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Neuroscience

Modélisation de l’AVC chez la souris: lésions corticales focales par photothrombose

Published: May 6, 2021 doi: 10.3791/62536
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute for Stroke and Dementia Research, LMU Munich, 2Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)

Summary

Décrit ici est le modèle d’AVC photothrombotique, où un AVC est produit à travers le crâne intact en induisant une occlusion microvasculaire permanente à l’aide d’un éclairage laser après administration d’un colorant photosensible.

Abstract

L’AVC est l’une des principales causes de décès et d’invalidité acquise chez les adultes dans les pays développés. Malgré des recherches approfondies pour de nouvelles stratégies thérapeutiques, il reste des options thérapeutiques limitées pour les patients victimes d’un AVC. Par conséquent, davantage de recherches sont nécessaires pour les voies physiopathologiques telles que l’inflammation post-AVC, l’angiogenèse, la plasticité neuronale et la régénération. Compte tenu de l’incapacité des modèles in vitro à reproduire la complexité du cerveau, les modèles expérimentaux d’AVC sont essentiels pour l’analyse et l’évaluation ultérieure de nouvelles cibles médicamenteuses pour ces mécanismes. En outre, des modèles standardisés détaillés pour toutes les procédures sont nécessaires de toute urgence pour surmonter la crise dite de la réplication. Dans le cadre d’un effort au sein du consortium de recherche ImmunoStroke, un modèle murin photothrombotique standardisé utilisant une injection intrapéritonéale de Rose Bengal et l’éclairage du crâne intact avec un laser de 561 nm est décrit. Ce modèle permet la performance de l’AVC chez la souris avec une allocation à n’importe quelle région corticale du cerveau sans chirurgie invasive; permettant ainsi l’étude de l’AVC dans diverses zones du cerveau. Dans cette vidéo, les méthodes chirurgicales d’induction de l’AVC dans le modèle photothrombotique ainsi que l’analyse histologique sont démontrées.

Introduction

L’AVC ischémique reste l’une des principales causes de décès et d’invalidité acquise chez les adultes dans les paysdéveloppés au 21e siècle, représentant environ 2,7 millions de décès en 2017 dans le monde1. Malgré les immenses efforts de la communauté scientifique, peu de traitements sont disponibles. De plus, avec des critères d’exclusion aussi élevés, ces options déjà limitées ne sont pas accessibles à de nombreux patients, ce qui entraîne un besoin urgent de nouveaux traitements pour améliorer la récupération fonctionnelle après un AVC.

Compte tenu de l’incapacité des modèles in vitro à reproduire les interactions complexes du cerveau, les modèles animaux sont essentiels pour la recherche préclinique sur les accidents vasculaires cérébraux. Les souris sont le modèle animal le plus fréquemment utilisé dans le domaine de la recherche sur les accidents vasculaires cérébraux. La majorité de ces modèles murins visent à induire des infarctus en bloquant le flux sanguin dans l’artère cérébrale moyenne (ACM) puisque la majorité des lésions humaines d’AVC sont situées dans le territoire du MCA2. Bien que ces modèles récapitulent mieux les lésions d’AVC humain, ils impliquent des chirurgies convulsées avec une variabilité élevée du volume de l’infarctus.

Depuis la proposition de Rosenblum et El-Sabban du modèle photothrombotique en 19773,et plus tard l’application de ce modèle aux rats Watson et al.4,il est devenu largement utilisé dans la recherche sur l’AVC ischémique5,6. Le modèle d’AVC photothrombotique induit un infarctus cortical local et défini à la suite de la photoactivation d’un colorant sensible à la lumière préalablement injecté dans le flux sanguin. Cela provoque une thrombose locale des vaisseaux dans les zones exposées à la lumière. En bref, lors de l’exposition à la lumière du colorant photosensible injecté, une lésion oxydative localisée de la membrane cellulaire endothéliale est induite, entraînant une agrégation plaquettaire et la formation de thrombus, suivies d’une perturbation locale du flux sanguin cérébral7.

Le principal avantage de cette technique réside dans sa simplicité d’exécution et la possibilité de diriger la lésion vers la région souhaitée. Contrairement à d’autres modèles expérimentaux d’AVC, une expertise chirurgicale mineure est nécessaire pour effectuer le modèle d’AVC photothrombotique car la lésion est induite par l’éclairage du crâne intact. De plus, les bordures bien délimitées(Figure 2A et Figure 5B)et la flexibilité pour induire la lésion à une région spécifique du cerveau peuvent faciliter l’étude des réponses cellulaires au sein de l’aire ischémique ou corticale intacte8. Pour ces raisons, cette approche convient à l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires de la plasticité corticale.

