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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Modellierung von Schlaganfällen bei Mäusen: Fokale kortikale Läsionen durch Photothrombose

Published: May 6, 2021 doi: 10.3791/62536
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute for Stroke and Dementia Research, LMU Munich, 2Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)

Summary

Hier wird das photothrombotische Schlaganfallmodell beschrieben, bei dem ein Schlaganfall durch den intakten Schädel erzeugt wird, indem eine permanente mikrovaskuläre Okklusion mittels Laserbeleuchtung nach Verabreichung eines lichtempfindlichen Farbstoffs induziert wird.

Abstract

Schlaganfall ist eine der häufigsten Todesursachen und erworbene Behinderungen bei Erwachsenen in industrieländern Ländern. Trotz umfangreicher Untersuchungen nach neuartigen Therapiestrategien gibt es nach wie vor begrenzte Therapiemöglichkeiten für Schlaganfallpatienten. Daher ist mehr Forschung für pathophysiologische Wege wie Entzündungen nach einem Schlaganfall, Angiogenese, neuronale Plastizität und Regeneration erforderlich. Angesichts der Unfähigkeit von In-vitro-Modellen, die Komplexität des Gehirns zu reproduzieren, sind experimentelle Schlaganfallmodelle für die Analyse und anschließende Bewertung neuartiger Wirkstoffziele für diese Mechanismen unerlässlich. Darüber hinaus werden dringend detaillierte standardisierte Modelle für alle Verfahren benötigt, um die sogenannte Replikationskrise zu überwinden. Als Versuch innerhalb des ImmunoStroke-Forschungskonsortiums wird ein standardisiertes photothrombotisches Mausmodell mit einer intraperitonealen Injektion von Rose Bengal und der Beleuchtung des intakten Schädels mit einem 561-nm-Laser beschrieben. Dieses Modell ermöglicht die Durchführung von Schlaganfällen bei Mäusen mit Zuordnung zu jeder kortikalen Region des Gehirns ohne invasive Operation; Dies ermöglicht die Untersuchung von Schlaganfällen in verschiedenen Bereichen des Gehirns. In diesem Video werden die chirurgischen Methoden der Schlaganfallinduktion im photothrombotischen Modell zusammen mit der histologischen Analyse demonstriert.

Introduction

Ischämischer Schlaganfall bleibt eine der Hauptursachen für Todesfälle und erworbene Erwachsene Behinderung in den Entwickelten Ländern im 21. Jahrhundert, die für etwa 2,7 Millionen Todesfälle im Jahr 2017 weltweitverantwortlich sind 1. Trotz der immensen Anstrengungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft sind nur wenige Behandlungen verfügbar. Darüber hinaus sind diese bereits begrenzten Optionen bei solch hohen Ausschlusskriterien für viele Patienten nicht zugänglich, was zu einem dringenden Bedarf an neuartigen Behandlungen zur Verbesserung der funktionellen Genesung nach einem Schlaganfall führt.

In Anbetracht der Unfähigkeit von In-vitro-Modellen, die komplexen Interaktionen des Gehirns zu replizieren, sind Tiermodelle für die präklinische Schlaganfallforschung unerlässlich. Mäuse sind das am häufigsten verwendete Tiermodell in der Schlaganfallforschung. Die Mehrheit dieser Mausmodelle zielt darauf ab, Infarkte zu induzieren, indem sie den Blutfluss innerhalb der mittleren Hirnarterie (MCA) blockieren, da sich die Mehrheit der menschlichen Schlaganfallläsionen im MCA-Territorium befindet2. Obwohl diese Modelle menschliche Schlaganfallläsionen besser rekapitulieren, beinhalten sie konvulierte Operationen mit hoher Infarktvolumenvariabilität.

