2:1 gedurende 5 min bij -20 °C.
- Wassen in PBS en equilibratiebuffer aanbrengen (10 s tot maximaal 60 min bij RT) en werksterkte TdT-enzym aanbrengen (1 uur bij 37 °C in bevochtigde kamer)
- Werksterkte stop/was enzym aanbrengen (10 min bij RT), wassen in PBS en verwarmde (RT) werksterkte anti-digoxigenine conjugaat aanbrengen (30 min bij RT in het donker)
- Was in PBS, incubeer 5 minuten met DAPI bij RT en monteer de dia's met fluoromount media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven model is een fototrombotisch beroertemodel van Rose Bengalen injectie en intacte schedelverlichting gedurende 20 minuten, bij een constante golflengte van 561 nm en een uitgangsvermogen van 25 mW bij de vezel. Hoewel de volledige fototrombotische operatie 30 minuten duurt, wordt het dier onder lage anesthesie gehouden en is de hersenbeschadiging matig. Ongeveer 10 minuten na overdracht naar hun kooien waren alle dieren wakker, vrij bewegend in de kooi en interactie met nestgenoten.
Infarct volumetry werd uitgevoerd met behulp van cresyl violet gekleurd seriële coronale hersensecties 24 uur na beroerte inductie (Figuur 2A). Het gemiddelde infarctvolume was 29,3 mm3, wat 23% van één hersenhelft vertegenwoordigt. Bovendien is de variabiliteit van dit lijnmodel uitzonderlijk laag met een standaardafwijking van ongeveer 3,5% (figuur 2B). Het laesiegebied omvat de motorische cortex zonder de genegenheid van subcorticale structuren.
Fototrombose veroorzaakte een matige, langdurige sensorimotorische stoornis, aangegeven door de samengestelde Neuroscore17 (Figuur 3); algemene en focale tekorten werden gemeten 24 uur, 3 dagen en 7 dagen na de operatie. De algemene Neuroscore bestaat uit vijf items, waaronder de evaluatie van de vacht, oren, ogen, houding en spontane activiteit, met een maximale score van 18 (tabel 1). De focale Neuroscore bestaat uit zeven items, waaronder de evaluatie van lichaamssymmetrie, gang, klimmen, cirkelgedrag, voorpotensymmetrie, verplichte fiets- en snorharenrespons, met een maximale score van 28 (tabel 2). Beroertedieren hadden een significante verandering in de samengestelde neuroscore 24 uur na de operatie in vergelijking met door Sham geopereerde dieren. Deze verschillen bleven bestaan, hoewel beroertemuizen in de loop van de tijd verbeterden (Figuur 3).
Sterfte tijdens de observatietijd komt zelden voor bij 1-2% van de dieren. In dit verslag hoefde geen van de 10 onderzochte dieren te worden uitgesloten en overleefden ze allemaal de observatieperiode van 7 dagen. Het lichaamsgewicht en de temperatuurveranderingen bij de muizen werden gecontroleerd om 24 uur, 3 dagen en 7 dagen na de operatie (figuur 4A,B). Gegevens toonden aan dat het lichaamsgewicht en de temperatuur 24 uur na de operatie alleen in de Rose Bengal + verlichtingsgroep werden verlaagd, maar herstelden tot het niveau van de door Sham geopereerde dieren in 3 dagen na de operatie.
Om een inductie van ischemische veranderingen te bevestigen, ondergingen de dieren 24 uur na de operatie een laserbeeldtest. Een laser spikkelcontrastbeeldvorming mat bloedperfusie van de cortex voor een duur van 1 min en een gemiddeld kleurgecodeerd beeld werd verkregen voor elk dier. Dit toont aan dat Rose Bengal of laserverlichting alleen geen laesie produceert, terwijl gelijktijdige toepassing van Rose Bengal en laserverlichting een rond hypoperfused gebied met een diameter van 4 mm genereert, omgeven door een smalle oligemische zone (figuur 5A). Bovendien, een cresyl violet en Tunel kleuring voor de beoordeling van het infarct volume 24 uur na de operatie bleek geen weefselschade, noch in Rose Bengal of laser verlichting operaties. Aan de andere kant genereerde Rose Bengal + laserverlichting een goed afgebakende laesie (figuur 5B).
