Summary
מתואר כאן מודל שבץ פוטוטרומבוטי, שבו שבץ מיוצר דרך הגולגולת שלם על ידי גרימת איסור מיקרווסקולרי קבוע באמצעות תאורת לייזר לאחר מתן צבע רגיש לאור.
Abstract
שבץ מוחי הוא גורם המוות המוביל ונכות בוגרת במדינות מפותחות. למרות חקירה מקיפה לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות, נותרו אפשרויות טיפוליות מוגבלות לחולי שבץ. לכן, דרוש מחקר נוסף עבור מסלולים פתופיציולוגיים כגון דלקת לאחר שבץ, אנגיוגנזה, פלסטיות עצבית, והתחדשות. בהתחשב חוסר היכולת של מודלים במבחנה לשחזר את המורכבות של המוח, מודלים שבץ ניסיוני חיוניים לניתוח והערכה מאוחרת יותר של מטרות תרופות חדשניות עבור מנגנונים אלה. בנוסף, מודלים סטנדרטיים מפורטים לכל ההליכים נדרשים בדחיפות כדי להתגבר על מה שמכונה משבר השכפול. כמאמץ בתוך קונסורציום המחקר ImmunoStroke, מודל עכבר פוטותרמיבוטי סטנדרטי באמצעות הזרקה תוך-אישית של רוז בנגל והארת הגולגולת שלם עם לייזר 561 ננומטר מתואר. מודל זה מאפשר את הביצועים של שבץ בעכברים עם הקצאה לכל אזור קליפת המוח של המוח ללא ניתוח פולשני; ובכך, המאפשר את המחקר של שבץ באזורים שונים של המוח. בסרטון זה מודגמות השיטות הכירורגיות של אינדוקציה של שבץ במודל הפוטו-טרומבוטי יחד עם ניתוח היסתולוגי.
Introduction
שבץ איסכמי נותר סיבת המוות העיקרית ורכש נכות בוגרת במדינות המפותחותבמאה ה -21 היוו כ -2.7 מיליון מקרי מוות בשנת 2017 ברחבי העולם1. אפילו עם המאמצים העצומים של הקהילה המדעית, טיפולים מעטים זמינים. יתר על כן, עם קריטריוני הדרה גבוהים כאלה, אפשרויות מוגבלות אלה כבר אינן נגישות לחולים רבים, וכתוצאה מכך צורך דחוף בטיפולים חדשניים כדי לשפר את ההתאוששות התפקודית לאחר שבץ.
בהתחשב ביכולת של מודלים במבחנה לשכפל את האינטראקציות המורכבות של המוח, מודלים של בעלי חיים חיוניים למחקר שבץ פרה-אקליני. עכברים הם המודל החייתי הנפוץ ביותר בתחום חקר השבץ. רוב מודלי העכבר האלה שואפים לגרום אוטמים על ידי חסימת זרימת הדם בתוך העורק המוחי האמצעי (MCA) שכן רוב נגעי שבץ אנושיים ממוקמים בשטח MCA2. למרות מודלים אלה טוב יותר recapitulate נגעים שבץ אנושי, הם כרוכים ניתוחים convulated עם שונות נפח אוטם גבוהה.
מאז ההצעה של רוזנבלום ואל-סבן של המודל הפוטו-טרומבוטי בשנת 19773, ומאוחר יותר היישום של מודל זה לחולדות ווטסון ואח'4, זה הפך להיות בשימוש נרחב במחקר שבץ איסכמי5,6. מודל השבץ הפוטו-טרומבוטי גורמת לאוטם קליפת המוח המקומי והמוגדר כתוצאה מפוטואקטיבציה של צבע רגיש לאור שהוזרק בעבר לזרימת הדם. זה גורם פקקת מקומית של כלי הדם באזורים החשופים לאור. בקצרה, עם חשיפה לאור מן הצבע הרגיש לאור מוזרק, פגיעה חמצונית מקומית של קרום התא אנדותל מושרה, מה שמוביל צבירה טסיות דם היווצרות פקקת, ואחריו הפרעה מקומית של זרימת הדם המוחי7.