Au cours des dernières décennies, l’inquiétude croissante concernant le manque de reproductibilité entre les groupes de recherche a été appelée la crise dite de la réplication9. Après la coordination de la première étude préclinique randomisée contrôlée multicentrique en 201510, un outil proposé pour améliorer la recherche préclinique11 , 12,13, il a été confirmé que l’une des causes de l’échec de la reproductibilité entre les études précliniques de laboratoires indépendants était le manque de normalisation suffisante des modèles expérimentaux d’AVC et des paramètres de résultats14. Par conséquent, lorsque le consortium ImmunoStroke a été créé (https://immunostroke.de/), une collaboration qui vise à comprendre les interactions cerveau-immunité sous-jacentes aux principes mécanistes de la récupération de l’AVC, la normalisation de tous les modèles expérimentaux d’AVC entre chaque groupe de recherche était essentielle.

La procédure normalisée pour l’induction du modèle photothrombotique telle qu’utilisée dans le consortium de recherche susmentionné est décrite ici. Brièvement, un animal a subi des anesthésiques, a reçu une injection de Rose Bengal (10 μL / g) par voie intrapéritonale, et le crâne intact, à 3 mm à gauche de bregma, a été immédiatement éclairé par un laser de 561 nm pendant 20 min(Figure 1). En outre, une méthode histologique et comportementale connexe pour analyser le résultat de l’AVC dans ce modèle est rapportée. Toutes les méthodes sont basées sur des procédures opérationnelles normalisées développées et utilisées en laboratoire.

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Protocol

Les expériences rapportées dans cette vidéo ont été menées conformément aux directives nationales pour l’utilisation d’animaux de laboratoire, et les protocoles ont été approuvés par les comités gouvernementaux allemands (Regierung von Oberbayern, Munich, Allemagne). Les souris utilisées dans cette étude étaient des souris mâles C57Bl/6J, âgées de 10 à 12 semaines, et envoyées par Charles River Allemagne. Les animaux ont été logés à des températures contrôlées (22 °C ± 2 °C), avec une période de cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès ad libitum à de la nourriture et de l’eau granulées.

1. Préparation du matériel et des instruments

  1. Dissoudre Rose Bengal dans une solution saline à 0,9 % pour atteindre une concentration finale de 10 mg/mL. Connectez la couverture chauffante pour garder la zone d’opération au chaud et maintenir la température corporelle de la souris pendant l’anesthésie à 37 ° C.
  2. Préparez des ciseaux, des pinces, des morceaux de coton, une pommade pour les yeux au dexpanthénol et du matériel de suture. Préparez une seringue avec une solution saline (sans aiguille) pour maintenir la zone d’opération hydratée. Préparer le gaz d’anesthésie (100% O2 + isoflurane).

2. Préparation de l’animal

  1. Injecter une analgésie 30 min avant la chirurgie (4 mg/kg de carprofène et 0,1 mg/kg de buprénorphine).
  2. Enregistrez le poids corporel de la souris pour ajuster la dose de Rose Bengal à injecter (10 μL/g, soit 100 μg/g).
  3. Placez la souris dans la chambre d’induction avec un débit d’isoflurane de 4% pour l’anesthésier jusqu’à ce que le mouvement spontané du corps et des vibrisses s’arrête.
  4. Transférez la souris dans le cadre stéréotaxique et placez-la en position couchée avec son nez dans le masque d’anesthésie. Fixez l’animal et maintenez la concentration d’isoflurane à 4% pendant 1 min. Ensuite, réduisez et maintenez la concentration d’isoflurane à 2%.
  5. Insérez doucement la sonde rectale pour surveiller la température tout au long des interventions chirurgicales. Réglez le coussin chauffant à rétroaction contrôlée associé pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 °C.
  6. Appliquez la pommade pour les yeux au dexpanthénol sur les deux yeux et nettoyez la peau et la fourrure environnante avec un agent désinfectant.

