Summary
여기에 설명된 광혈증 뇌졸중 모델은 감광성 염료투여 후 레이저 조명을 이용하여 영구 미생물 폐색을 유도하여 손상되지 않은 두개골을 통해 뇌졸중이 생성된다.
Abstract
뇌졸중은 선진국에서 사망및 성인 장애의 주요 원인입니다. 새로운 치료 전략에 대한 광범위한 조사에도 불구하고 뇌졸중 환자를위한 제한된 치료 옵션이 남아 있습니다. 따라서 뇌졸중 후 염증, 혈관 신생, 신경 가소성 및 재생과 같은 병리학적 경로에 대한 연구가 더 필요합니다. 뇌의 복잡성을 재현하는 시험관 내 모델의 무능력을 감안할 때, 실험적인 치기 모형은 이 기계장치에 대한 새로운 약 표적의 분석 그리고 후속 평가에 필수적입니다. 또한, 소위 복제 위기를 극복하기 위해 모든 절차에 대한 자세한 표준화 모델이 시급히 필요합니다. ImmunoStroke 연구 컨소시엄 내에서의 노력으로, 로즈 벵골의 관면 주사와 561 nm 레이저를 가진 손상되지 않은 두개골의 조명을 사용하여 표준화 된 광혈전 마우스 모델이 설명된다. 이 모델은 침습적 인 수술없이 뇌의 피질 영역에 할당 마우스에서 뇌졸중의 성능을 허용; 따라서, 뇌의 다양 한 영역에서 뇌졸중의 연구를 가능하게. 이 비디오에서는 조직학적 분석과 함께 광혈전성 모델에서 뇌졸중 유도의 수술 방법이 입증된다.
Introduction
허혈성 뇌졸중은 2017년 전 세계1개국에서약 270만 명의 사망자를 차지하는21세기 선진국에서 사망 및 성인 장애의 주요 원인으로 남아 있다. 과학 계의 엄청난 노력에도 불구하고, 몇 가지 치료를 사용할 수 있습니다. 더욱이, 이러한 높은 배제 기준으로, 이러한 이미 제한된 옵션은 많은 환자가 접근 할 수 없으므로 뇌졸중 후 기능적 회복을 개선하기 위한 새로운 치료법이 절실히 필요합니다.
뇌의 복잡한 상호 작용을 복제하는 체외 모델의 무능력을 고려, 동물 모델은 전 임상 뇌졸중 연구에 필수적이다. 마우스는 뇌졸중 연구 분야에서 가장 자주 사용되는 동물 모델입니다. 이러한 마우스 모델의 대다수는 MCA 영토2에위치하기 때문에 중대뇌 동맥(MCA) 내의 혈류를 차단하여 경색을 유도하는 것을 목표로 한다. 이 모형은 더 나은 인간 적인 치기 병변을 다시 상피하더라도, 그(것)들은 높은 극단적인 볼륨 가변성을 가진 경련한 수술을 관련시킵니다.
로젠블룸과 엘사반이 1977년 3년 포토스혈전 모델의제안을 제안한 이후, 이후 왓슨 외4를쥐에게 이 모델을 적용한 후, 허혈성 뇌졸중 연구5,6에서널리 사용되고 있다. 광혈전 뇌졸중 모델은 이전에 혈류에 주입된 빛에 민감한 염료의 광활성화의 결과로 국소 및 정의된 피질 경색을 유도한다. 이것은 빛에 노출된 지역에 있는 혈관의 현지 혈전증을 일으키는 원인이 됩니다. 간략하게, 주입된 감광성 염료로부터 빛에 노출되면, 내피 세포막의 국소화된 산화 손상이 유도되어 혈소판 응집 및 혈전 형성으로 이어지고, 대뇌 혈류량의 국소중단7.
이 기술의 주요 장점은 실행의 단순성과 병변을 원하는 영역으로 유도할 수 있는 가능성에 있습니다. 다른 실험적인 뇌졸중 모델과 달리, 병변이 손상되지 않은 두개골의 조명을 통해 유도되기 때문에 광혈전 뇌졸중 모델을 수행하기 위해서는 경미한 외과 적 전문 지식이 필요합니다. 더욱이, 잘 제한된테두리(도 2A 및 도 5B)와특정 뇌 부위에 병변을 유도하는 유연성은 허혈성 또는 그대로 피질 영역 내의 세포 반응연구를 용이하게 할 수있다. 이러한 이유로, 이 접근은 피질 가소성의 세포 및 분자 기계장치의 연구 결과에 적합합니다.