Tabel 1: Algemene Neuroscore. Voor elk van de vijf gemeten algemene tekorten kunnen dieren afhankelijk van de ernst tussen de 0 en 4 punten krijgen. De scores op de vijf gebieden worden vervolgens opgeteld om een totale algemene score te bieden, variërend van 0-18. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Focal Neuroscore. Voor elk van de zeven gemeten algemene tekorten kunnen dieren afhankelijk van de ernst tussen de 0 en 4 punten krijgen. De scores op de vijf gebieden worden vervolgens opgeteld om een totale algemene score te bieden, variërend van 0-28. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Figuur 1: Fototrombose (PT). Diagram met het fototrombotische gebied, 3 mm van Bregma. De groene stip geeft de positie van de laser aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Volumetrische infarctanalyse en infarctuitkomst 24 uur na PT. (A) Representatieve cresylviolet gekleurd coronaal brein, secties om de 120 μm bij 24 uur na PT. Onderbroken lijnen afbakenen het laesiegebied. (B) Infarct volume analyse van 10 hersenen (elke stip vertegenwoordigt een individuele hersenen) 24 uur na PT. De horizontale rode lijn vertegenwoordigt het gemiddelde (29,32 mm3), foutbalken geven standaardafwijking aan (3,45 mm3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Neuroscore voor functionele tekorten na PT. Samengestelde Neuroscore voor, 24 uur, 3 dagen en 7 dagen na PT. BL = voor PT, RB = Rose Bengal. n = 5 per groep. *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Analyse van lichaamsgewicht en temperatuur na PT. (A) Lichaamsgewicht en (B) temperatuur was licht verminderd bij PT-dieren in vergelijking met door Sham bediende groepen na 24 uur en herstelde 3 dagen na PT. BL = vóór PT, RB = Rose Bengal. n = 5 per groep.*p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Laesie bevestiging na PT. (A) Laser Speckle imaging (B) Cresyl violet (bovenste panelen) en Tunel kleuring (onderste panelen) bevestigden de laesie pas na toediening van Rose Bengal en daaropvolgende laserverlichting. RB = Rose Bengalen. Schaalbalk = 1.000 μm in bovenste paneel B, schaalbalk = 20 μm in onderste paneel B. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft het experimentele beroertemodel van fototrombose door de intacte schedel te verlichten met een 561 nm laser, met een eerdere intraperitoneale injectie van Rose Bengal. Tot voor kort was het gebruik van dit model laag, maar neemt het gestaag toe.
Mortaliteit tijdens beroerte-inductie in dit model is afwezig. De totale mortaliteit van minder dan 5% ontstaat tijdens de operatie als gevolg van anesthesiologische complicaties of opoffering na het voldoen aan de uitsluitingscriteria. Om de lage variabiliteit van dit model en de reproduceerbaarheid ervan te garanderen, worden de volgende uitsluitingscriteria voorgesteld: 1) bedrijfstijd langer dan 30 minuten; 2) infectie van de hechtdraad; 3) bijtwond; en 4) geen infarct of geen voorasymmetrie om 24 uur na PT.
Een veel gebruikte experimentele beroertemodellen is de voorbijgaande occlusie van de MCA, door gebruik te maken van een hechtdraad, die in de interne halsslagader wordt geïntroduceerd totdat de met silicium bedekte punt de oorsprong van de MCA afsluit. Dit model maakt de reperfusie mogelijk door het filament te verwijderen en bootst het menselijke klinische scenario na, waarin er een herstel van de cerebrale bloedstroom is na spontane of therapeutische (rtPA) lysis van een embolic clot18,19. Het gaat echter om een complexe operatie met een hoge variabiliteit van het laatste infarct en een hoogsterftecijfer 10. Daarentegen kan de permanente occlusie van de MCA-distale van de lenticulostriatale slagaders worden bereikt door coagulatie van deslagader 20,21, die lokaal gedefinieerde laesies in de neocortexinduceert 22. Hoewel dit model een lager sterftecijfer heeft, vereist het invasieve chirurgie aan het dier door trepanatie van de schedel over de MCA om het later te stollen23. Bijgevolg zijn hoge chirurgische vaardigheden vereist voor een succesvolle en onbevooroordeelde in vivo beroertestudie.