3. Modèle de photothrombe

  1. Faites une incision longitudinale de 2,0 à 2,5 cm et rétractez-vous pour exposer le crâne. Effectuez l’exposition du crâne avec une seule coupure pour éviter les complications de la plaie.
  2. Retirez doucement le périoste avec du coton et identifiez les sutures coronales.
  3. Mettez les lunettes de protection, allumez le laser 561 nm et marquez le bregma +3 mm à gauche.
  4. Éteignez le laser, fixez un autocollant avec un trou de 4 mm de diamètre placé aux coordonnées marquées mentionnées ci-dessus.
  5. Injecter à la souris de la rose de Bengale (10 μL/g), par voie intrapéritonéale. Placez le faisceau laser à 4-5 cm du crâne, allumez le laser 561 nm et illuminez le crâne pendant 20 min.
  6. Appliquer deux gouttes de solution saline à 0,9% sur le crâne pour se réhydraté, suturer la plaie et placer l’animal dans une chambre de récupération à 37 ° C pour récupérer de l’anesthésie. Après 1 h, ramenez les souris dans leurs cages dans une pièce à température contrôlée.
  7. Injecter une analgésie toutes les 12 h pendant 3 jours après la chirurgie (4 mg/kg de carprofène et 0,1 mg/kg de buprénorphine).

4. Opération simulée

  1. Effectuer deux procédures différentes d’opérations Sham décrites aux étapes 4.1.1 et 4.1.2.
    1. Effectuez toutes les procédures de manière identique à l’opération décrite ci-dessus. Injectez Rose Bengal sans allumer le laser. Après 20 min sous anesthésie, laissez les animaux rester dans la chambre de récupération pendant 1 h pour récupérer, avant d’être renvoyés dans leurs cages.
    2. Effectuez toutes les procédures de manière identique à l’opération décrite ci-dessus, en allumant le laser. Ne pas injecter Rose Bengal. Après 20 min d’éclairage laser, laissez les animaux rester dans la chambre de récupération pendant 1 h pour récupérer de l’anesthésie, avant d’être renvoyés dans leurs cages.

5. Moucheture laser

  1. Connectez la couverture chauffante pour garder la zone d’opération au chaud et maintenir la température corporelle de la souris pendant l’anesthésie à 37 ° C.
  2. Placez la souris dans la chambre d’induction avec un débit d’isoflurane de 4% pour l’anesthésier jusqu’à ce que le mouvement spontané du corps et des vibrisses s’arrête, puis transférez la souris dans le cadre stéréotaxique.
  3. Placez la souris en position couchée avec son nez dans le masque d’anesthésie. Fixez l’animal et maintenez la concentration d’isoflurane à 4% pendant 1 min. T poule réduire et maintenir à 2%.
  4. Insérez doucement la sonde rectale pour surveiller la température tout au long des interventions chirurgicales. Réglez le coussin chauffant à rétroaction contrôlée associé pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 ° C et appliquez une pommade pour les yeux au dexpanthénol sur les deux yeux. Nettoyez la peau et la fourrure environnante avec un agent désinfectant.
  5. Faites une incision longitudinale de 2,0 à 2,5 cm et rétractez-vous pour exposer le crâne. Effectuez l’exposition du crâne avec une seule coupure pour éviter les complications de la plaie.
  6. Placez le cadre stériletactique sous la moucheture laser et ajustez la hauteur pour obtenir une image nette. Focalisation de la caméra d’imagerie de perfusion de mouchetures laser (LSI) sur la fenêtre crânienne. Configurez le système de caméra l’imagerie laser haute résolution (LSI) comme décrit précédemment15.
  7. Acquérir des données à partir d’un champ de vision de 1 cm x 1 cm à l’aide d’une longueur d’onde de 785 nm et de lasers de 80 mW avec une fréquence d’images de 21 images/s à une distance de travail de 1 cm pendant 1 min.
  8. Après imagerie, appliquer deux gouttes de solution saline à 0,9% sur le crâne pour se réhydraté, suturer la plaie et placer l’animal dans une chambre de récupération à 37 °C pour récupérer de l’anesthésie pendant 1 h. Après 1 h, ramenez les souris dans leurs cages dans une pièce à température contrôlée.

6. Neuroscore

NOTE: Pour l’analyse du déficit neurologique, une échelle neurologique modifiée publiée par Eckenstein et al. en 1997 est utilisée15.

  1. Noter les animaux pour les déficits généraux (Tableau 1) et focaux (Tableau 2). Cette échelle composite varie de 0 (pas de déficit) à 46 (déficiences graves).
  2. Effectuez le neuroscore à la même heure chaque jour et utilisez des vêtements chirurgicaux pour garder une odeur neutre.
  3. Habituez les souris pendant 30 minutes dans la pièce avec une cage ouverte avant le test et laissez-les observer chaque élément pendant 30 s.