היתרון העיקרי של טכניקה זו שקוע בפשטות הביצוע שלה ובאפשרות לכוון את הנגע לאזור הרצוי. שלא כמו מודלים אחרים של שבץ ניסיוני, יש צורך במומחיות כירורגית קלה כדי לבצע את מודל השבץ הפוטו-טרומבוטי מכיוון שהניכוע מושרה באמצעות הארת הגולגולת של שלמה. יתר על כן, הגבולות המופרדים היטב (איור 2A ואיור 5B) והגמישות לגרום לפגיעה באזור מוח מסוים יכולים להקל על חקר התגובות התאיות באזור קליפת המוח האיסכמי או השלם8. מסיבות אלה, גישה זו מתאימה לחקר מנגנונים תאיים ומולקולריים של פלסטיות קליפת המוח.
במהלך העשורים האחרונים, החשש הגובר לגבי חוסר רבייה בין קבוצות מחקר נטבע מה שנקרא משברשכפול 9. לאחר התיאום של מחקר ניסוי רב מרכזי מבוקר פרה קליני הראשון בשנת 201510, כלי מוצע לשיפור המחקר הקדם קליני11,12,13, אושר כי סיבה אחת לשכפול נכשל בין מחקרים פרה קליניים ממעבדות עצמאיות היה היעדר תקינה מספקת של מודלים שבץ ניסיוני ופרמטריתוצאה 14. בהתאם, כאשר הוקם קונסורציום ImmunoStroke (https://immunostroke.de/), שיתוף פעולה שמטרתו להבין אינטראקציות בין המוח לחיסון שבבסיס העקרונות המכניסטיים של התאוששות שבץ, התקינה של כל מודלי השבץ הניסיוניים בין כל קבוצת מחקר הייתה חיונית.
מתואר כאן ההליך הסטנדרטי עבור אינדוקציה של המודל photothrombotic כפי המשמש קונסורציום המחקר הנ"ל. בקצרה, בעל חיים עבר הרדמה, קיבל זריקת רוז בנגלית (10 μL/g) תוך-איטראטון, והגולגולת שלם, 3 מ"מ שנותרה ברגמה, הוארה מיד על ידי לייזר 561 ננומטר במשך 20 דקות(איור 1). בנוסף, דווח על שיטה היסתולוגית והתנהגותית קשורה לניתוח תוצאת השבץ במודל זה. כל השיטות מבוססות על נהלי הפעלה סטנדרטיים שפותחו ונעשה בהם שימוש במעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים שדווחו בסרטון זה נערכו על פי ההנחיות הלאומיות לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים, והפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדות הממשלתיות הגרמניות (Regierung von Oberbayern, מינכן, גרמניה). העכברים ששימשו במחקר זה היו עכברי C57Bl/6J זכרים, בני 10-12 שבועות, ונשלחו על ידי צ'ארלס ריבר גרמניה. בעלי החיים שוכנו בטמפרטורות מבוקרות (22 °C (22 °C (2 °F) ± 2 °C (50 °F), עם תקופת מחזור 12 שעות בהיר כהה וגישה למזון גלולה ומים ad libitum.
1. הכנת החומר והמכשירים
- להמיס רוז בנגלי 0.9% תמיסת מלח כדי להגיע לריכוז הסופי של 10 מ"ג/מ"ל. חבר את שמיכת החום כדי לשמור על אזור הפעולה חם ולשמור על טמפרטורת גוף העכבר במהלך הרדמה ב 37 °C (50 °F).
- הכן מספריים, מלקחיים, חתיכות כותנה, משחת עיניים dexpanthenol, וחומר תפר. הכן מזרק עם תמיסת מלח (ללא מחט) כדי לשמור על אזור הפעולה hydrated. הכן את גז ההרדמה (100% O2 + איזופלוריין).
2. הכנת החיה
- הזריקו למרד נטל 30 דקות לפני הניתוח (4 מ"ג/ק"ג קרפפן ו-0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין).