지난 수십 년 동안 연구 그룹 간의 재현성 부족에 대한 우려가 커지면서 이른바 복제 위기9가만들어졌습니다. 2015년 제1차 전임상 무작위 대조멀티센터 시험연구의 조정 후, 전임상 연구(11,12,13)를개선하기 위한 제안된 도구는, 독립적인 실험실에서 전임상 연구 사이의 재현성에 실패한 한 가지 원인이 실험스트로크 모델 및 결과 파라미터(14)의 충분한 표준화가 부족한 것으로 확인되었다. 이에 따라, 면역스트로크 컨소시엄이 설립되었을 때(https://immunostroke.de/), 뇌졸중 회복의 기계론적 원리에 기초한 뇌면역 상호작용을 이해하는 것을 목표로 하는 협력은 각 연구그룹 간의 모든 실험적 뇌졸중 모델의 표준화가 필수적이었다.
여기에 기재된 상기 연구 컨소시엄에서 사용되는 바와 같이 광혈전형 모델의 유도를 위한 표준화된 절차이다. 간단히, 동물은 마취를 겪고, 로즈 벵골 주사(10 μL/g)를 관전적으로 받았고, 브레그마에서 남은 3mm의 그대로 두개골은 즉시 561 nm 레이저로 20분(그림1)에의해 조명되었다. 또한, 이 모델에서 스트로크 결과를 분석하는 관련 조직학적 및 행동 방법이 보고된다. 모든 방법은 실험실에서 개발 및 사용되는 표준 작동 절차를 기반으로 합니다.
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Protocol
이 비디오에서 보고된 실험은 실험 동물의 사용에 대한 국가 지침에 따라 수행되었으며, 의정서는 독일 정부 위원회(독일 뮌헨 의 레지에룽 폰 오버바이엔)에 의해 승인되었다. 이 연구에서 사용된 마우스는 남성 C57Bl/6J 마우스, 10-12주 된, 찰스 강 독일에 의해 파견되었다. 동물은 12h 빛-어두운 주기 기간과 펠릿 식품 및 물 광고 리비툼에 대한 액세스와 함께 제어 온도 (22 ° C ± 2 °C)에서 보관되었다.
1. 재료 및 계측기의 준비
- 로즈 벵골을 0.9% 식염수 용액에 녹여 최종 농도10 mg/mL에 도달하십시오. 열 담요를 연결하여 작동 영역을 따뜻하게 유지하고 마취 시 마우스 체온을 37°C에서 유지합니다.
- 가위, 집게, 면 조각, 덱스파테놀 눈 연고 및 봉합물을 준비합니다. 수화된 작동 영역을 유지하기 위해 식염수 용액(바늘 없이)으로 주사기를 준비합니다. 마취 가스 (100 % O2 + 이소플루란)를 준비하십시오.
2. 동물의 준비
- 수술 전 30분 전에 진통제를 주입하십시오(4 mg/kg 카프로펜과 0.1 mg/kg 부프레노르핀).
- 주입할 로즈 벵골의 용량을 조정하기 위해 마우스 체중을 기록한다(10 μL/g, 100 μg/g).
- 마우스를 4%의 이소플루란 유량으로 유도 챔버에 배치하여 신체및 비브리세이의 자발적인 움직임이 멈출 때까지 마취합니다.
- 마우스를 스테레오테틱 프레임으로 옮기고 코를 마취 마스크에 넣는 경향이 있는 위치에 놓습니다. 동물을 고정하고 이소플루란 농도를 1분 동안 4%로 유지한다. 그런 다음 이소플루란 농도를 2%로 줄이고 유지합니다.
- 직장 프로브를 부드럽게 삽입하여 수술 시술 전반에 걸쳐 온도를 모니터링합니다. 마우스 체온을 37°C에서 유지하기 위해 관련 피드백 제어 가열 패드를 설정합니다.