Seit Rosenblum und El-Sabbans Vorschlag des photothrombotischen Modells im Jahr 19773und später die Anwendung dieses Modells auf Ratten Watson et al.4ist es in der ischämischen Schlaganfallforschung weit verbreitet5,6. Das photothrombotische Schlaganfallmodell induziert einen lokalen und definierten kortikalen Infarkt als Folge der Photoaktivierung eines lichtempfindlichen Farbstoffs, der zuvor in den Blutfluss injiziert wurde. Dies führt zu einer lokalen Thrombose der Gefäße in den lichtexponierten Bereichen. Kurz gesagt, bei Einwirkung von Licht aus dem injizierten lichtempfindlichen Farbstoff wird eine lokalisierte oxidative Verletzung der Endothelzellmembran induziert, die zu Thrombozytenaggregation und Thrombusbildung führt, gefolgt von einer lokalen Störung des zerebralen Blutflusses7.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Einfachheit der Ausführung und der Möglichkeit, die Läsion in die gewünschte Region zu lenken. Im Gegensatz zu anderen experimentellen Schlaganfallmodellen ist für die Durchführung des photothrombotischen Schlaganfallmodells ein geringes chirurgisches Fachwissen erforderlich, da die Läsion durch Beleuchtung des intakten Schädels induziert wird. Darüber hinaus können die gut abgegrenzten Grenzen (Abbildung 2A und Abbildung 5B) und die Flexibilität, die Läsion zu einer bestimmten Hirnregion zu induzieren, die Untersuchung zellulärer Reaktionen innerhalb des ischämischen oder intakten kortikalen Bereichs erleichtern8. Aus diesen Gründen eignet sich dieser Ansatz zur Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen der kortikalen Plastizität.

In den letzten Jahrzehnten wurde die wachsende Sorge um die mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen Forschungsgruppen als sogenannte Replikationskrisegeprägt 9. Nach der Koordination der ersten präklinischen randomisierten kontrollierten multizentrischen Studie im Jahr 201510, einem vorgeschlagenen Instrument zur Verbesserung der präklinischen Forschung11,12,13, wurde bestätigt, dass eine Ursache für die mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen präklinischen Studien aus unabhängigen Labors die fehlende ausreichende Standardisierung experimenteller Schlaganfallmodelle und Ergebnisparameter war14. Als das ImmunoStroke-Konsortium (https://immunostroke.de/) gegründet wurde, eine Zusammenarbeit, die darauf abzielt, gehirn-immune Interaktionen zu verstehen, die den mechanistischen Prinzipien der Schlaganfall-Genesung zugrunde liegen, war die Standardisierung aller experimentellen Schlaganfallmodelle zwischen jeder Forschungsgruppe unerlässlich.

Hier wird das standardisierte Verfahren zur Induktion des photothrombotischen Modells beschrieben, wie es im oben genannten Forschungskonsortium verwendet wird. Kurz gesagt, ein Tier wurde einer Betäubung unterzogen, erhielt eine Rose Bengal Injektion (10 μL / g) intraperitonal, und der intakte Schädel, 3 mm von Bregma übrig, wurde sofort von einem 561 nm Laser für 20 min beleuchtet (Abbildung 1). Zusätzlich wird über eine verwandte histologische und verhaltensbezogene Methode zur Analyse des Schlaganfallergebnisses in diesem Modell berichtet. Alle Methoden basieren auf Standardarbeitsanweisungen, die im Labor entwickelt und verwendet werden.

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Protocol

Die in diesem Video berichteten Versuche wurden nach den nationalen Richtlinien für den Einsatz von Versuchstieren durchgeführt und die Protokolle von den deutschen Regierungsgremien (Regierung von Oberbayern, München, Deutschland) genehmigt. Die in dieser Studie verwendeten Mäuse waren männliche C57Bl / 6J-Mäuse, 10-12 Wochen alt und von Charles River Deutschland verschickt. Die Tiere wurden unter kontrollierten Temperaturen (22 °C ± 2 °C), mit einer Hell-Dunkel-Zyklusperiode von 12 h und Zugang zu pelletiertem Futter und Wasser ad libitum untergebracht.

1. Vorbereitung des Materials und der Instrumente

  1. Rose Bengal in 0,9% iger Kochsalzlösung auflösen, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml zu erreichen. Schließen Sie die Wärmedecke an, um den Operationsbereich warm zu halten und die Körpertemperatur der Maus während der Anästhesie bei 37 °C zu halten.
  2. Bereiten Sie Schere, Zette, Baumwollstücke, Dexpanthenol-Augensalbe und Nahtmaterial vor. Bereiten Sie eine Spritze mit Kochsalzlösung (ohne Nadel) vor, um den Operationsbereich hydratisiert zu halten. Bereiten Sie das Anästhesiegas (100%O2 + Isofluran) vor.