- הקלט את משקל גוף העכבר כדי להתאים את המינון של רוז בנגל להיות מוזרק (10 μL / g כלומר, 100 מיקרוגרם / גרם).
- מניחים את העכבר בתא האינדוקציה עם קצב זרימת איזופלוראן של 4% כדי להרגיז אותו עד שהתנועה הספונטנית של הגוף והוויבריס מפסיקה.
- העבר את העכבר לתוך המסגרת סטריאוטקטית ומניחים אותו במצב נוטה עם האף שלו לתוך מסכת ההרדמה. תקן את החיה ולשמור על ריכוז איזופלוראן ב 4% במשך 1 דקות. לאחר מכן להפחית ולשמור על ריכוז איזופלוראן ב 2%.
- הכנס בעדינות את הבדיקה רקטלית כדי לפקח על הטמפרטורה לאורך כל ההליכים הכירורגיים. הגדר את כרית החימום המשויכת לשליטת משוב כדי לשמור על טמפרטורת גוף העכבר ב 37 °C (50 °F).
- יש למרוח משחת עיניים של דקספנינול על העיניים ולנקות את העור ואת הפרווה שמסביב עם חומר חיטוי.
3. מודל פוטותרומבוזיס
- בצע 2.0-2.5 ס"מ אורך ותפרוש כדי לחשוף את הגולגולת. בצע את החשיפה לגולגולת עם חתך אחד כדי למנוע סיבוכים פצע.
- הסר את periosteum בעדינות עם כותנה ולזהות את התפרים קורונל.
- הרכיבו את משקפי המגן, הפעילו את הלייזר 561 ננומטר וסמן את ברגמה +3 מ"מ שמאלה.
- מכבים את הלייזר, מצמידים מדבקה עם חור בקוטר 4 מ"מ המונח בקואורדינטות המסומנות שהוזכרו לעיל.
- הזרק את העכבר עם ורד בנגלי (10 μL / g), תוך איפריטונית. מניחים את קרן הלייזר ב-4-5 ס"מ מהגולגולת, מפעילים את הלייזר 561 ננומטר ומאירים את הגולגולת למשך 20 דקות.
- החל שתי טיפות של 0.9% מלוחים על הגולגולת כדי rehydrate, לתפר את הפצע, ולהניח את החיה בתא התאוששות ב 37 °C (50 °F) כדי להתאושש הרדמה. לאחר שעה, החזירו את העכברים לכלובים שלהם בחדר מבוקר טמפרטורה.
- הזריקו מזרקי כל 12 שעות במשך 3 ימים לאחר הניתוח (4 מ"ג/ק"ג קרפפן ו-0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין).
4. פעולת זיוף
- בצע שני הליכים שונים של פעולות שיים כמתואר בשלבים 4.1.1 ו 4.1.2.
- בצע את כל ההליכים באופן זהה לפעולה המתוארת לעיל. הזריקו לרוז בנגל בלי להדליק את הלייזר. לאחר 20 דקות תחת הרדמה, לאפשר לבעלי החיים להישאר בתא ההתאוששות במשך 1 שעה להתאושש, לפני שהוחזרו לכלובים שלהם.
- בצע את כל ההליכים באופן זהה לפעולה המתוארת לעיל, הפעלת הלייזר. אל תזריק לרוז בנגל. לאחר 20 דקות של תאורת לייזר, לאפשר לבעלי החיים להישאר בתא ההתאוששות במשך 1 שעות להתאושש מהרדמה, לפני שהוחזרו לכלובים שלהם.
5. כתמי לייזר
- חבר את השמיכה המחוממת כדי לשמור על אזור הפעולה חם ולשמור על טמפרטורת גוף העכבר במהלך הרדמה ב 37 °C (50 °F).
- מניחים את העכבר לתוך תא האינדוקציה עם קצב זרימת איזופלוראן של 4% כדי להרדים אותו עד התנועה הספונטנית של הגוף ו vibrissae מפסיק ולאחר מכן להעביר את העכבר לתוך המסגרת סטריאוטקטית.