7. Perfusion

  1. Préparer une seringue de 20 mL contenant de l’héparine PBS (2 U/mL) et la placer à 1 m au-dessus du banc pour faciliter/assurer la perfusion par gravité.
  2. Injecter par voie intrapéritonéale 100 μL de kétamine et de xylazine (120/16 mg/kg de poids corporel, respectivement). Attendez 5 minutes et corroborez l’arrêt des mouvements spontanés du corps et des vibrisses.
  3. Fixez l’animal en position couchée et désinfectez la surface abdominale du corps avec 100% d’éthanol. Faites une incision de 3 cm de long dans l’abdomen; couper le diaphragme et les côtes pour visualiser complètement le cœur.
  4. Faites une petite incision dans l’oreillette droite et insérez la canule de perfusion dans le ventricule gauche et perfuse avec 20 mL de PBS-héparine.
  5. Après perfusion, décapiter l’animal et retirer le cerveau, le congeler à l’aide de glace carbonique et le conserver à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

8. Volumétrie de l’infarctus

  1. Cryosection : Coupez le cerveau en série sur un cryostat en sections de 20 μm d’épaisseur tous les 120 μm et montez-le sur des lames. Conservez les lames à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités ultérieurement.
  2. Coloration au violet crésyl (CV)
    1. Pour préparer la solution colorante, mélanger 0,5 g d’acétate CV dans 500 mL deH2O. Remuer et chauffer (60 °C) jusqu’à dissolution des cristaux. Laissez la solution refroidir et conservez-la dans une bouteille sombre. Réchauffer à 60 °C et filtrer (filtre à papier) avant chaque utilisation.
    2. Sécher les lames à température ambiante pendant 30 min. Placez-les dans de l’éthanol à 95% pendant 15 min, suivi de 70% d’éthanol pendant 1 min, puis dans de l’éthanol à 50% pendant 1 min.
    3. Placez les diapositives dans de l’eau distillée pendant 2 min, rafraîchissez l’eau distillée et replacez les lames dans l’eau pendant 1 min. Ensuite, placez les lames dans la solution de coloration préchauffée pendant 10 min à 60 °C. Laver les lames deux fois à l’eau distillée pendant 1 min.
    4. Placez les lames dans de l’éthanol à 95% pendant 2 min. Ensuite, placez-les dans de l’éthanol à 100% pendant 5 min, rafraîchissez le 100% d’éthanol et placez à nouveau les lames dans de l’éthanol à 100% pendant 2 min. Ensuite, couvrez les diapositives avec un support de montage.
    5. Analyse: Scannez les lames et analysez le volume de l’infarctus indirect par la méthode swanson16 pour corriger l’œdème: Aire ischémique = (région ischémique)-((hémisphère ipsilatéral) - (hémisphère controlatéral)).

9. Coloration tunel (kit de détection d’apoptosein situ)

  1. Sécher les lames, post-fixer dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS (ph 7.4) pendant 10-20 min à RT. Laver dans du PBS, post-fixer dans de l’éthanol prérefroidi : acide acétique 2:1 pendant 5 min à -20 °C.
  2. Laver dans PBS et appliquer un tampon d’équilibrage (10 s à un maximum de 60 min à RT) et appliquer l’enzyme TdT de force de travail (1 h à 37 °C dans une chambre humidifiée)
  3. Appliquer l’enzyme d’arrêt/lavage de la force de travail (10 min à RT), laver dans du PBS et appliquer un conjugué anti-digoxénine à force de travail réchauffé (RT) (30 min à RT dans l’obscurité)
  4. Laver dans PBS, incuber avec DAPI pendant 5 min à RT et monter les glissières avec un support fluoromount.

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Representative Results

Le modèle décrit ici est un modèle de course photothrombotique par injection de Rose Bengal et éclairage intact du crâne pendant 20 min, à une longueur d’onde constante de 561 nm et une puissance de sortie de 25 mW à la fibre. Bien que la chirurgie photothrombotique complète dure 30 minutes, l’animal est maintenu sous anesthésie basse et les lésions cérébrales sont modérées. Environ 10 minutes après le transfert dans leurs cages, tous les animaux étaient éveillés, se déplaçaient librement dans la cage et interagissaient avec leurs compagnons de portée.

