Summary
Qui è descritto il modello di ictus fototrombotico, in cui un ictus viene prodotto attraverso il cranio intatto inducendo l'occlusione microvascolare permanente utilizzando l'illuminazione laser dopo la somministrazione di un colorante fotosensibile.
Abstract
L'ictus è una delle principali cause di morte e disabilità acquisita negli adulti nei paesi sviluppati. Nonostante un'ampia indagine per nuove strategie terapeutiche, rimangono limitate opzioni terapeutiche per i pazienti con ictus. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per i percorsi fisiopatologici come l'infiammazione post-ictus, l'angiogenesi, la plasticità neuronale e la rigenerazione. Data l'incapacità dei modelli in vitro di riprodurre la complessità del cervello, i modelli sperimentali di ictus sono essenziali per l'analisi e la successiva valutazione di nuovi bersagli farmacologici per questi meccanismi. Inoltre, sono urgentemente necessari modelli standardizzati dettagliati per tutte le procedure per superare la cosiddetta crisi della replica. Come sforzo all'interno del consorzio di ricerca ImmunoStroke, viene descritto un modello murino fototrombotico standardizzato che utilizza un'iniezione intraperitoneale di Rose Bengal e l'illuminazione del cranio intatto con un laser a 561 nm. Questo modello consente l'esecuzione di ictus nei topi con allocazione a qualsiasi regione corticale del cervello senza chirurgia invasiva; quindi, consentendo lo studio dell'ictus in varie aree del cervello. In questo video, vengono dimostrati i metodi chirurgici di induzione dell'ictus nel modello fototrombotico insieme all'analisi istologica.
Introduction
L'ictus ischemico rimane una delle principali cause di morte e disabilità acquisita negli adulti nei paesi sviluppati nel 21° secolo, rappresentando circa 2,7 milioni di morti nel 2017 in tutto il mondo1. Anche con gli immensi sforzi della comunità scientifica, sono disponibili pochi trattamenti. Inoltre, con criteri di esclusione così elevati, queste opzioni già limitate non sono accessibili a molti pazienti, con conseguente urgente necessità di nuovi trattamenti per migliorare il recupero funzionale dopo l'ictus.
Considerando l'incapacità dei modelli in vitro di replicare le complesse interazioni del cervello, i modelli animali sono essenziali per la ricerca preclinica sull'ictus. I topi sono il modello animale più frequentemente utilizzato nel campo della ricerca sull'ictus. La maggior parte di questi modelli murini mira a indurre infarti bloccando il flusso sanguigno all'interno dell'arteria cerebrale media (MCA) poiché la maggior parte delle lesioni umane da ictus si trova nel territorio MCA2. Sebbene questi modelli ricapitolino meglio le lesioni umane dell'ictus, coinvolgono interventi chirurgici convulsi con elevata variabilità del volume dell'infarto.
Dalla proposta di Rosenblum e El-Sabban del modello fototrombotico nel 1977 3 , e successivamentel'applicazionedi questo modello ai ratti Watson et al.4, è diventato ampiamente utilizzato nella ricercasull'ictusischemico 5,6. Il modello di ictus fototrombotico induce un infarto corticale locale e definito a seguito della fotoattivazione di un colorante sensibile alla luce precedentemente iniettato nel flusso sanguigno. Ciò causa trombosi locale dei vasi nelle aree esposte alla luce. In breve, dopo l'esposizione alla luce del colorante fotosensibile iniettato, viene indotta una lesione ossidativa localizzata della membrana cellulare endoteliale, che porta all'aggregazione piastrinica e alla formazione di trombi, seguita da un'interruzione locale del flusso sanguigno cerebrale7.
Il vantaggio principale di questa tecnica risiede nella sua semplicità di esecuzione e nella possibilità di dirigere la lesione verso la regione desiderata. A differenza di altri modelli sperimentali di ictus, è necessaria una minore esperienza chirurgica per eseguire il modello di ictus fototrombotico poiché la lesione viene indotta attraverso l'illuminazione del cranio intatto. Inoltre, i bordi ben delimitati(Figura 2A e Figura 5B)e la flessibilità di indurre la lesione in una specifica regione del cervello possono facilitare lo studio delle risposte cellulari all'interno dell'area corticale ischemica o intatta8. Per questi motivi, questo approccio è adatto per lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari della plasticità corticale.