- 덱스파테놀 눈 연고를 눈에 바르고 소독제로 피부와 주변 털을 청소하십시오.
3. 포토스혈전증 모델
- 2.0-2.5cm 세로 절개를 하고 다시 하여 두개골을 노출합니다. 상처 합병증을 피하기 위해 한 번의 절단으로 두개골 노출을 수행합니다.
- 면으로 음막막을 부드럽게 제거하고 관상 봉합사를 식별합니다.
- 보호 안경을 착용하고 561 nm 레이저를 켜고 왼쪽 bregma +3mm를 표시하십시오.
- 레이저를 끄고 위에서 언급한 표시된 좌표에 4mm 직경구멍이 있는 스티커를 부착합니다.
- 벵골 장미 (10 μL/g)로 마우스를 주입, 인과 회대적으로. 레이저 빔을 두개골에서 4-5cm에 놓고 561 nm 레이저를 켜고 20 분 동안 두개골을 비춥습니다.
- 두개골에 0.9% 식염수 2방울을 발라 상처를 재수화하고, 상처를 봉합하고, 동물을 37°C의 회복실에 배치하여 마취로부터 회복한다. 1 시간 후, 온도 조절 실에서 자신의 케이지에 마우스를 반환합니다.
- 수술 후 3일동안 12시간마다 진통증을 주입하십시오(4 mg/kg 카프로펜과 0.1 mg/kg 부프레노르핀).
4. 샴 작업
- 4.1.1 단계 및 4.1.2 단계에 설명된 대로 샴 작업의 두 가지 다른 절차를 수행합니다.
- 위에서 설명한 작업과 동일한 모든 절차를 수행합니다. 레이저를 켜지 않고 로즈 벵골을 주입하십시오. 마취하에 20 분 후, 동물이 회복 실에 머물 수 있도록 1 시간 동안 복구, 자신의 케이지로 반환되기 전에.
- 레이저를 켜고 위에서 설명한 동작과 동일한 모든 절차를 수행합니다. 로즈 벵골을 주입하지 마십시오. 레이저 조명의 20 분 후, 동물이 마취에서 회복하기 위해 1 시간 동안 회복 챔버에 머물 수 있도록, 자신의 케이지로 반환되기 전에.
5. 레이저 얼룩
- 가열 된 담요를 연결하여 작동 영역을 따뜻하게 유지하고 마취 시 마우스 체온을 37 °C에서 유지합니다.
- 마우스를 4%의 이소플루란 유량으로 유도 챔버에 넣고 신체의 자발적인 움직임이 멈추고 마우스를 스테레오전술 프레임으로 옮춥니다.
- 마우스를 마취 마스크에 코를 가진 경향이 있는 위치에 놓습니다. 동물을 고정하고 이소플루란 농도를 1분 동안 4%로 유지하였다.
- 직장 프로브를 부드럽게 삽입하여 수술 시술 전반에 걸쳐 온도를 모니터링합니다. 관련 피드백 제어 가열 패드를 설정하여 마우스 체온을 37°C에서 유지하고 두 눈에 덱스파테놀 눈 연고를 적용합니다. 소독제로 피부와 주변 털을 청소하십시오.
- 2.0-2.5cm 세로 절개를 하고 다시 하여 두개골을 노출합니다. 상처 합병증을 피하기 위해 한 번의 절단으로 두개골 노출을 수행합니다.
- 레이저 반점 아래에 스테로틱 프레임을 놓고 높이를 조정하여 선명한 이미지를 얻습니다. 두개골 창에 레이저 반점 관류 이미징 (LSI) 카메라를 집중합니다. 앞서 설명한15와같이 고해상도 레이저 반점 이미징(LSI) 카메라 시스템을 구성한다.
- 785nm 파장과 80mW 레이저를 사용하여 1cm x 1cm 시야에서 데이터를 획득하고 1cm의 작업 거리에서 21개의 이미지/s의 프레임 속도를 제공합니다.
- 이미징 후 두개골에 0.9% 식염수 2방울을 적용하여 상처를 재수화하고, 상처를 봉합하고, 동물을 37°C의 회복실에 배치하여 마취로부터 1h로 회복한다. 1 시간 후, 온도 조절 실에서 자신의 케이지에 마우스를 반환합니다.