La volumétrie de l’infarctus a été réalisée à l’aide de sections cérébrales coronales en série colorées en violet crésyle 24 heures après l’induction de l’AVC (Figure 2A). Le volume moyen de l’infarctus était de 29,3 mm3,ce qui représente 23% d’un hémisphère cérébral. De plus, la variabilité de ce modèle d’AVC est exceptionnellement faible avec un écart-type d’environ 3,5 %(Figure 2B). La zone lésionnelle englobe le cortex moteur sans l’affection des structures sous-corticales.

La photothrombose a provoqué une déficience sensorimotrice modérée et à long terme, indiquée par le composite Neuroscore17 (Figure 3); les déficits généraux et focaux ont été mesurés 24 h, 3 jours et 7 jours après la chirurgie. Le Neuroscore général comporte cinq éléments, y compris l’évaluation de la fourrure, des oreilles, des yeux, de la posture et de l’activité spontanée, avec un score maximum de 18(tableau 1). Le Neuroscore focal comprend sept éléments, y compris l’évaluation de la symétrie corporelle, de la démarche, de l’escalade, du comportement circulaire, de la symétrie des membres antérieurs, du cyclisme obligatoire et de la réponse des moustaches, avec un score maximum de 28(tableau 2). Les animaux victimes d’un AVC ont eu un changement significatif dans le neuroscore composite 24 heures après la chirurgie par rapport aux animaux opérés par Sham. Ces différences ont persisté, bien que les souris avcées se soient améliorées au fil du temps(Figure 3).

La mortalité pendant la période d’observation se produit rarement chez 1 à 2% des animaux. Dans ce rapport, aucun des 10 animaux étudiés n’a dû être exclu et tous ont survécu à la période d’observation de 7 jours. Les changements de poids corporel et de température chez les souris ont été surveillés 24 h, 3 jours et 7 jours après la chirurgie (Figure 4A,B). Les données ont montré que le poids corporel et la température ont diminué 24 heures après la chirurgie uniquement dans le groupe d’illumination Rose Bengal +, mais ont récupéré au niveau des animaux opérés par Sham dans les 3 jours suivant la chirurgie.

Pour confirmer une induction de changements ischémiques, 24 heures après la chirurgie, les animaux ont subi un test d’imagerie laser. Une imagerie de contraste de moucheture laser a mesuré la perfusion sanguine du cortex pendant une durée de 1 min et une image moyenne codée par couleur a été obtenue pour chaque animal. Cela démontre que Rose Bengal ou éclairage laser seul ne produit pas de lésion, tandis que l’application simultanée de Rose Bengal et d’éclairage laser génère une zone ronde hypoperfusée de 4 mm de diamètre entourée d’une zone oligemique étroite(Figure 5A). En outre, une coloration au violet crésyl et à Tunel pour l’évaluation du volume de l’infarctus 24 heures après la chirurgie n’a révélé aucune lésion tissulaire, que ce soit dans les chirurgies d’éclairage Rose Bengal ou laser. D’autre part, l’éclairage laser Rose Bengal + a généré une lésion bien délimitée(Figure 5B).

Tableau 1 : Neuroscore général. Pour chacun des cinq déficits généraux mesurés, les animaux peuvent recevoir entre 0 et 4 points selon la gravité. Les scores sur les cinq domaines sont ensuite additionnés pour fournir un score général total allant de 0 à 18. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Neuroscore focal. Pour chacun des sept déficits généraux mesurés, les animaux peuvent recevoir entre 0 et 4 points selon la gravité. Les scores sur les cinq domaines sont ensuite additionnés pour fournir un score général total allant de 0 à 28. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 1
Figure 1: Photothrommose (PT). Diagramme représentant la zone photothrombotique, à 3 mm de Bregma. Le point vert indique la position du laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Analyse volumétrique de l’infarctus et résultat de l’infarctus 24 h après PT. (A) Cerveau coronal coloré par le violet crésylique représentatif, sections tous les 120 μm à 24 h après PT. Des lignes pointillées délimitent la zone de la lésion. (B) Analyse du volume de l’infarctus de 10 cerveaux (chaque point représentant un cerveau individuel) 24 h après la PT. La ligne rouge horizontale représente la moyenne (29,32 mm3),les barres d’erreur indiquent l’écart type (3,45 mm3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Neuroscore pour les déficits fonctionnels après PT. Composite Neuroscore avant, 24 h, 3 jours et 7 jours après PT. BL = avant PT, RB = Rose Bengal. n = 5 par groupe. *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Analyse du poids corporel et de la température après PT. (A) Le poids corporel et (B) la température ont été légèrement réduits chez les animaux PT par rapport aux groupes opérés par Sham à 24 h et récupérés 3 jours après PT. BL = avant PT, RB = Rose Bengal. n = 5 par groupe.*p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Confirmation de la lésion après PT. (A) L’imagerie laser Speckle (B) le violet de Crésyle (panneaux supérieurs) et la coloration Tunel (panneaux inférieurs) n’ont confirmé la lésion qu’après l’administration de Rose Bengal et l’éclairage laser ultérieur. RB = Bengale rose. Barre d’échelle = 1 000 μm dans le panneau supérieur B, barre d’échelle = 20 μm dans le panneau inférieur B. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le protocole présenté décrit le modèle expérimental de photothrommose par AVC en éclairant le crâne intact avec un laser de 561 nm, avec une injection intrapéritonéale précédente de Rose Bengal. Jusqu’à récemment, l’utilisation de ce modèle était faible mais ne cesse d’augmenter.