Negli ultimi decenni, la crescente preoccupazione per la mancanza di riproducibilità tra i gruppi di ricerca è stata coniata la cosiddetta crisi di replicazione9. Dopo il coordinamento del primo studio preclinico randomizzato controllato multicentrico nel 201510,uno strumento proposto per migliorare la ricerca preclinica11,12,13,è stato confermato che una delle cause della mancata riproducibilità tra studi preclinici di laboratori indipendenti era la mancanza di una sufficiente standardizzazione dei modelli sperimentali di ictus e dei parametri di esito14. Di conseguenza, quando è stato istituito il consorzio ImmunoStroke (https://immunostroke.de/), una collaborazione che mira a comprendere le interazioni cervello-immunità alla base dei principi meccanicistici del recupero dell'ictus, la standardizzazione di tutti i modelli sperimentali di ictus tra ciascun gruppo di ricerca era essenziale.
Qui è descritta la procedura standardizzata per l'induzione del modello fototrombotico utilizzata nel suddetto consorzio di ricerca. In breve, un animale è stato sottoposto ad anestesia, ha ricevuto un'iniezione di Rose Bengal (10 μL / g) per via intraperitonale e il cranio intatto, a 3 mm dalla bregma, è stato immediatamente illuminato da un laser a 561 nm per 20 minuti (Figura 1). Inoltre, viene riportato un metodo istologico e comportamentale correlato per analizzare l'esito dell'ictus in questo modello. Tutti i metodi si basano su procedure operative standard sviluppate e utilizzate in laboratorio.
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Protocol
Gli esperimenti riportati in questo video sono stati condotti secondo le linee guida nazionali per l'uso di animali da esperimento e i protocolli sono stati approvati dai comitati governativi tedeschi (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania). I topi utilizzati in questo studio erano topi maschi C57Bl / 6J, di 10-12 settimane, e inviati da Charles River Germany. Gli animali sono stati alloggiati a temperatura controllata (22 °C ± 2 °C), con un ciclo luce-buio di 12 ore e accesso a cibo e acqua pelletati ad libitum.
1. Preparazione del materiale e degli strumenti
- Sciogliere Rose Bengal in soluzione salina allo 0,9% per raggiungere una concentrazione finale di 10 mg/ml. Collegare la termocoperta per mantenere calda l'area operativa e mantenere la temperatura corporea del mouse durante l'anestesia a 37 °C.
- Preparare forbici, pinza, pezzi di cotone, unguento per gli occhi di dexpantenolo e materiale di sutura. Preparare una siringa con soluzione salina (senza ago) per mantenere idratata l'area operatoria. Preparare il gas di anestesia (100% O2 + isoflurano).
2. Preparazione dell'animale
- Iniettare analgesia 30 minuti prima dell'intervento chirurgico (4 mg/kg di carprofene e 0,1 mg/kg di buprenorfina).
- Registrare il peso corporeo del topo per regolare la dose di Rose Bengal da iniettare (10 μL/g cioè 100 μg/g).
- Posizionare il topo nella camera di induzione con una portata isoflurano del 4% per anestetizzarlo fino a quando il movimento spontaneo del corpo e delle vibrisse si ferma.
- Trasferire il mouse nella cornice stereotassica e posizionarlo in posizione prona con il naso nella maschera di anestesia. Fissare l'animale e mantenere la concentrazione di isoflurano al 4% per 1 minuto. Quindi ridurre e mantenere la concentrazione di isoflurano al 2%.
- Inserire delicatamente la sonda rettale per monitorare la temperatura durante le procedure chirurgiche. Impostare la piastra riscaldante a feedback controllata associata per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C.
- Applicare l'unguento per gli occhi di dexpantenolo su entrambi gli occhi e pulire la pelle e la pelliccia circostante con un agente disinfettante.