In vergelijking met andere hersenischemiemodellen heeft het fototrombotische model zoals uitgevoerd in deze video het voordeel van geen craniotomie of grote chirurgie aan het dier, in tegenstelling tot andere modellen die complexe operaties of hersen craniotomie omvatten. Bovendien maakt de eenvoudige uitvoering van het model de operatie toegankelijk voor velen met een lage tijdrovende training. Lage mortaliteit, matig infarctvolume en flexibiliteit om de laesie naar een specifiek hersengebied te induceren, benadrukken het voordeel van dit experimentele paradigma voor hersenregeneratie en beroertestudies24,25,26,27.
Ondanks de voor de hand liggende voordelen, moeten een paar beperkingen van dit slagmodel in aanmerking worden genomen. De lange blootstelling van anesthetica aan het dier kan een kritieke factor zijn om rekening mee te houden, omdat de impact van anesthetica op neuroprotectie en beroerteresultaten al bekend is28. Hoewel de duur van deze chirurgische ingreep ongeveer 30 minuten duurt, kan het dier onder lage verdovingsconcentraties zijn vanwege de minimale manipulatie van het dier tijdens de 20 minuten laserverlichting. Omdat dit model matige hersenletsels veroorzaakt, zijn slechts kleine gedragsachterstanden detecteerbaar. Dus, meer geavanceerde testsystemen met een hogere gevoeligheid en kwalitatieve testparameters, zoals de bekwame bereikende test29 en Neuroscore17, zoals hier beschreven, misschien meer geschikt voor het detecteren van functionele resultaten op lange termijn in dit model. Ten slotte kan, als gevolg van de permanente aggregatie van de bloedplaatjes in de verlichte bloedvaten, geen reperfusie worden verkregen, wat een kenmerk is dat wordt waargenomen bij een aanzienlijk percentage beroertepatiënten als gevolg van spontane stolselanalyse of therapie30.
Een soortgelijk fototrombotisch beroertemodel werd in 2013 gepubliceerd door Labat-gest en Tomasi, waarin een PT-protocol werd beschreven met behulp van een koudlichtlamp in plaats van een 561 nm groene laser8. Zowel laser- als koudelichtbronnen kunnen worden gebruikt om Rose Bengalen excitatie te induceren. Een voordeel van lasergebaseerde lichtbronnen ten opzichte van koudlichtlampen is dat lasers kunnen worden gebruikt om individuele oppervlaktearteriolen te targeten voor in vivo vatspecifieke stolling31. Hoewel we ons niet richtten op specifieke arteriolen, gebruikten we een 561 nm groene laser voor hersenverlichting en fototrombose-inductie, vanwege de Rose Bengal absortion peak bij 562 nm. Om een goede laserintensiteit tijdens de verlichting te garanderen, werd de Cobolt Monitor Software-6.1.0.0 gebruikt om de laser te kalibreren. Bovendien was in deze studie een Rose Bengal-dosering van 10 μL/g (100 μg/g) voldoende om fototrombose te induceren, terwijl het vorige protocol een hogere dosis (150 μg/g)meldde 8. Bovendien biedt het protocol een gedragsmethode om het resultaat van de beroerte te analyseren (Neuroscore) en een extra schijncontrolegroep (laserverlichting) om te bewijzen dat de laser zelf geen weefselschade veroorzaakt, dus alleen de combinatie van Rose Bengal + laserverlichting induceert een hersenlaesie.
Over het algemeen maakt deze niet-invasieve eenvoudige chirurgische procedure een hoge reproduceerbaarheid en directionaliteit van de beroertelaesie naar de hersenen mogelijk, naast de mogelijkheid van langdurige observatie als gevolg van minimale mortaliteit. Dit fototrombotische beroertemodel onderscheidt zich als een waardevol experimenteel paradigma voor fundamenteel en translationeel beroerteonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende belangen om bekend te maken.
Acknowledgments
We danken al onze samenwerkingspartners van de Immunostroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) voor suggesties en discussies. Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) in het kader van de Duitse excellentiestrategie in het kader van het München Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) en in het kader van de subsidies LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 en LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
- Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
- Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).