- מניחים את העכבר בתנוחה נוטה עם האף שלו לתוך מסכת ההרדמה. תקן את החיה ולשמור על ריכוז איזופלוראן ב 4% במשך 1 דקות. תרנגולת T להפחית ולשמור אותו ב 2%.
- הכנס בעדינות את הבדיקה רקטלית כדי לפקח על הטמפרטורה לאורך כל ההליכים הכירורגיים. הגדר את כרית החימום המשויכת מבוקרת משוב כדי לשמור על טמפרטורת גוף העכבר ב 37 °C ולהחיל משחת עיניים dexpanthenol על שתי העיניים. נקו את העור ואת הפרווה שמסביב עם חומר חיטוי.
- בצע 2.0-2.5 ס"מ אורך ותפרוש כדי לחשוף את הגולגולת. בצע את החשיפה לגולגולת עם חתך אחד כדי למנוע סיבוכים פצע.
- מניחים את המסגרת הסירוטקטית מתחת לכתם הלייזר ומתאימים את הגובה כדי לקבל תמונה חדה. מקד את מצלמת הדמיית זלוף כתמי הלייזר (LSI) בחלון הגולגולת. הגדר את מערכת המצלמה של הדמיית כתמי לייזר ברזולוציה גבוהה (LSI) כפי שתואר בעבר15.
- השג נתונים משדה ראייה בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ באמצעות לייזרים 785 ננומטר ו- 80 mW עם קצב פריימים של 21 תמונות/ s במרחק עבודה של 1 ס"מ למשך דקה אחת.
- לאחר הדמיה, להחיל שתי טיפות של 0.9% מלוחים לגולגולת כדי rehydrate, לתפר את הפצע ולהניח את החיה בתא התאוששות ב 37 °C (50 °F) כדי להתאושש הרדמה במשך 1 שעות. לאחר שעה, החזירו את העכברים לכלובים שלהם בחדר מבוקר טמפרטורה.
6. נוירוסקופ
הערה: עבור ניתוח הגירעון הנוירולוגי, קנה מידה נוירולוגי שונה שפורסם על ידי אקנשטיין ואח 'בשנת 1997 משמש15.
- ציון בעלי החיים עבור כללי(טבלה 1)וריעונות מוקד(טבלה 2). קנה מידה מרוכבים זה נע בין 0 (ללא גירעונות) ל -46 (ליקויים חמורים).
- בצע את המוח באותו זמן בכל יום ולהשתמש בבגדים כירורגיים כדי לשמור על ריח נייטרלי.
- להרגיל את העכברים במשך 30 דקות בחדר עם כלוב פתוח לפני הבדיקה ולאפשר להם להתבונן בכל פריט במשך 30 s.
7. זלוף
- הכן מזרק 20 מ"ל המכיל PBS-הפרין (2 U/mL) והנח אותו 1 מ 'מעל הספסל כדי להקל / להבטיח זלוף מונחה כבידה.
- הזריקו תוך-איפריטונית 100 מיקרו-אל של קטמין וקסילאצין (120/16 מ"ג/ק"ג משקל גוף, בהתאמה). המתן 5 דקות ולאשש את הפסקת תנועת הגוף הספונטנית והוויבריס.
- תקן את החיה בתנוחת על-גוף וחטא את פני גוף הבטן עם 100% אתנול. לעשות 3 ס"מ אורך ין בבטן; חותכים את הסרעפת ואת הצלעות כדי לדמיין לחלוטין את הלב.
- לעשות החלפה קטנה באטריום הימני ולהכניס את צינורית זלוף לתוך החדר השמאלי ולפרוח עם 20 מ"ל PBS-הפרין.
- לאחר זלוף, לערוף את ראש החיה ולהסיר את המוח, להקפיא אותו באמצעות קרח יבש ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
8. נפח אוטם
- Cryosectioning: לחתוך את המוח באופן סדרתי על cryostat ל 20 קטעים בעובי 20 מיקרומטר כל 120 מיקרומטר ולהרכיב על שקופיות. אחסן את השקופיות ב- -80 °C (70 °F) עד לעיבוד נוסף.