3. Modello di fototrombosi
- Fai un'incisione longitudinale di 2,0-2,5 cm e ritrai per esporre il cranio. Eseguire l'esposizione del cranio con un singolo taglio per evitare complicazioni della ferita.
- Rimuovere delicatamente il periosteo con il cotone e identificare le suture coronali.
- Indossare gli occhiali protettivi, accendere il laser a 561 nm e segnare il bregma +3 mm a sinistra.
- Spegnere il laser, attaccare un adesivo con un foro di 4 mm di diametro posto alle coordinate contrassegnate sopra menzionate.
- Iniettare il topo con Bengal Rose (10 μL/g), per via intraperitoneale. Posizionare il raggio laser a 4-5 cm dal cranio, accendere il laser a 561 nm e illuminare il cranio per 20 minuti.
- Applicare due gocce di soluzione salina allo 0,9% sul cranio per reidratare, suturare la ferita e posizionare l'animale in una camera di recupero a 37 °C per riprendersi dall'anestesia. Dopo 1 ora, riportare i topi alle loro gabbie in una stanza a temperatura controllata.
- Iniettare analgesia ogni 12 ore per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico (4 mg/kg di Carprofene e 0,1 mg/kg di Buprenorfina).
4. Operazione fittizia
- Eseguire due diverse procedure di operazioni Sham come descritto nei passaggi 4.1.1 e 4.1.2.
- Eseguire tutte le procedure in modo identico all'operazione sopra descritta. Iniettare Rose Bengal senza accendere il laser. Dopo 20 minuti in anestesia, lasciare che gli animali rimangano nella camera di recupero per 1 ora per recuperare, prima di essere restituiti alle loro gabbie.
- Eseguire tutte le procedure in modo identico all'operazione sopra descritta, accendendo il laser. Non iniettare Rose Bengal. Dopo 20 minuti di illuminazione laser, consentire agli animali di rimanere nella camera di recupero per 1 ora per riprendersi dall'anestesia, prima di essere restituiti alle loro gabbie.
5. Macchie laser
- Collegare la coperta riscaldata per mantenere calda l'area operativa e mantenere la temperatura corporea del mouse durante l'anestesia a 37 °C.
- Posizionare il mouse nella camera di induzione con una portata isoflurano del 4% per anestetizzarlo fino a quando il movimento spontaneo del corpo e delle vibrisse si ferma e quindi trasferire il mouse nella cornice stereotassica.
- Posizionare il mouse in posizione prona con il naso nella maschera di anestesia. Fissare l'animale e mantenere la concentrazione di isoflurano al 4% per 1 min.
- Inserire delicatamente la sonda rettale per monitorare la temperatura durante le procedure chirurgiche. Impostare la piastra riscaldante controllata a feedback associata per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C e applicare l'unguento oculare di dexpantenolo su entrambi gli occhi. Pulire la pelle e la pelliccia circostante con un agente disinfettante.
- Fai un'incisione longitudinale di 2,0-2,5 cm e ritrai per esporre il cranio. Eseguire l'esposizione del cranio con un singolo taglio per evitare complicazioni della ferita.
- Posizionare la cornice sterotattica sotto la macchietta laser e regolare l'altezza per ottenere un'immagine nitida. Focalizzare la telecamera LSI (Laser Speckle Perfusion Imaging) sulla finestra cranica. Configurare il sistema di telecamere LSI (Laser Speckle Imaging) ad alta risoluzione come descritto in precedenza15.
- Acquisisci dati da un campo visivo di 1 cm x 1 cm utilizzando una lunghezza d'onda di 785 nm e laser da 80 mW con un frame rate di 21 immagini/ s a una distanza di lavoro di 1 cm per 1 minuto.
- Dopo l'imaging, applicare due gocce di soluzione salina allo 0,9% sul cranio per reidratare, suturare la ferita e posizionare l'animale in una camera di recupero a 37 ° C per recuperare dall'anestesia per 1 ora. Dopo 1 ora, riportare i topi alle loro gabbie in una stanza a temperatura controllata.