2. Vorbereitung des Tieres

  1. Injizieren Sie Analgesie 30 minuten vor der Operation (4 mg/kg Carprofen und 0,1 mg/kg Buprenorphin).
  2. Notieren Sie das Körpergewicht der Maus, um die Dosis von Rose Bengal einzustellen, die injiziert werden soll (10 μL / g, dh 100 μg / g).
  3. Legen Sie die Maus mit einer Isofluran-Durchflussrate von 4% in die Induktionskammer, um sie zu betäuben, bis die spontane Bewegung des Körpers und der Vibrissae aufhört.
  4. Übertragen Sie die Maus in den stereotaktischen Rahmen und legen Sie sie in Bauchlage mit der Nase in die Anästhesiemaske. Fixieren Sie das Tier und halten Sie die Isoflurankonzentration für 1 minute bei 4%. Dann reduzieren und halten Sie die Isoflurankonzentration bei 2%.
  5. Setzen Sie vorsichtig die Rektalsonde ein, um die Temperatur während der gesamten chirurgischen Eingriffe zu überwachen. Stellen Sie das zugehörige feedbackgesteuerte Heizkissen so ein, dass die Körpertemperatur der Maus bei 37 °C gehalten wird.
  6. Tragen Sie Dexpanthenol Augensalbe auf beide Augen auf und reinigen Sie die Haut und das umgebende Fell mit einem Desinfektionsmittel.

3. Photothrombose-Modell

  1. Machen Sie einen 2,0-2,5 cm langen Längsschnitt und ziehen Sie sich zurück, um den Schädel freizulegen. Führen Sie die Schädelexposition mit einem einzigen Schnitt durch, um Wundkomplikationen zu vermeiden.
  2. Entfernen Sie das Periost vorsichtig mit Baumwolle und identifizieren Sie die koronalen Nähte.
  3. Setzen Sie die Schutzbrille auf, schalten Sie den 561 nm Laser ein und markieren Sie die bregma +3 mm links.
  4. Schalten Sie den Laser aus, befestigen Sie einen Aufkleber mit einem Loch mit einem Durchmesser von 4 mm, das an den oben genannten markierten Koordinaten platziert ist.
  5. Injizieren Sie der Maus Bengal Rose (10 μL/g) intraperitoneal. Platzieren Sie den Laserstrahl 4-5 cm vom Schädel entfernt, schalten Sie den 561 nm Laser ein und beleuchten Sie den Schädel für 20 min.
  6. Tragen Sie zwei Tropfen 0,9% Kochsalzlösung auf den Schädel auf, um die Wunde zu rehydrieren, die Wunde zu nähen und das Tier bei 37 ° C in eine Erholungskammer zu legen, um sich von der Anästhesie zu erholen. Nach 1 h bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige in einem temperaturkontrollierten Raum zurück.
  7. Injizieren Sie alle 12 Stunden für 3 Tage nach der Operation Analgesie (4 mg/kg Carprofen und 0,1 mg/kg Buprenorphin).

4. Scheinbetrieb

  1. Führen Sie zwei verschiedene Verfahren von Sham-Operationen durch, wie in den Schritten 4.1.1 und 4.1.2 beschrieben.
    1. Führen Sie alle Verfahren identisch mit dem oben beschriebenen Vorgang aus. Injizieren Sie Rose Bengal, ohne den Laser einzuschalten. Nach 20 Minuten unter Betäubung lassen Sie die Tiere 1 h in der Aufwachkammer bleiben, um sich zu erholen, bevor sie in ihre Käfige zurückgebracht werden.
    2. Führen Sie alle Verfahren identisch mit der oben beschriebenen Operation durch und schalten Sie den Laser ein. Rose Bengal nicht injizieren. Lassen Sie die Tiere nach 20 Minuten Laserbeleuchtung 1 h in der Aufwachkammer bleiben, um sich von der Anästhesie zu erholen, bevor sie in ihre Käfige zurückgebracht werden.