- כתם סגול קרסיל (קורות)
- כדי להכין את פתרון הכתמים, לערבב 0.5 גרם של אצטט CV ב 500 מ"ל של H2O. מערבבים וחום (60 °C) עד הגבישים נמסים. אפשר לפתרון להתקרר ולאחסן אותו בבקבוק כהה. מחממים ל-60 °C ומסננים (מסנן נייר) לפני כל שימוש.
- יבש את השקופיות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מניחים אותם ב 95% אתנול במשך 15 דקות, ואחריו 70% אתנול במשך 1 דקות, ולאחר מכן ב 50% אתנול במשך 1 דקות.
- מניחים את המגלשות במים מזוקקים במשך 2 דקות, מרעננים את המים המזוקקים ומניחים את המגלשות במים שוב במשך דקה אחת. לאחר מכן, מניחים את השקופיות בתמיסת הכתמים המחוממת מראש למשך 10 דקות בשעה 60 מעלות צלזיוס. לשטוף את המגלשות פעמיים במים מזוקקים במשך 1 דקות.
- מניחים את השקופיות ב 95% אתנול במשך 2 דקות. ואז למקם אותם לתוך 100% אתנול במשך 5 דקות, לרענן את 100% אתנול ומניחים את השקופיות 100% אתנול שוב במשך 2 דקות. לאחר מכן, לכסות את השקופיות עם מדיום הרכבה.
- ניתוח: לסרוק את השקופיות ולנתח את נפח האוטם העקיף בשיטת סוונסון16 כדי לתקן בצקת: אזור איסכמי = (אזור איסכמי)-((חצי הכדור האיסיליטרלי) - (חצי הכדור הנגדי)).
9. כתמי טיונל(בערכת זיהוי אפופטוזיס במקום)
- יבש את השקופיות, לאחר תיקון ב 4% paraformaldehyde ב PBS (ph 7.4) במשך 10-20 דקות ב RT. לשטוף ב PBS, לאחר תיקון באתנול מכופתר מראש: חומצה אצטית 2:1 במשך 5 דקות ב -20 °C (5 °F).
- לשטוף PBS ולהחיל חוצץ שיווי משקל (10 s עד למקסימום של 60 דקות ב RT) ולהחיל אנזים TdT כוח עבודה (1 שעות ב 37 °C בתא לח)
- החלת כוח עבודה להפסיק / לשטוף אנזים (10 דקות ב RT), לשטוף PBS ולהחיל מחומם (RT) כוח עבודה נגד דיגוקסיגנין מצומד (30 דקות ב RT בחושך)
- לשטוף PBS, דגירה עם DAPI במשך 5 דקות ב RT ולהעלות את השקופיות עם מדיה פלואורומאונט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המודל המתואר כאן הוא מודל שבץ פוטותרמי על ידי הזרקת רוז בנגל ותאורה גולגולת שלם במשך 20 דקות, אורך גל קבוע 561 ננומטר וכוח פלט 25 mW בסיבים. למרות הניתוח הפוטו-טרומבוטי המלא נמשך 30 דקות, החיה נשמרת תחת הרדמה נמוכה והנזק המוחי מתון. כעשר דקות לאחר ההעברה לכלובים שלהם, כל בעלי החיים היו ערים, נעו בחופשיות בכלוב ותקשרו עם המלטה.
נפח אוטם בוצע באמצעות קרסיל סגול סגול מוכתם מקטעי מוח קורונל סדרתי 24 שעות לאחר אינדוקציה שבץ (איור 2A). נפח האוטם הממוצע היה 29.3 מ"מ3, המייצג 23% של חצי הכדור במוח אחד. יתר על כן, השונות של מודל שבץ זה נמוכה במיוחד עם סטיית תקן של כ -3.5% (איור 2B). אזור הנגע מקיף את קליפת המוח המוטורית ללא חיבה למבנים תת-קורטיטיים.