6. Neuropunteggio
NOTA: Per l'analisi del deficit neurologico, viene utilizzata una scala neurologica modificata pubblicata da Eckenstein et al. nel1997 15.
- Punteggio degli animali per deficit generali (Tabella 1) e focali (Tabella 2). Questa scala composita varia da 0 (nessun deficit) a 46 (gravi menomazioni).
- Esegui il neuroscore alla stessa ora ogni giorno e usa abiti chirurgici per mantenere un odore neutro.
- Abituare i topi per 30 minuti nella stanza con una gabbia aperta prima del test e consentire loro di osservare ogni elemento per 30 s.
7. Perfusione
- Preparare una siringa da 20 mL contenente PBS-eparina (2 U/mL) e posizionarla 1 m sopra il banco per facilitare/garantire la perfusione per gravità.
- Iniettare per via intraperitoneale 100 μL di ketamina e xilazina (rispettivamente 120/16 mg/kg di peso corporeo). Attendere 5 minuti e confermare la cessazione del movimento spontaneo del corpo e delle vibrisse.
- Fissare l'animale in posizione supina e disinfettare la superficie addominale del corpo con etanolo al 100%. Fai un'incisione lunga 3 cm nell'addome; tagliare il diaframma e le costole per visualizzare completamente il cuore.
- Fare una piccola incisione nell'atrio destro e inserire la cannula di perfusione nel ventricolo sinistro e perfondere con 20 ml di PBS-eparina.
- Dopo la perfusione, decapitare l'animale e rimuovere il cervello, congelarlo con ghiaccio secco e conservarlo a -80 °C fino a nuovo utilizzo.
8. Volumetria dell'infarto
- Criosezione: tagliare il cervello in serie su un criostato a sezioni spesse 20 μm ogni 120 μm e montare su diapositive. Conservare i vetrini a -80 °C fino a ulteriore lavorazione.
- Colorazione viola cresile (CV)
- Per preparare la soluzione colorante, mescolare 0,5 g di acetato CV in 500 mL di H2O. Mescolare e riscaldare (60 °C) fino a quando i cristalli non si sono sciolti. Lasciare raffreddare la soluzione e conservarla in una bottiglia scura. Riscaldare a 60 °C e filtrare (filtro di carta) prima di ogni utilizzo.
- Asciugare i vetrini a temperatura ambiente per 30 min. Metterli in etanolo al 95% per 15 minuti, seguiti da etanolo al 70% per 1 minuto e successivamente in etanolo al 50% per 1 minuto.
- Mettere i vetrini in acqua distillata per 2 minuti, rinfrescare l'acqua distillata e rimettere i vetrini in acqua per 1 minuto. Quindi, posizionare i vetrini nella soluzione colorante preriscaldata per 10 minuti a 60 °C. Lavare i vetrini due volte in acqua distillata per 1 min.
- Posizionare le diapositive in etanolo al 95% per 2 minuti. Quindi metterli in etanolo al 100% per 5 minuti, rinfrescare l'etanolo al 100% e posizionare nuovamente i vetrini in etanolo al 100% per 2 minuti. Successivamente, coprire le diapositive con un supporto di montaggio.
- Analisi: Scansiona i vetrini e analizza il volume indiretto dell'infarto con il metodo Swanson16 per correggere l'edema: area ischemica = (regione ischemica)-((emisfero ipsilaterale) - (emisfero controlaterale)).
9. Colorazione Tunel (kit di rilevamento dell'apoptosiin situ)
- Asciugare i vetrini, post-fissare in paraformaldeide al 4% in PBS (ph 7,4) per 10-20 minuti a RT. Lavare in PBS, post-fissare in etanolo preraffreddato: acido acetico 2:1 per 5 min a -20 °C.
- Lavare in PBS e applicare il tampone di equilibrio (da 10 s ad un massimo di 60 min a RT) e applicare la forza di lavoro dell'enzima TdT (1 h a 37 °C in camera umidificata)
- Applicare l'enzima stop/wash della forza di lavoro (10 min a RT), lavare in PBS e applicare il coniugato anti-digoxigenina riscaldato (RT) (30 min a RT al buio)
- Lavare in PBS, incubare con DAPI per 5 minuti a RT e montare i vetrini con mezzi fluoromount.