5. Laser-Speckle

  1. Schließen Sie die Heizdecke an, um den Operationsbereich warm zu halten und die Körpertemperatur der Maus während der Anästhesie bei 37 °C zu halten.
  2. Legen Sie die Maus mit einer Isofluran-Durchflussrate von 4% in die Induktionskammer, um sie zu betäuben, bis die spontane Bewegung des Körpers und der Vibrissae aufhört, und übertragen Sie die Maus dann in den stereotaktischen Rahmen.
  3. Legen Sie die Maus in Bauchlage mit der Nase in die Anästhesiemaske. Fixieren Sie das Tier und halten Sie die Isoflurankonzentration bei 4% für 1 min. T Henne reduzieren und halten Sie es bei 2%.
  4. Setzen Sie vorsichtig die Rektalsonde ein, um die Temperatur während der gesamten chirurgischen Eingriffe zu überwachen. Stellen Sie das zugehörige feedbackgesteuerte Heizkissen so ein, dass die Körpertemperatur der Maus bei 37 °C gehalten wird, und tragen Sie Dexpanthenol-Augensalbe auf beide Augen auf. Reinigen Sie die Haut und das umgebende Fell mit einem Desinfektionsmittel.
  5. Machen Sie einen 2,0-2,5 cm langen Längsschnitt und ziehen Sie sich zurück, um den Schädel freizulegen. Führen Sie die Schädelexposition mit einem einzigen Schnitt durch, um Wundkomplikationen zu vermeiden.
  6. Legen Sie den sterotaktischen Rahmen unter den Laserfleck und passen Sie die Höhe an, um ein scharfes Bild zu erhalten. Fokussieren Sie die Laser Speckle Perfusion Imaging (LSI) Kamera auf das Schädelfenster. Konfigurieren Sie das hochauflösende LSI-Kamerasystem (Laser Speckle Imaging) wie zuvor beschrieben15.
  7. Erfassen Sie Daten aus einem Sichtfeld von 1 cm x 1 cm mit einer Wellenlänge von 785 nm und 80 mW Lasern mit einer Bildrate von 21 Bildern/s bei einem Arbeitsabstand von 1 cm für 1 min.
  8. Tragen Sie nach der Bildgebung zwei Tropfen 0,9% Kochsalzlösung auf den Schädel auf, um die Wunde zu rehydrieren, die Wunde zu nähen und das Tier bei 37 ° C in eine Erholungskammer zu legen, um sich für 1 h von der Anästhesie zu erholen. Nach 1 h bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige in einem temperaturkontrollierten Raum zurück.

6. Neuroscore

HINWEIS: Für die neurologische Defizitanalyse wird eine modifizierte neurologische Skala verwendet, die 1997 von Eckenstein et al. veröffentlicht wurde15.

  1. Bewertung der Tiere für allgemeine (Tabelle 1) und fokale Defizite (Tabelle 2). Diese zusammengesetzte Skala reicht von 0 (keine Defizite) bis 46 (schwere Beeinträchtigungen).
  2. Führen Sie den Neuroscore jeden Tag zur gleichen Zeit durch und verwenden Sie chirurgische Kleidung, um einen neutralen Geruch zu erhalten.
  3. Gewöhnen Sie die Mäuse vor dem Test 30 Minuten lang mit einem offenen Käfig im Raum an und lassen Sie sie jeden Gegenstand 30 s lang beobachten.

7. Durchblutung

  1. Bereiten Sie eine 20-ml-Spritze mit PBS-Heparin (2 U/ ml) vor und stellen Sie sie 1 m über die Bank, um die schwerkraftgesteuerte Perfusion zu erleichtern / sicherzustellen.
  2. Intraperitoneal 100 μL Ketamin und Xylazin (120/16 mg/kg Körpergewicht) injizieren. Warten Sie 5 Minuten und bestätigen Sie die Beendigung der spontanen Körperbewegung und Vibrissae.
  3. Fixieren Sie das Tier in Rückenlage und desinfizieren Sie die Abdominalkörperoberfläche mit 100% Ethanol. Machen Sie einen 3 cm langen Schnitt im Bauch; Schneiden Sie das Zwerchfell und die Rippen ab, um das Herz vollständig zu visualisieren.
  4. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof und führen Sie die Perfusionskanüle in den linken Ventrikel ein und perfusionieren Sie mit 20 ml PBS-Heparin.
  5. Nach der Durchblutung das Tier enthaupten und das Gehirn entfernen, mit Trockeneis einfrieren und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung lagern.