פוטותרומבוזיס גרם לליקוי חושי מתון וארוך טווח, המצוין על ידי המוח המורכב17 (איור 3); ליקויים כלליים ומוקדיים נמדדו 24 שעות, 3 ימים ו -7 ימים לאחר הניתוח. Neuroscore הכללי יש חמישה פריטים, כולל הערכה של הפרווה, אוזניים, עיניים, יציבה, ופעילות ספונטנית, עם ציון מקסימלי של 18 (טבלה 1). מוקד Neuroscore כולל שבעה פריטים, כולל הערכה של סימטריית הגוף, הליכה, טיפוס, התנהגות חגה, סימטריה ראשונה, רכיבה על אופניים חובה, תגובה שפם, עם ציון מקסימלי של 28(טבלה 2). בעלי חיים שבץ היה שינוי משמעותי נוירו-score מורכב 24 שעות לאחר הניתוח לעומת בעלי חיים המופעלים על ידי שיים. הבדלים אלה נמשכו, אם כי עכברי שבץ השתפרו עם הזמן(איור 3).
התמותה בזמן התצפית מתרחשת לעתים רחוקות אצל 1-2% מבעלי החיים. בדו"ח זה, אף אחד מעשרת בעלי החיים שנחקרו לא היה צריך להיות מוחרג וכולם שרדו את תקופת התצפית בת 7 הימים. משקל הגוף ושינויי הטמפרטורה בעכברים היו במעקב של 24 שעות, 3 ימים ו-7 ימים לאחר הניתוח (איור 4A,B). הנתונים הראו כי משקל הגוף והטמפרטורה ירדו 24 שעות לאחר הניתוח רק בקבוצת רוז בנגל + תאורה, אבל התאושש לרמה של בעלי חיים המופעלים בשאם ב 3 ימים לאחר הניתוח.
כדי לאשר אינדוקציה של שינויים איסכמיים, 24 שעות לאחר הניתוח, בעלי החיים עברו בדיקת הדמיית לייזר. הדמיית ניגודיות כתמי לייזר מדדה זלוף דם של קליפת המוח למשך דקה אחת ותמונה מקודדת בצבע בממוצע הושגה עבור כל בעל חיים. זה מדגים כי רוז בנגלי או תאורת לייזר לבד אינו מייצר נגע, בעוד יישום בו זמנית של רוז בנגל ותאורה לייזר מייצר שטח hypoperfused עגול של 4 מ"מ מוקף אזור אוליגמי צר (איור 5A). בנוסף, כתם סגול קרסיל ולטינה להערכת נפח האוטם 24 שעות לאחר הניתוח לא גילה נזק לרקמות לא ברוז בנגל או בניתוחי תאורת לייזר. מצד שני, רוז בנגל + תאורת לייזר יצרה נגע תפיר היטב(איור 5B).
טבלה 1: מדע מוח כללי. עבור כל אחד מחמשת הגירעונות הכלליים הנמדדים, בעלי חיים יכולים לקבל בין 0 ל -4 נקודות בהתאם לחומרה. לאחר מכן, הציונים בחמשת האזורים מסתכמים כדי לספק ציון כללי כולל הנע בין 0-18. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: מוקד נוירוסקופ. עבור כל אחד משבעת הגירעונות הכלליים הנמדדים, בעלי חיים יכולים לקבל בין 0 ל -4 נקודות בהתאם לחומרה. לאחר מכן הציונים בחמשת האזורים מסוכמים כדי לספק ציון כללי כולל הנע בין 0-28. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איור 1: פוטותרומבוזיס (PT). דיאגרמה המתארת את האזור הפוטו-טרומבוטי, 3 מ"מ מברזמה. הנקודה הירוקה מציינת את מיקום הלייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח אוטם נפחי ותוצאה אוטם 24 שעות לאחר PT. (A)נציג cresyl סגול מוכתם מוח קורוניל, קטעים כל 120 מיקרומטר ב 24 שעות לאחר PT. קווים מקווקו לתייג את אזור הנגע. (B)ניתוח נפח אוטם של 10 מוחות (כל נקודה המייצגת מוח בודד אחד) 24 שעות לאחר PT. הקו האדום האופקי מייצג את הממוצע (29.32 מ"מ3), סרגלי שגיאה מציינים סטיית תקן (3.45 