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Representative Results
Il modello qui descritto è un modello di corsa fototrombotica mediante iniezione rose bengala e illuminazione del cranio intatta per 20 minuti, a una lunghezza d'onda costante di 561 nm e una potenza di uscita di 25 mW alla fibra. Sebbene la chirurgia fototrombotica completa duri 30 minuti, l'animale è tenuto in anestesia bassa e il danno cerebrale è moderato. Circa 10 minuti dopo il trasferimento nelle loro gabbie, tutti gli animali erano svegli, si muovevano liberamente nella gabbia e interagivano con i compagni di cucciolata.
La volumetria dell'infarto è stata eseguita utilizzando sezioni cerebrali coronali seriali macchiate di viola cresile 24 ore dopo l'induzione dell'ictus (Figura 2A). Il volume medio dell'infarto era di 29,3 mm3,che rappresentava il 23% di un emisfero cerebrale. Inoltre, la variabilità di questo modello di corsa è eccezionalmente bassa con una deviazione standard di circa il 3,5% (Figura 2B). L'area della lesione comprende la corteccia motoria senza l'affetto delle strutture sottocorticali.
La fototrombosi ha causato una compromissione sensomotoria moderata a lungo termine, indicata dal Neuroscorecomposito 17 (Figura 3); i deficit generali e focali sono stati misurati 24 ore, 3 giorni e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico. Il Neuroscore generale ha cinque elementi, tra cui la valutazione del pelo, delle orecchie, degli occhi, della postura e dell'attività spontanea, con un punteggio massimo di 18 (Tabella 1). Il Neuroscore focale comprende sette elementi, tra cui la valutazione della simmetria corporea, dell'andatura, dell'arrampicata, del comportamento circolare, della simmetria degli archeli, del ciclismo obbligatorio e della risposta dei baffi, con un punteggio massimo di 28 (Tabella 2). Gli animali colpiti hanno avuto un cambiamento significativo nel neuroscore composito 24 ore dopo l'intervento chirurgico rispetto agli animali operati da Sham. Queste differenze persistevano, anche se i topi ictus sono migliorati nel tempo (Figura 3).
La mortalità durante il tempo di osservazione si verifica raramente nell'1-2% degli animali. In questo rapporto, nessuno dei 10 animali studiati ha dovuto essere escluso e tutti sono sopravvissuti al periodo di osservazione di 7 giorni. Il peso corporeo e le variazioni di temperatura nei topi sono stati monitorati a 24 ore, 3 giorni e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico (Figura 4A,B). I dati hanno mostrato che il peso corporeo e la temperatura sono diminuiti di 24 ore dopo l'intervento chirurgico solo nel gruppo Rose Bengal + illuminazione, ma sono stati recuperati al livello degli animali operati da Sham in 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
Per confermare un'induzione di cambiamenti ischemici, 24 ore dopo l'intervento chirurgico, gli animali sono stati sottoposti a un test di imaging laser. Un'imaging laser a contrasto di macchie ha misurato la perfusione di sangue della corteccia per una durata di 1 minuto ed è stata ottenuta un'immagine mediata codificata a colori per ciascun animale. Ciò dimostra che il Rose Bengal o l'illuminazione laser da sola non produce una lesione, mentre l'applicazione simultanea di Rose Bengal e l'illuminazione laser generano un'area rotonda ipoperfusa di 4 mm di diametro circondata da una stretta zona oligemica (Figura 5A). Inoltre, una colorazione cresyl violet e Tunel per la valutazione del volume dell'infarto 24 ore dopo l'intervento chirurgico non ha rivelato alcun danno tissutale né negli interventi chirurgici di illuminazione laser di Rose Bengal. D'altra parte, Rose Bengal + illuminazione laser ha generato una lesione ben delimitata (Figura 5B).