8. Infarkt-Volumetry

  1. Kryosektion: Schneiden Sie das Gehirn seriell auf einem Kryostaten auf 20 μm dicke Abschnitte alle 120 μm und montieren Sie es auf Dias. Lagern Sie die Dias bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C.
  2. Cresyl violett (CV) Färbung
    1. Zur Herstellung der Färbelösung 0,5 g CV-Acetat in 500 mlH2Omischen. Umrühren und erhitzen (60 °C), bis die Kristalle gelöst sind. Lassen Sie die Lösung abkühlen und lagern Sie sie in einer dunklen Flasche. Vor jedem Gebrauch auf 60 °C erwärmen und filtern (Papierfilter).
    2. Trocknen Sie die Dias bei Raumtemperatur für 30 min. Legen Sie sie für 15 min in 95% Ethanol, gefolgt von 70% Ethanol für 1 min und danach in 50% Ethanol für 1 min.
    3. Stellen Sie die Rutschen für 2 min in destilliertes Wasser, erfrischen Sie das destillierte Wasser und legen Sie die Rutschen für 1 min wieder in Wasser. Anschließend die Dias für 10 min bei 60 °C in die vorgeheizte Färbelösung geben. Waschen Sie die Dias zweimal in destilliertem Wasser für 1 min.
    4. Legen Sie die Dias für 2 min in 95% Ethanol. Dann legen Sie sie für 5 min in 100% Ethanol, erfrischen Sie das 100% Ethanol und legen Sie die Dias für 2 min wieder in 100% Ethanol. Anschließend die Dias mit einem Montagemedium abdecken.
    5. Analyse: Scannen Sie die Objektträger und analysieren Sie das indirekte Infarktvolumen nach der Swanson-Methode16, um Ödeme zu korrigieren: Ischämische Fläche = (ischämische Region)-((ipsilaterale Hemisphäre) - (kontralaterale Hemisphäre)).

9. Tunel-Färbung(In-situ-Apoptose-Erkennungskit)

  1. Trocknen Sie die Objektträger, postfixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd in PBS (ph 7,4) für 10-20 min bei RT. Waschen Sie in PBS, postfixieren Sie es in vorgekühltem Ethanol: Essigsäure 2:1 für 5 min bei -20 °C.
  2. In PBS waschen und Gleichgewichtspuffer auftragen (10 s bis maximal 60 min bei RT) und TdT-Enzym mit Arbeitsstärke anwenden (1 h bei 37 °C in befeuchteter Kammer)
  3. Arbeitsstärke-Stopp/Waschenzym auftragen (10 min bei RT), in PBS waschen und erwärmte (RT) Arbeitsstärke Anti-Digoxigenin-Konjugat auftragen (30 min bei RT im Dunkeln)
  4. In PBS waschen, mit DAPI 5 min bei RT inkubieren und die Dias mit Fluoromount-Medien montieren.

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Representative Results

Das hier beschriebene Modell ist ein photothrombotisches Schlaganfallmodell durch Rose Bengal Injektion und intakte Schädelbeleuchtung für 20 min, bei einer konstanten Wellenlänge von 561 nm und 25 mW Ausgangsleistung an der Faser. Obwohl die komplette photothrombotische Operation 30 min dauert, wird das Tier unter niedriger Betäubung gehalten und der Hirnschaden ist moderat. Etwa 10 Minuten nach dem Transfer in ihre Käfige waren alle Tiere wach, bewegten sich frei im Käfig und interagierten mit Wurfgefährten.

Die Infarkt-Volumetry wurde 24 h nach Schlaganfallinduktion unter Verwendung von kresylviolett gefärbten seriellen koronalen Hirnschnitten durchgeführt (Abbildung 2A). Das mittlere Infarktvolumen betrug 29,3 mm3,was 23% einer Gehirnhemisphäre entspricht. Darüber hinaus ist die Variabilität dieses Hubmodells mit einer Standardabweichung von ca. 3,5% außergewöhnlich gering (Abbildung 2B). Der Läsionsbereich umfasst den motorischen Kortex ohne die Zuneigung subkortikaler Strukturen.

Photothrombose verursachte eine moderate, langfristige sensomotorische Beeinträchtigung, die durch den zusammengesetzten Neuroscore17 angezeigt wird (Abbildung 3); allgemeine und fokale Defizite wurden 24 h, 3 Tage und 7 Tage nach der Operation gemessen. Der allgemeine Neuroscore hat fünf Punkte, einschließlich der Bewertung von Fell, Ohren, Augen, Haltung und spontaner Aktivität, mit einer maximalen Punktzahl von 18 (Tabelle 1). Der fokale Neuroscore umfasst sieben Items, darunter die Bewertung von Körpersymmetrie, Gang, Klettern, Kreisverhalten, Vordergliedmaßensymmetrie, obligatorischem Radfahren und Schnurrhaarreaktion, mit einer maximalen Punktzahl von 28 (Tabelle 2). Schlaganfalltiere hatten eine signifikante Veränderung des zusammengesetzten Neuroscores 24 Stunden nach der Operation im Vergleich zu Sham-operierten Tieren. Diese Unterschiede blieben bestehen, obwohl sich Schlaganfallmäuse im Laufe der Zeit verbesserten (Abbildung 3).