מ"מ3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדעי המוח לגירעונות תפקודיים לאחר PT. נוירוסקופ מרוכבים לפני, 24 שעות, 3 ימים, ו 7 ימים לאחר PT. BL = לפני PT, RB = רוז בנגל. n = 5 לכל קבוצה. *p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: משקל הגוף וניתוח הטמפרטורה לאחר PT. (A)משקל הגוף והטמפרטורה(B)הופחתו מעט בבעלי חיים PT בהשוואה לקבוצות המופעלות על ידי שיים בשעה 24 שעות והתאוששו 3 ימים לאחר PT. BL = לפני PT, RB = רוז בנגל. n = 5 לכל קבוצה.*p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אישור נגע לאחר PT. (A)הדמיית כתמי לייזר (B)סיגלית קרסיל (לוחות עליונים) וכתמי טיונלי (לוחות תחתונים) אישרו את הנגע רק לאחר מתן רוז בנגל ותאורה לייזר לאחר מכן. ר.ב = רוז בנגל. סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר בחלונית העליונה B, סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר בחלונית התחתונה B. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג מתאר את מודל השבץ הניסיוני של פוטותרומבוזיס על ידי הארת הגולגולת שלם בלייזר 561 ננומטר, עם זריקה תוך-אישית קודמת של רוז בנגל. עד לאחרונה, השימוש במודל זה היה נמוך אך גדל בהתמדה.
התמותה במהלך אינדוקציה שבץ במודל זה נעדרת. התמותה הכוללת של פחות מ -5% מתעוררת במהלך הניתוח עקב סיבוכים מרדימים או הקרבה לאחר עמידה בקריטריוני ההדרה. כדי להצדיק את השונות הנמוכה של מודל זה ואת יכולת הרבייה שלו, מוצעים קריטריוני החרגה הבאים: 1) זמן פעולה ארוך מ - 30 דקות; 2) זיהום של התפר; 3) פצע נשיכה; ו-4) אין אוטם או לא אסימטריה מקדימה בשעה 24 שעות לאחר PT.
מודלים שבץ ניסיוני בשימוש נרחב הוא החסימה החולפת של MCA, באמצעות חוט תפר, אשר מוצג בעורק הראשי הפנימי עד קצה מצופה סיליקון אוסם את מקורו של MCA. מודל זה מאפשר reperfusion על ידי הסרת חוט ומחקה את התרחיש הקליני האנושי, שבו יש שחזור של זרימת הדם המוחי לאחר תמה ספונטנית או טיפולית (rtPA) של קריש תסחיף18,19. עם זאת, זה כרוך בניתוח מורכב עם שונות גבוהה של אוטם הסופי ושיעור תמותה גבוה10. לעומת זאת, החסימות הקבועות של דיסטל MCA של העורקים lenticulostriatal ניתן להשיג על ידי קרישה של העורק20,21, אשר גורמת נגעים המוגדרים באופן מקומי neocortex22. למרות מודל זה יש שיעור תמותה נמוך יותר, זה דורש ניתוח פולשני לחיה על ידי trepanation של הגולגולת מעל MCA מאוחר יותר קרישה זה23. כתוצאה מכך, מיומנויות כירורגיות גבוהות נדרשות למחקר מוצלח ובלתי משוחד בשבץ ויו.
בהשוואה למודלים אחרים של איסכמיה במוח, למודל הפוטותרמי כפי שבוצע בסרטון זה אין יתרון של אין גולגולת או ניתוח גדול על החיה, בניגוד למודלים אחרים הכוללים ניתוחים מורכבים או גולגולת במוח. יתר על כן, הביצוע הפשוט של המודל הופך את הניתוח לנגיש לרבים עם הכשרה נמוכה הגוזלת זמן רב. תמותה נמוכה, נפח אוטם מתון וגמישות לגרום לפגיעה לאזור מוח מסוים, מדגישים את היתרון של פרדיגמה ניסיונית זו להתחדשות המוח ולמחקרי שבץ24,25,26,27.