Tabella 1: Neuroscore generale. Per ciascuno dei cinque deficit generali misurati, gli animali possono ricevere tra 0 e 4 punti a seconda della gravità. I punteggi sulle cinque aree vengono quindi sommati per fornire un punteggio generale totale che va da 0 a 18. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Neuroscore focale. Per ciascuno dei sette deficit generali misurati, gli animali possono ricevere tra 0 e 4 punti a seconda della gravità. I punteggi sulle cinque aree vengono quindi sommati per fornire un punteggio generale totale che va da 0 a 28. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Figura 1: Fototrombosi (PT). Diagramma raffigurante l'area fototrombotica, a 3 mm da Bregma. Il punto verde indica la posizione del laser. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi volumetrica dell'infarto e esito dell'infarto 24 ore dopo PT. (A) Cervello coronale rappresentativo macchiato di viola cresile, sezioni ogni 120 μm a 24 ore dopo PT. Linee tratteggiate delimitano l'area della lesione. (B) Analisi del volume dell'infarto di 10 cervelli (ogni punto rappresenta un singolo cervello) 24 ore dopo PT. La linea rossa orizzontale rappresenta la media (29,32 mm3), le barre di errore indicano la deviazione standard (3,45 mm3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Neuroscore per deficit funzionali dopo PT. Neuroscore composito prima, 24 ore, 3 giorni e 7 giorni dopo PT. BL = prima di PT, RB = Rosa Bengala. n = 5 per gruppo. *p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi del peso corporeo e della temperatura dopo PT. (A) Il peso corporeo e (B) la temperatura sono stati leggermente ridotti negli animali PT rispetto ai gruppi operati da Sham a 24 ore e recuperati 3 giorni dopo PT. BL = prima di PT, RB = Rose Bengal. n = 5 per gruppo.*p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Conferma della lesione dopo PT. (A) Laser Speckle imaging (B) Cresyl violet (pannelli superiori) e Tunel colorazione (pannelli inferiori) hanno confermato la lesione solo dopo la somministrazione di Rose Bengal e la successiva illuminazione laser. RB = Rosa Bengala. Barra della scala = 1.000 μm nel pannello superiore B, barra della scala = 20 μm nel pannello inferiore B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo presentato descrive il modello sperimentale di ictus della fototrombosi illuminando il cranio intatto con un laser a 561 nm, con una precedente iniezione intraperitoneale di Rose Bengal. Fino a poco tempo fa, l'uso di questo modello è stato basso ma è in costante aumento.
La mortalità durante l'induzione dell'ictus in questo modello è assente. La mortalità complessiva inferiore al 5% si manifesta durante l'operazione a causa di complicazioni anestesiologiche o sacrifici dopo aver soddisfatto i criteri di esclusione. Per garantire la bassa variabilità di questo modello e la sua riproducibilità, si suggeriscono i seguenti criteri di esclusione: 1) tempo di funzionamento superiore a 30 min; 2) infezione della sutura; 3) ferita da morso; e 4) nessun infarto o nessuna asimmetria di fronte a 24 ore dopo PT.
Un modello di corsa sperimentale ampiamente utilizzato è l'occlusione transitoria dell'MCA, utilizzando un filamento di sutura, che viene introdotto nell'arteria carotide interna fino a quando la punta rivestita di silicio occlude l'origine dell'MCA. Questo modello permette la riperfusione rimuovendo il filamento e imita lo scenario clinico umano, in cui vi è un ripristino del flusso sanguigno cerebrale dopo lisi spontanea o terapeutica (rtPA) di un coagulo embolico18,19. Tuttavia, si tratta di un intervento chirurgico complesso con alta variabilità dell'infarto finale e alto tasso di mortalità10. Al contrario, l'occlusione permanente dell'MCA distale delle arterie lenticolostriatali può essere ottenuta mediante coagulazione dell'arteria20,21,che induce lesioni localmente definite nella neocorteccia22. Sebbene questo modello abbia un tasso di mortalità più basso, richiede un intervento chirurgico invasivo all'animale mediante trapanazione del cranio sopra l'MCA per coagularlo successivamente23. Di conseguenza, sono necessarie elevate capacità chirurgiche per uno studio sull'ictus in vivo di successo e imparziale.