6. 신경 점수
참고: 신경적자 분석을 위해 1997년에 Eckenstein 외에 의해 간행된 수정된 신경학상 규모는15를이용한다.
- 일반(표 1)및 초점 적자(표 2)에대한 동물을 점수. 이 복합 척도는 0(적자 없음)에서 46(중증 손상)까지 다양합니다.
- 매일 같은 시간에 신경 점수를 수행하고 중성 냄새를 유지하기 위해 수술복을 사용합니다.
- 시험 전에 열린 케이지로 방에서 30 분 동안 마우스를 습관화하고 각 항목을 30 초 동안 관찰 할 수 있습니다.
7. 관류
- PBS-heparin (2 U/mL)을 포함하는 20 mL 주사기를 준비하고 중력 구동 관류를 용이하게 / 보장하기 위해 벤치 위에 1 m를 배치합니다.
- 케타민과 자일라진의 100 μL(각각 120/16 mg/kg 의 체중)을 주입합니다. 5 분 동안 기다렸다가 자발적인 신체 운동과 비브리사 (vibrissae)의 중단을 확증하십시오.
- 동물을 척추 자세로 고정하고 100 % 에탄올로 복부 신체 표면을 소독하십시오. 복부에 3cm 길이의 절개를 합니다. 다이어프램과 갈비뼈를 잘라 심장을 완전히 시각화합니다.
- 오른쪽 아트리움에 작은 절개를 하고 좌심실에 관류 캐뉼라를 삽입하고 20mL PBS-heparin으로 견딜 수 있습니다.
- 수혈 후, 동물을 참수하고 뇌를 제거, 드라이 아이스를 사용하여 동결하고 추가 사용까지 -80 ° C에 저장합니다.
8. 경색 볼륨
- 저온 절제: 120 μm마다 20 μm 두께의 극저온에 뇌를 연재하고 슬라이드에 장착합니다. 추가 처리될 때까지 슬라이드를 -80°C에 저장합니다.
- 크레실 바이올렛 (CV) 염색
- 염색 용액을 준비하려면 0.5 g의 CV 아세테이트를 H2O. 저어서 열(60°C)에 섞어 결정이 용해될 때까지 섞는다. 용액이 식히고 어두운 병에 보관할 수 있도록 합니다. 사용 전에 60°C로 재가열하고 필터(종이 필터)를 사용합니다.
- 실온에서 30분 동안 슬라이드를 건조시다. 15분 동안 95%에탄올에 넣은 후 1분 동안 70%, 이후 에탄올은 50%로 1분 동안 배치합니다.
- 슬라이드를 증류수에 2분 동안 놓고 증류수를 새로 고치고 슬라이드를 다시 물에 1분 동안 놓습니다. 그런 다음 60°C에서 10분 동안 미리 가열된 스테닝 용액에 슬라이드를 배치합니다. 슬라이드를 증류수로 2회 세척하여 1분 동안 세척합니다.
- 슬라이드를 95% 에탄올에 2분 동안 놓습니다. 그런 다음 100% 에탄올에 5분 동안 넣고 100% 에탄올을 새로 고치고 슬라이드를 100% 에탄올에 다시 2분 동안 놓습니다. 그런 다음 슬라이드를 장착 매체로 덮습니다.
- 분석: 슬라이드를 스캔하고 스완슨방법(16)에 의해 간접 적인 비경색 볼륨을 분석하여 부종에 대해 수정합니다: 허혈 영역 = (허혈영역)-((이시종 반구) - (단반구).
9. 튜클 염색(시투 아포토시스 검출 키트)
- 슬라이드를 건조, PBS (ph 7.4)에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 10-20 분 동안 PBS (ph 7.4)에서 RT. 워시, 미리 냉각 된 에탄올에서 포스트 픽스: 아세트산 2:1 -20 °C에서 5 분 동안.
- PBS에서 세척하고 평형 버퍼 (RT에서 최대 60 분까지 10 초)를 적용하고 작업 강도 TdT 효소 (가습 챔버에서 37 °C에서 1 시간)를 적용하십시오.