למרות היתרונות הברורים, יש לקחת בחשבון כמה מגבלות של מודל שבץ זה. החשיפה הארוכה של הרדמה לחיה עשויה להיות גורם קריטי לקחת בחשבון, כמו ההשפעה של הרדמה על neuroprotection ותוצאות שבץ כבר ידוע28. למרות שמשך ההליך הכירורגי הזה לוקח כ -30 דקות, החיה יכולה להיות תחת ריכוזי הרדמה נמוכים בשל המניפולציה המינימלית של החיה במהלך 20 דקות של תאורת לייזר. מכיוון שמודל זה גורמת לפגיעות מוחיות מתונות, ניתן לזהות רק ליקויים התנהגותיים קלים. לכן, מערכות בדיקה מתקדמות יותר עם רגישות גבוהה יותר ופרמטרים לבדיקה איכותית, כגון מבחן הגעה מיומן29 ו Neuroscore17, כפי שתואר כאן, אולי מתאים יותר לאיתור תוצאות תפקודיות לטווח ארוך במודל זה. לבסוף, בשל הצבירה הקבועה של טסיות הדם לתוך כלי הדם המוארים, לא ניתן להשיג רפרפוזיה, שהיא תכונה שנצפתה באחוז ניכר של חולי שבץ עקב תמה קריש ספונטני או טיפול30.
מודל שבץ פוטוטרומבוטי דומה פורסם בשנת 2013 על ידי Labat-gest ו- Tomasi, המתאר פרוטוקול PT באמצעות מנורת אור קר במקום לייזר ירוק 561 ננומטר8. הן לייזר והן מקורות אור קר יכול לשמש כדי לגרום רוז בנגל עירור. יתרון של מקורות אור מבוססי לייזר על פני מנורות אור קר הוא כי לייזרים ניתן להשתמש כדי למקד arterioles פני השטח בודדים עבור קרישה ספציפית כלי vivo 31. למרות שלא התמקדנו בעורקים ספציפיים, השתמשנו בלייזר ירוק 561 ננומטר עבור אינדוקציה של תאורת המוח ופוטוטרומביוזיס, בגלל פסגת ההימנעות של רוז בנגל ב-562 ננומטר. כדי להבטיח עוצמת לייזר נאותה במהלך התאורה, תוכנת Cobolt Monitor-6.1.0.0 שימשה לכיול הלייזר. יתר על כן, במחקר הנוכחי מינון רוז בנגל של 10 μL/g (100 מיקרוגרם/g) היה מספיק כדי לגרום פוטוטרומבוזיס, בעוד הפרוטוקול הקודם דיווח על מינון גבוה יותר (150 מיקרוגרם/g)8. בנוסף, הפרוטוקול מספק שיטה התנהגותית לניתוח תוצאת השבץ (Neuroscore) וקבוצת בקרת זיוף נוספת (תאורת לייזר) על מנת להוכיח כי הלייזר עצמו אינו מייצר נזק לרקמות, ולכן רק השילוב של רוז בנגל + תאורת לייזר גורם לפגיעה במוח.
בסך הכל, הליך כירורגי פשוט לא פולשני זה מאפשר רבייה גבוהה והכיווניות של נגע שבץ למוח לצד האפשרות של תצפית ארוכת טווח עקב תמותה מינימלית. מודל שבץ פוטותרומבוטי זה נבדל כפרדיגמה ניסיונית רבת ערך למחקר שבץ בסיסי ותרגום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לכל שותפינו לשיתוף הפעולה של קונסורציום אימונוסטרוק (עבור 2879, מתאי מערכת החיסון ועד להתאוששות שבץ) על הצעות ודיונים. עבודה זו מומנה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) במסגרת אשכול מינכן לנוירולוגיה של מערכות (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) ותחת המענקים LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 ו- LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
- Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
- Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).