La mortalité pendant l’induction de l’AVC dans ce modèle est absente. La mortalité globale de moins de 5% survient pendant l’opération en raison de complications anesthésiologiques ou de sacrifices après avoir répondu aux critères d’exclusion. Pour justifier la faible variabilité de ce modèle et sa reproductibilité, les critères d’exclusion suivants sont suggérés : 1) durée de fonctionnement supérieure à 30 min; 2) infection de la suture; 3) morsure de blessure; et 4) pas d’infarctus ou pas d’asymétrie préalable à 24 heures après PT.

Un modèle expérimental d’AVC largement utilisé est l’occlusion transitoire du MCA, en utilisant un filament de suture, qui est introduit dans l’artère carotide interne jusqu’à ce que la pointe recouverte de silicium obstrue l’origine du MCA. Ce modèle permet la reperfusion en enlevant le filament et imite le scénario clinique humain, dans lequel il y a une restauration du flux sanguin cérébral après lyse spontanée ou thérapeutique (rtPA) d’un caillot embolique18,19. Cependant, il s’agit d’une chirurgie complexe avec une grande variabilité de l’infarctus final et un taux de mortalité élevé10. En revanche, l’occlusion permanente du MCA distal des artères lenticulostriatales peut être obtenue par coagulation de l’artère20,21, ce qui induit des lésions définies localement dans le néocortex22. Bien que ce modèle ait un taux de mortalité plus faible, il nécessite une chirurgie invasive chez l’animal par trépanation du crâne sur le MCA pour le coaguler plus tard23. Par conséquent, des compétences chirurgicales élevées sont requises pour une étude in vivo réussie et impartiale sur l’AVC.

Comparé à d’autres modèles d’ischémie cérébrale, le modèle photothrombotique tel que réalisé dans cette vidéo présente l’avantage de ne pas subir de craniotomie ou de chirurgie majeure sur l’animal, contrairement à d’autres modèles impliquant des chirurgies complexes ou une craniotomie cérébrale. De plus, la simple exécution du modèle rend la chirurgie accessible à beaucoup avec une formation peu longue. Une faible mortalité, un volume d’infarctus modéré et une flexibilité pour induire la lésion dans une région spécifique du cerveau soulignent l’avantage de ce paradigme expérimental pour la régénération du cerveau et les études sur les accidents vasculaires cérébraux24,25,26,27.

Malgré les avantages évidents, quelques limites de ce modèle d’AVC doivent être prises en considération. La longue exposition des anesthésiques à l’animal pourrait être un facteur critique à prendre en compte, car l’impact des anesthésiques sur la neuroprotection et l’issue des accidents vasculaires cérébraux est déjà bien connu28. Bien que la durée de cette intervention chirurgicale prenne environ 30 minutes, l’animal peut être soumis à de faibles concentrations anesthésiques en raison de la manipulation minimale de l’animal pendant les 20 minutes d’éclairage laser. Parce que ce modèle induit des lésions cérébrales modérées, seuls des déficits comportementaux mineurs sont détectables. Ainsi, des systèmes de test plus avancés avec une sensibilité plus élevée et des paramètres de test qualitatifs, tels que le test d’atteinte qualifié29 et Neuroscore17, comme décrit ici, peuvent être plus appropriés pour détecter les résultats fonctionnels à long terme dans ce modèle. Enfin, en raison de l’agrégation permanente des plaquettes dans les vaisseaux sanguins illuminés, aucune reperfusion ne peut être obtenue, ce qui est une caractéristique observée chez un pourcentage important de patients victimes d’un AVC en raison d’une lyse spontanée des caillots ou d’un traitement30.