Rispetto ad altri modelli di ischemia cerebrale, il modello fototrombotico come eseguito in questo video ha il vantaggio di nessuna craniotomia o intervento chirurgico maggiore sull'animale, a differenza di altri modelli che comportano interventi chirurgici complessi o craniotomia cerebrale. Inoltre, la semplice esecuzione del modello rende l'intervento accessibile a molti con una formazione a basso consumo di tempo. Bassa mortalità, volume moderato di infarto e flessibilità per indurre la lesione in una specifica regione del cervello, sottolineano il vantaggio di questo paradigma sperimentale per la rigenerazione del cervello e gli studisull'ictus 24,25,26,27.
Nonostante gli ovvi vantaggi, è necessario prendere in considerazione alcune limitazioni di questo modello di corsa. La lunga esposizione degli anestetici all'animale potrebbe essere un fattore critico da tenere in considerazione, poiché l'impatto degli anestetici sulla neuroprotezione e sull'esito dell'ictus è già ben noto28. Sebbene la durata di questa procedura chirurgica richieda circa 30 minuti, l'animale può essere sotto basse concentrazioni anestetiche a causa della minima manipolazione dell'animale durante i 20 minuti di illuminazione laser. Poiché questo modello induce lesioni cerebrali moderate, sono rilevabili solo deficit comportamentali minori. Pertanto, sistemi di test più avanzati con maggiore sensibilità e parametri di test qualitativi, come il test di raggiungimento29 e Neuroscore17, come descritto qui, forse più adatti per rilevare risultati funzionali a lungo termine in questo modello. Infine, a causa dell'aggregazione permanente delle piastrine nei vasi sanguigni illuminati, non è possibile ottenere alcuna riperfusione, che è una caratteristica osservata in una percentuale sostanziale di pazienti con ictus a causa della lisi spontanea del coagulo o della terapia30.
Un modello di corsa fototrombotica simile è stato pubblicato nel 2013 da Labat-gest e Tomasi, descrivendo un protocollo PT che utilizza una lampada a luce fredda invece di un laser verde a 561 nm8. Sia le sorgenti laser che le sorgenti di luce fredda possono essere utilizzate per indurre l'eccitazione del Rose Bengal. Un vantaggio delle sorgenti luminose basate su laser rispetto alle lampade a luce fredda è che i laser possono essere utilizzati per colpire singole arteriole di superficie per la coagulazione in vivo specifica del vaso31. Anche se non stavamo prendendo di mira arteriole specifiche, abbiamo usato un laser verde a 561 nm per l'illuminazione cerebrale e l'induzione della fototrombosi, a causa del picco di assorbimento del Rose Bengal a 562 nm. Per garantire una corretta intensità laser durante l'illuminazione, il Cobolt Monitor Software-6.1.0.0 è stato utilizzato per calibrare il laser. Inoltre, nel presente studio un dosaggio di Rose Bengal di 10 μL/g (100 μg/g) era sufficiente per indurre la fototrombosi, mentre il protocollo precedente riportava una dose più elevata (150 μg/g)8. Inoltre, il protocollo fornisce un metodo comportamentale per analizzare l'esito dell'ictus (Neuroscore) e un ulteriore gruppo di controllo sham (illuminazione laser) al fine di dimostrare che il laser stesso non produce alcun danno tissutale, quindi solo la combinazione di Rose Bengal + illuminazione laser induce una lesione cerebrale.
Nel complesso, questa procedura chirurgica semplice non invasiva consente un'elevata riproducibilità e direzionalità della lesione da ictus al cervello insieme alla possibilità di osservazione a lungo termine a causa della mortalità minima. Questo modello di ictus fototrombotico si distingue come un prezioso paradigma sperimentale per la ricerca di base e traslazionale sull'ictus.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi concorrenti da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i nostri partner di collaborazione dei Consorzi Immunostroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) per suggerimenti e discussioni. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell'ambito della strategia di eccellenza della Germania nell'ambito del Cluster for Systems Neurology di Monaco (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) e nell'ambito delle sovvenzioni LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 e LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
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