Mortalität während der Beobachtungszeit tritt selten bei 1-2% der Tiere auf. In diesem Bericht musste keines der 10 untersuchten Tiere ausgeschlossen werden und alle überlebten den 7-tägigen Beobachtungszeitraum. Die Körpergewichts- und Temperaturänderungen bei den Mäusen wurden 24 Stunden, 3 Tage und 7 Tage nach der Operation überwacht (Abbildung 4A,B). Die Daten zeigten, dass Körpergewicht und Temperatur 24 Stunden nach der Operation nur in der Rose Bengal + Beleuchtungsgruppe abnahmen, sich aber in 3 Tagen nach der Operation auf das Niveau der Sham-operierten Tiere erholten.

Um eine Induktion ischämischer Veränderungen zu bestätigen, wurden die Tiere 24 Stunden nach der Operation einem Laser-Imaging-Test unterzogen. Eine Laser-Speckle-Kontrastbildgebung maß die Blutdurchblutung des Kortex für eine Dauer von 1 minute und für jedes Tier wurde ein gemitteltes farbcodiertes Bild erhalten. Dies zeigt, dass Rose Bengal oder Laserbeleuchtung allein keine Läsion erzeugt, während die gleichzeitige Anwendung von Rose Bengal und Laserbeleuchtung eine runde hypoperfundierte Fläche von 4 mm Durchmesser erzeugt, die von einer engen oligemischen Zone umgeben ist (Abbildung 5A). Darüber hinaus ergab eine Cresylviolett- und Tunelfärbung zur Beurteilung des Infarktvolumens 24 h nach der Operation keine Gewebeschäden, weder bei Rose Bengal noch bei Laserbeleuchtungsoperationen. Auf der anderen Seite erzeugte Rose Bengal + Laserbeleuchtung eine gut abgegrenzte Läsion (Abbildung 5B).

Tabelle 1: Allgemeiner Neuroscore. Für jedes der fünf gemessenen allgemeinen Defizite können tiere je nach Schweregrad zwischen 0 und 4 Punkten erhalten. Die Punktzahlen in den fünf Bereichen werden dann summiert, um eine allgemeine Gesamtpunktzahl von 0-18 zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Fokaler Neuroscore. Für jedes der sieben gemessenen allgemeinen Defizite können Tiere je nach Schweregrad zwischen 0 und 4 Punkten erhalten. Die Punktzahlen in den fünf Bereichen werden dann summiert, um eine allgemeine Gesamtpunktzahl von 0-28 zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Figure 1
Abbildung 1: Photothrombose (PT). Diagramm mit dem photothrombotischen Bereich, 3 mm von Bregma entfernt. Der grüne Punkt zeigt die Position des Lasers an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Volumetrische Infarktanalyse und Infarktergebnis 24 h nach PT. (A) Repräsentatives kresylviolett gefärbtes koronalen Gehirn, Schnitte alle 120 μm um 24 h nach PT. Gestrichelte Linien grenzen den Läsionsbereich ab. (B) Infarktvolumenanalyse von 10 Gehirnen (jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Gehirn) 24 h nach PT. Die horizontale rote Linie stellt den Mittelwert dar (29,32 mm3),Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (3,45 mm3)an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Neuroscore für funktionelle Defizite nach PT. Zusammengesetzter Neuroscore vor, 24 h, 3 Tage und 7 Tage nach PT. BL = vor PT, RB = Rose Bengal. n = 5 pro Gruppe. *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Körpergewichts- und Temperaturanalyse nach PT. (A) Körpergewicht und (B) Temperatur waren bei PT-Tieren im Vergleich zu Sham-operierten Gruppen nach 24 h leicht reduziert und erholten sich 3 Tage nach PT. BL = vor PT, RB = Rose Bengal. n = 5 pro Gruppe.*p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Bestätigung der Läsion nach PT. (A) Laser Speckle Imaging (B) Cresyl Violet (obere Panels) und Tunel Staining (untere Panels) bestätigten die Läsion erst nach Verabreichung von Rose Bengal und anschließender Laserbeleuchtung. RB = Rose Bengal. Maßstabsleiste = 1.000 μm im oberen Bereich B, Maßstabsleiste = 20 μm im unteren Bereich B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt das experimentelle Schlaganfallmodell der Photothrombose durch Beleuchtung des intakten Schädels mit einem 561-nm-Laser mit einer vorherigen intraperitonealen Injektion von Rose Bengal. Bis vor kurzem war die Verwendung dieses Modells gering, nimmt aber stetig zu.