- 작업 강도 정지 / 세척 효소 (RT에서 10 분), PBS에서 세척하고 따뜻하게 (RT) 작업 강도 안티 디곡시겐 공주 (어두운에서 RT에서 30 분) 적용
- PBS에서 세척하고, DAPI로 5분 동안 DAPI로 배양하고, 플루오로마운트 미디어로 슬라이드를 장착합니다.
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Representative Results
여기에 설명된 모델은 로즈 벵골 주입및 20분 동안 손상되지 않은 두개골 조명에 의한 광혈증 뇌졸중 모델이며, 섬유에서 일정한 561nm 파장 및 25mW 출력 전력에서. 완전한 광혈증 수술은 30 분 동안 지속되지만 동물은 낮은 마취 하에 유지되고 뇌 손상은 보통입니다. 케이지로 옮겨진 지 약 10분 후, 모든 동물들이 깨어 있었고, 케이지에서 자유롭게 움직이고, 쓰레기와 상호 작용했다.
경색 부피는 뇌졸중 유도 후 24시간 크레실 바이올렛 스테인드 직렬 관상 동맥 뇌 섹션을 사용하여 수행하였다(도2A). 평균 경색 부피는 29.3 mm3,하나의 뇌 반구의 23 %를 나타내는. 더욱이, 이 스트로크 모델의 가변성은 약 3.5%(도2B)의표준 편차로 매우 낮습니다. 병변 영역은 피질을 피질을 아우르는 데, 피질은 피질 구조에 대한 애정 없이 입니다.
광혈전증은 중등도, 장기 감각운동 장애를 일으켰으며, 복합신경점수(17)에 의해 표시됨(도3); 일반 및 초점 적자는 수술 후 24시간, 3일 및 7일 후에 측정되었습니다. 일반 Neuroscore는 모피, 귀, 눈, 자세 및 자발적 활동의 평가를 포함하여 5 개의 항목이 있으며 최대 점수는 18(표1)입니다. 초점 신경 점수는 신체 대칭, 걸음걸이, 등반, 순환 동작, 앞다리 대칭, 강제 사이클링 및 수염 반응의 평가를 포함하여 7 가지 항목으로 구성되며 최대 점수는 28(표2)입니다. 뇌졸중 동물은 샴 수술 동물에 비해 수술 후 복합 신경 점수 24 시간24 h에 상당한 변화가 있었다. 이러한 차이는 지속, 비록 스트로크 마우스 시간이 지남에 따라 개선(그림 3).
관찰 시간 동안 사망률은 동물의 1-2 %에서 거의 발생하지 않습니다. 이 보고서에서, 연구 된 10 마리의 동물 중 어느 것도 배제될 필요가 없었으며 모두 7 일 간의 관찰 기간에 살아남았습니다. 마우스의 체중 및 온도 변화는 수술 후 24시간, 3일 및 7일(도4A,B)에서모니터링하였다. 데이터는 로즈 벵골 + 조명 그룹에서만 수술 후 체중과 온도가 24 시간 감소했지만 수술 후 3 일 만에 샴 수술 동물의 수준으로 회복된 것으로 나타났습니다.
허혈성 변화의 유도를 확인하기 위해, 수술 후 24 시간, 동물은 레이저 이미징 테스트를 겪었다. 레이저 반점 대비 이미징은 피질의 혈액 관류를 1분 동안 측정했으며 각 동물에 대해 평균적인 색으로 구분된 그림을 얻었다. 이는 로즈 벵골 또는 레이저 조명만으로는 병변을 생성하지 않으며, 로즈 벵골과 레이저 조명의 동시 적용은 좁은 올리고게믹존(그림 5A)으로둘러싸인 직경 4mm의 둥근 저전체 영역을 생성한다는 것을 보여준다. 또한, 수술 후 24시간 동안 경피량의 평가를 위해 크레실 바이올렛과 튜틀 염색은 로즈 벵골이나 레이저 조명 수술에서 조직 손상이 없음을 밝혔다. 한편, 로즈 벵골+레이저 조명은 잘 구분된 병변(도5B)을생성하였다.