Un modèle d’AVC phototrombotique similaire a été publié en 2013 par Labat-gest et Tomasi, décrivant un protocole PT utilisant une lampe à lumière froide au lieu d’un laser vert 561 nm8. Les sources de lumière laser et froide peuvent être utilisées pour induire l’excitation de Rose Bengal. Un avantage des sources lumineuses à base de laser par rapport aux lampes à lumière froide est que les lasers peuvent être utilisés pour cibler des artérioles de surface individuelles pour une coagulation in vivo spécifique au vaisseau31. Bien que nous ne ciblions pas d’artérioles spécifiques, nous avons utilisé un laser vert de 561 nm pour l’illumination du cerveau et l’induction de phototromboses, en raison du pic d’absorption de Rose Bengal à 562 nm. Pour garantir une intensité laser correcte pendant l’éclairage, le logiciel Cobolt Monitor Software-6.1.0.0 a été utilisé pour calibrer le laser. De plus, dans la présente étude, une dose de Rose Bengal de 10 μL/g (100 μg/g) était suffisante pour induire la phototrombose, alors que le protocole précédent rapportait une dose plus élevée (150 μg/g)8. En outre, le protocole fournit une méthode comportementale pour analyser le résultat de l’AVC (Neuroscore) et un groupe de contrôle simulé supplémentaire (éclairage laser) afin de prouver que le laser lui-même ne produit aucun dommage tissulaire, de sorte que seule la combinaison de Rose Bengal + éclairage laser induit une lésion cérébrale.

Dans l’ensemble, cette intervention chirurgicale simple non invasive permet une reproductibilité et une directionnalité élevées de la lésion de l’AVC au cerveau ainsi que la possibilité d’une observation à long terme en raison d’une mortalité minimale. Ce modèle photothrombotique de l’AVC se distingue comme un paradigme expérimental précieux pour la recherche fondamentale et translationnelle sur l’AVC.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions tous nos partenaires de collaboration des consortiums Immunostroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) pour leurs suggestions et discussions. Ce travail a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne dans le cadre du Cluster de Munich pour la neurologie des systèmes (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) et dans le cadre des subventions LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 et LL-112/1-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
561 nm wavelenght laser Solna Cobolt HS-03
Acetic Acid Sigma Life Science 695092
Anesthesia system for isoflurane Drager
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100
Bepanthen pomade Bayer 1578681
C57Bl/6J mice Charles River 000664
Collimeter Thorlabs F240APC-A
Cotons NOBA Verbondmitel Danz 974116
Cresyl violet Sigma Life Science C5042-10G
Cryostat Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70% CLN Chemikalien Laborbedorf 521005
Ethanol 96% CLN Chemikalien Laborbedorf 522078
Ethanol 99% CLN Chemikalien Laborbedorf ETO-5000-99-1
Filter paper Macherey-Nagel 432018
Fine Scissors FST 15000-00
Forceps FST 11616-15
Heating blanket FHC DC Temperature Controller  40-90-8D
Isoflurane Abbot B506
Isopentane Fluka 59070
Ketamine Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Speckle Perimed PeriCam PSI HR
Mayor Scissors FST 1410-15
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 Apotheke Innestadt Uni Munchen P32799
Protective glasses Laser 2000 NIR-ZS2-38
Rose Bengal Sigma Aldrich 198250-5G
Roti-Histokit mounting medium Roth 6638.1
Saline solution Braun 131321
Stereomikroskop Zeiss Stemi DV4
Stereotactic frame Stoelting 51500U
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Xylacine Albrecht

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References

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Neurosciences Numéro 171 ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL ISCHÉMIE CÉRÉBRALE MODÈLE ANIMAL photothrombotique permanent Bengale rose éclairage laser
Modélisation de l’AVC chez la souris: lésions corticales focales par photothrombose
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Llovera, G., Pinkham, K., Liesz, A.… More

Llovera, G., Pinkham, K., Liesz, A. Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis. J. Vis. Exp. (171), e62536, doi:10.3791/62536 (2021).

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