Die Mortalität während der Schlaganfallinduktion ist in diesem Modell nicht vorhanden. Die Gesamtmortalität von weniger als 5% entsteht während der Operation aufgrund anästhesiologischer Komplikationen oder Opfer nach Erfüllung der Ausschlusskriterien. Um die geringe Variabilität dieses Modells und seine Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, werden folgende Ausschlusskriterien vorgeschlagen: 1) Betriebszeit länger als 30 min; 2) Infektion der Naht; 3) Bisswunde; und 4) kein Infarkt oder keine Vorasymmetrie bei 24 h nach PT.

Ein weit verbreitetes experimentelles Schlaganfallmodell ist der transiente Verschluss der MCA unter Verwendung eines Nahtfilaments, das in die Arteria carotis interna eingeführt wird, bis die siliziumbeschichtete Spitze den Ursprung der MCA verdeckt. Dieses Modell ermöglicht die Reperfusion durch Entfernen des Filaments und ahmt das klinische Szenario des Menschen nach, in dem es zu einer Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach spontaner oder therapeutischer (rtPA) Lyse eines embolischen Gerinnselskommt 18,19. Es handelt sich jedoch um eine komplexe Operation mit hoher Variabilität des Endinfarkts und hoherMortalitätsrate 10. Im Gegensatz dazu kann der dauerhafte Verschluss der MCA-Distal der Lentikulostriatalarterien durch Koagulation der Arterie20 , 21erreicht werden, die lokal definierte Läsionen im Neokortex22induziert . Obwohl dieses Modell eine niedrigere Sterblichkeitsrate hat, erfordert es eine invasive Operation am Tier durch Trepanation des Schädels über die MCA, um es später zu koagulieren23. Folglich sind hohe chirurgische Fähigkeiten für eine erfolgreiche und unvoreingenommene In-vivo-Schlaganfallstudie erforderlich.

Im Vergleich zu anderen Gehirnischämiemodellen hat das photothrombotische Modell, wie es in diesem Video durchgeführt wird, den Vorteil, dass keine Kraniotomie oder größere Operation am Tier durchgeführt wird, im Gegensatz zu anderen Modellen, die komplexe Operationen oder Gehirnkraniotomie beinhalten. Darüber hinaus macht die einfache Ausführung des Modells die Operation für viele mit geringem Zeitaufwändiger Training zugänglich. Niedrige Mortalität, moderates Infarktvolumen und Flexibilität, um die Läsion in einer bestimmten Gehirnregion zu induzieren, betonen den Vorteil dieses experimentellen Paradigmas für Gehirnregeneration und Schlaganfallstudien24,25,26,27.

Trotz der offensichtlichen Vorteile sollten einige Einschränkungen dieses Schlaganfallmodells berücksichtigt werden. Die lange Exposition von Anästhetika gegenüber dem Tier könnte ein kritischer Faktor sein, der berücksichtigt werden muss, da der Einfluss von Anästhetika auf die Neuroprotektion und das Schlaganfallergebnis bereits bekannt ist28. Obwohl die Dauer dieses chirurgischen Eingriffs etwa 30 Minuten dauert, kann das Tier aufgrund der minimalen Manipulation des Tieres während der 20-minütigen Laserbeleuchtung unter niedrigen Betäubungskonzentrationen sein. Da dieses Modell moderate Hirnverletzungen induziert, sind nur geringe Verhaltensdefizite nachweisbar. Daher sind fortgeschrittenere Testsysteme mit höherer Sensitivität und qualitativen Testparametern, wie der qualifizierte Reaching-Test29 und Neuroscore17,wie hier beschrieben, möglicherweise besser geeignet, um langfristige funktionelle Ergebnisse in diesem Modell zu erkennen. Schließlich kann aufgrund der permanenten Aggregation der Blutplättchen in die beleuchteten Blutgefäße keine Reperfusion erzielt werden, was bei einem erheblichen Prozentsatz der Schlaganfallpatienten aufgrund spontaner Gerinnsellyse oder Therapie beobachtet wird30.