표 1: 일반 신경 점수. 측정된 5개의 일반적인 적자 각각에 대해, 동물은 심각도에 따라 0과 4점 사이에서 수신할 수 있습니다. 그런 다음 5개 영역의 점수는 합계하여 0-18에 이르는 총 일반 점수를 제공합니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 초점 신경 점수. 측정된 7개의 일반적인 적자 각각에 대해, 동물은 심각도에 따라 0과 4점 사이에서 수신할 수 있습니다. 그런 다음 5개 영역의 점수가 합산되어 0-28에 이르는 총 일반 점수를 제공합니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1: 포토스혈전증 (PT). 브레그마에서 3mm 떨어진 광혈전 지역을 묘사한 다이어그램. 녹색 점은 레이저의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 체적 경색 분석 및 경색 결과 24 PT 후 24 h. (A)대표 크레실 보라색 스테인드 코로나 뇌, PT 후 24 h에서 모든 120 μm을 섹션. 대시 라인은 병변 영역을 교감. (B)PT 후 24시간 동안 10개의 뇌(개별 뇌를 나타내는 각 점)의 경색 볼륨 분석. 수평 빨간색 선은 평균(29.32 mm3)을나타내며, 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다(3.45 mm3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PT 후 기능 적 적자에 대한 신경 점수. PT. BL = PT, RB = 로즈 벵골 전, 24시간, 3일, 7일 전에 합성 신경 점수. n = 그룹당 5. *p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: PT 후 체중 및 온도 분석. (A)체중 및(B)온도는 24h에서 샴 작동 그룹에 비해 PT 동물에서 약간 감소되었고 PT= PT, RB = 로즈 벵골 전에 PT= 3 일 후에 회복되었다. n = 그룹 당 5.*p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: PT 후 병변 확인. (A)레이저 반점 이미징(B)크레실 바이올렛 (상부 패널) 및 튜틀 스테인링 (하부 패널) 로즈 벵골및 후속 레이저 조명의 투여 후 병변을 확인했다. RB = 로즈 벵골. 스케일 바 = 상부 패널 B의 1,000 μm, 아래 패널 B의 스케일 바 = 20 μm을 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 프로토콜은 로즈 벵골의 이전 복막 주사와 함께 561 nm 레이저로 손상되지 않은 두개골을 조명하여 포토스혈전증의 실험적인 스트로크 모델을 설명합니다. 최근까지이 모델의 사용은 낮았지만 꾸준히 증가하고 있습니다.
이 모델에서 뇌졸중 유도 중 사망률은 존재하지 않습니다. 5% 미만의 전반적인 사망률은 배제 기준을 충족한 후 마취 학적 합병증이나 희생으로 인해 수술 중에 발생합니다. 이 모델의 낮은 가변성과 재현성을 보증하기 위해 다음과 같은 배제 기준이 제안됩니다: 1) 30분 이상 작업 시간; 2) 봉합사의 감염; 3) 물린 상처; 및 4) PT 후 24h에서 비대칭을 포맷하거나 포맷하지 않습니다.
널리 사용되는 실험 스트로크 모델은 MCA의 일시적인 폐색으로, 실리콘 코팅 팁이 MCA의 기원을 가리기 전까지 내부 경동맥에 도입되는 봉합사 필라멘트를 사용하여 MCA의 과도 적 폐색이다. 본 모델은 필라멘트를 제거하여 레퍼퓨전을 허용하고 인간 임상 시나리오를 모방하여, 임전응고(18)및19의자발적 또는 치료(rtPA) 용액 후 대뇌 혈류의 회복이 있다. 그러나, 그것은 최종 극단의 높은 가변성과 높은 사망률10복잡한수술을 관련시킵니다. 대조적으로, 렌티클로스트리리아탈 동맥의 MCA 탈장의 영구 폐색은신피질(22)에서국소정의된 병변을 유도하는 동맥20,21의응고에 의해 달성될 수 있다. 이 모형은 더 낮은 사망률이 있더라도, 나중에 그것을 응고하기 위하여 MCA를 통해 두개골의 trepanation에 의해 동물에 침략적인 수술이 필요합니다23. 따라서 생체 내 뇌졸중 연구에서 성공적이고 편견없는 수술 능력이 필요합니다.
다른 뇌 허혈 모델에 비해, 이 비디오에서 수행 된 광혈전 모델은 복잡한 수술이나 뇌 두개 내술을 포함하는 다른 모델과 달리 동물에 대한 두개술이나 주요 수술의 장점이 있습니다. 또한, 모델의 간단한 실행은 낮은 시간 소모적인 훈련을 가진 많은 사람들이 수술에 접근할 수 있게 합니다. 낮은 사망률, 중간 정도의 부피, 특정 뇌 부위에 병변을 유도하는 유연성, 뇌 재생 및 뇌졸중 연구를 위한 이 실험 패러다임의 장점을 강조한다24,25,26,27.
명백한 이점에도 불구하고 이 스트로크 모델의 몇 가지 제한을 고려해야 합니다. 동물에 마취제의 긴 노출은 신경 보호 및 치기 결과에 마취제의 충격이 이미 잘 알려져 있기 때문에, 고려하는 중요한 요인이 될 수있습니다. 이 외과 적 수술의 지속 시간은 약 30 분 걸리지만, 동물은 레이저 조명의 20 분 동안 동물의 최소한의 조작으로 인해 낮은 마취 농도에서 될 수 있습니다. 이 모델은 적당한 두뇌 상해를 유도하기 때문에, 단지 사소한 행동 적자는 검출가능합니다. 따라서, 여기에 설명된 바와 같이 숙련된 도달테스트(29 및 Neuroscore17)와같은 더 높은 감도 및 질적 테스트 매개 변수를 가진 고급 시험 시스템은 이 모델에서 장기 기능 결과를 검출하는 데 더 적합할 수 있다. 마지막으로, 발광된 혈관내혈소판의 영구응집으로 인해, 재관류를 얻을 수 없으며, 이는 자발적인 혈전 용해 또는치료(30)로인해 뇌졸중 환자의 상당한 비율로 관찰되는 특징이다.
유사한 광장 뇌졸중 모델은 라바-게스트와 토마스에 의해 2013년에 발표되었으며, 561 nm 녹색 레이저8대신 차가운 조명 램프를 사용하여 PT 프로토콜을 설명했습니다. 레이저와 차가운 광원은 모두 로즈 벵골 여기를 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 차가운 광램프에 레이저 기반 광원의 장점은 레이저가 생체 내 혈관 별 응고31에대한 개별 표면 동맥을 대상으로 사용할 수 있다는 것입니다. 우리는 특정 동맥을 대상으로하지 않았지만, 우리는 562 nm에서 로즈 벵골 의 압착 피크 때문에 뇌 조명 및 광장 전증 유도를위한 561 nm 녹색 레이저를 사용했다. 조명 중에 적절한 레이저 강도를 보장하기 위해 Cobolt 모니터 소프트웨어-6.1.0.0을 사용하여 레이저를 교정했습니다. 더욱이, 본 연구에서는 10 μL/g(100 μg/g)의 로즈 벵골 투여량은 광반전증을 유도하기에 충분했으며, 이전 프로토콜은 더 높은 용량(150 μg/g)8을보고하였다. 또한, 이 프로토콜은 레이저 자체가 조직 손상을 일으키지 않는다는 것을 증명하기 위해 뇌졸중 결과(Neuroscore) 및 추가 샴 대조군(레이저 조명)을 분석하여 로즈 벵골+레이저 조명의 조합만이 뇌병변을 유도하는 동작 방법을 제공한다.
전반적으로, 이 비침습적 간단한 외과 적 수술은 최소한의 사망으로 인한 장기 관찰의 가능성과 함께 뇌졸중 병변의 높은 재현성과 방향성을 가능하게합니다. 이 광혈증 뇌졸중 모델은 기본 및 번역 뇌졸중 연구를위한 귀중한 실험 패러다임으로 구별됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 경쟁 이익이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 제안과 토론을 위한 면역 스트로크 컨소시엄 (FOR 2879, 치기 복구에 면역 세포에서)의 우리의 모든 협력 파트너에게 감사드립니다. 이 작품은 독일 시스템 신경학을 위한 뮌헨 클러스터(EXC 2145 SyNergy - ID 390857198)의 틀 내에서 독일의 우수 전략에 따라 도이치 포르스충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구 재단)와 LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 및 LL-112-122/1의 보조금하에 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
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