Ein ähnliches phototrombotisches Schlaganfallmodell wurde 2013 von Labat-gest und Tomasi veröffentlicht, das ein PT-Protokoll mit einer Kaltlichtlampe anstelle eines 561 nm grünenLasers 8beschreibt. Sowohl Laser- als auch Kaltlichtquellen können verwendet werden, um die Erregung von Rose Bengal zu induzieren. Ein Vorteil von laserbasierten Lichtquellen gegenüber Kaltlichtlampen ist, dass mit Lasern einzelne Oberflächenarteriolen für die in vivo gefäßspezifische Gerinnung anvisiert werden können31. Obwohl wir nicht auf bestimmte Arteriolen abzielten, verwendeten wir einen grünen 561-nm-Laser für die Gehirnbeleuchtung und Phototrombose-Induktion, da der Rose Bengal Absortion Peak bei 562 nm erreicht wurde. Um eine angemessene Laserintensität während der Beleuchtung zu gewährleisten, wurde die Cobolt Monitor Software-6.1.0.0 zur Kalibrierung des Lasers verwendet. Darüber hinaus war in der vorliegenden Studie eine Rose Bengal Dosierung von 10 μL/g (100 μg/g) ausreichend, um Phototrombose zu induzieren, während das vorherige Protokoll eine höhere Dosis (150 μg/g) berichtete8. Darüber hinaus bietet das Protokoll eine Verhaltensmethode zur Analyse des Schlaganfallergebnisses (Neuroscore) und eine zusätzliche Scheinkontrollgruppe (Laserbeleuchtung), um zu beweisen, dass der Laser selbst keine Gewebeschäden verursacht, so dass nur die Kombination von Rose Bengal + Laserbeleuchtung eine Hirnläsion induziert.

Insgesamt ermöglicht dieser nicht-invasive einfache chirurgische Eingriff eine hohe Reproduzierbarkeit und Richtbarkeit der Schlaganfallläsion zum Gehirn sowie die Möglichkeit einer Langzeitbeobachtung aufgrund minimaler Mortalität. Dieses photothrombotische Schlaganfallmodell zeichnet sich als wertvolles experimentelles Paradigma für die Grundlagen- und translationale Schlaganfallforschung aus.

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Disclosures

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken allen Kooperationspartnern der Immunostroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) für Anregungen und Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie deutschlands im Rahmen des Münchner Clusters für Systemeeurologie (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) und im Rahmen der Stipendien LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 und LL-112/1-1 gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
561 nm wavelenght laser Solna Cobolt HS-03
Acetic Acid Sigma Life Science 695092
Anesthesia system for isoflurane Drager
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100
Bepanthen pomade Bayer 1578681
C57Bl/6J mice Charles River 000664
Collimeter Thorlabs F240APC-A
Cotons NOBA Verbondmitel Danz 974116
Cresyl violet Sigma Life Science C5042-10G
Cryostat Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70% CLN Chemikalien Laborbedorf 521005
Ethanol 96% CLN Chemikalien Laborbedorf 522078
Ethanol 99% CLN Chemikalien Laborbedorf ETO-5000-99-1
Filter paper Macherey-Nagel 432018
Fine Scissors FST 15000-00
Forceps FST 11616-15
Heating blanket FHC DC Temperature Controller  40-90-8D
Isoflurane Abbot B506
Isopentane Fluka 59070
Ketamine Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Speckle Perimed PeriCam PSI HR
Mayor Scissors FST 1410-15
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 Apotheke Innestadt Uni Munchen P32799
Protective glasses Laser 2000 NIR-ZS2-38
Rose Bengal Sigma Aldrich 198250-5G
Roti-Histokit mounting medium Roth 6638.1
Saline solution Braun 131321
Stereomikroskop Zeiss Stemi DV4
Stereotactic frame Stoelting 51500U
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Xylacine Albrecht

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Llovera, G., Pinkham, K., Liesz, A. Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis. J. Vis. Exp. (171), e62536, doi:10.3791/62536 (2021).

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