Summary
Beskrevet her er den fototrombotiske slagmodellen, hvor et slag produseres gjennom den intakte skallen ved å indusere permanent mikrovaskulær okklusjon ved hjelp av laserbelysning etter administrering av et lysfølsomt fargestoff.
Abstract
Hjerneslag er en ledende dødsårsak og ervervet voksen funksjonshemming i utviklede land. Til tross for omfattende undersøkelse for nye terapeutiske strategier, er det fortsatt begrensede terapeutiske alternativer for slagpasienter. Derfor er det behov for mer forskning for patofysiologiske veier som post-slag betennelse, angiogenese, nevronal plastisitet og regenerering. Gitt intromodellenes manglende evne til å reprodusere kompleksiteten i hjernen, er eksperimentelle slagmodeller avgjørende for analyse og etterfølgende evaluering av nye legemiddelmål for disse mekanismene. I tillegg er detaljerte standardiserte modeller for alle prosedyrer presserende nødvendig for å overvinne den såkalte replikeringskrisen. Som et forsøk innen ImmunoStroke forskningskonsortium beskrives en standardisert fototrombotisk musemodell ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av Rose Bengal og belysningen av den intakte skallen med en 561 nm laser. Denne modellen tillater ytelsen av slag hos mus med tildeling til enhver kortikale region i hjernen uten invasiv kirurgi; dermed muliggjør studiet av hjerneslag i ulike områder av hjernen. I denne videoen demonstreres de kirurgiske metodene for slaginduksjon i den fototrombotiske modellen sammen med histologisk analyse.
Introduction
Iskemisk hjerneslag er fortsatt en hovedårsak til døden og ervervet voksen funksjonshemming i utviklede land i det21. Selv med den enorme innsatsen fra det vitenskapelige samfunnet, er det få behandlinger tilgjengelig. Videre, med så høye eksklusjonskriterier, er disse allerede begrensede alternativene ikke tilgjengelige for mange pasienter, noe som resulterer i et presserende behov for nye behandlinger for å forbedre funksjonell utvinning etter hjerneslag.
Tatt i betraktning incapability av in vitro modeller for å gjenskape de komplekse interaksjonene i hjernen, er dyremodeller avgjørende for preklinisk slagforskning. Mus er den mest brukte dyremodellen i slagforskningsfeltet. De fleste av disse musemodellene tar sikte på å indusere infarkt ved å blokkere blodstrømmen i den midterste hjernearterien (MCA) siden flertallet av menneskelige slaglesjoner ligger i MCA-territoriet2. Selv om disse modellene bedre rekapitulerer menneskelige slaglesjoner, innebærer de kramper med høy infarktvolumvariabilitet.
Siden Rosenblum og El-Sabbans forslag til fototrombotisk modell i 19773, og senere anvendelsen av denne modellen til rotter Watson et al.4, har den blitt mye brukt i iskemisk slagforskning5,6. Den fototrombotiske slagmodellen induserer en lokal og definert kortikale infarkt som følge av fotoaktivering av et lysfølsomt fargestoff som tidligere ble injisert i blodstrømmen. Dette forårsaker lokal trombose av karene i områdene utsatt for lys. Kort sagt, ved eksponering for lys fra det injiserte lysfølsomme fargestoffet, induseres lokalisert oksidativ skade på endotelcellemembranen, noe som fører til blodplateaggregasjon og trombedannelse, etterfulgt av lokal forstyrrelse av hjerneblodstrømmen7.
Den viktigste fordelen med denne teknikken ligger i sin enkelhet i utførelsen og muligheten til å lede lesjonen til ønsket region. I motsetning til andre eksperimentelle slagmodeller, er det nødvendig med mindre kirurgisk ekspertise for å utføre den fototrombotiske slagmodellen da lesjonen induseres gjennom belysning av den intakte skallen. Videre kan de godt avgrensede grensene ( figur 2A og figur 5B) og fleksibiliteten til å indusere lesjonen til en bestemt hjerneregion lette studiet av cellulære responser innenfor det iskemiske eller intakte kortikale området8. Av disse grunnene er denne tilnærmingen egnet for studiet av cellulære og molekylære mekanismer for kortikale plastisitet.
I løpet av de siste tiårene har den økende bekymringen for mangelen på reproduserbarhet mellom forskningsgrupper blitt laget den såkalte replikeringskrisen9. Etter koordineringen av den første prekliniske randomiserte kontrollerte multisenterstudien i 201510, et foreslått verktøy for å forbedre preklinisk forskning11,12,13, ble det bekreftet at en årsak til sviktende reproduserbarhet mellom prekliniske studier fra uavhengige laboratorier var mangelen på tilstrekkelig standardisering av eksperimentelle slagmodeller og utfallsparametere14. Følgelig, da ImmunoStroke-konsortiet ble etablert (https://immunostroke.de/), et samarbeid som tar sikte på å forstå hjerneimmune interaksjoner som ligger til grunn for de mekanistiske prinsippene for hjerneslaggjenoppretting, var standardiseringen av alle eksperimentelle slagmodeller blant hver forskningsgruppe avgjørende.
Beskrevet her er den standardiserte prosedyren for induksjon av den fototrombotiske modellen som brukes i det ovennevnte forskningskonsortiet. Kort sagt, et dyr gjennomgikk bedøvelse, fikk en Rose Bengal injeksjon (10 μL / g) intraperitonalt, og den intakte skallen, 3 mm igjen fra bregma, ble umiddelbart opplyst av en 561 nm laser i 20 min (Figur 1). I tillegg rapporteres en relatert histologisk og atferdsmessig metode for å analysere slagresultatet i denne modellen. Alle metoder er basert på standard driftsprosedyrer utviklet og brukt i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene som ble rapportert i denne videoen ble utført i henhold til de nasjonale retningslinjene for bruk av eksperimentelle dyr, og protokollene ble godkjent av de tyske regjeringskomiteene (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Musene som ble brukt i denne studien var mannlige C57Bl/6J-mus, 10-12 uker gamle, og sendt av Charles Germany. Dyrene ble plassert under kontrollerte temperaturer (22 °C ± 2 °C), med en 12 timers lys-mørk syklusperiode og tilgang til pelletert mat og vann ad libitum.
1. Tilberedning av materiale og instrumenter
- Løs opp Rose Bengal i 0,9% saltløsning for å nå en endelig konsentrasjon på 10 mg / ml. Koble varmeteppet for å holde operasjonsområdet varmt og opprettholde musens kroppstemperatur under anestesi ved 37 °C.
- Forbered saks, tang, bomullsstykker, dekspanthenol øyesalve og suturmateriale. Forbered en sprøyte med saltløsning (uten nål) for å opprettholde operasjonsområdet hydrert. Forbered anestesigassen (100% O2 + isofluran).
2. Forberedelse av dyret
- Injiser analgesi 30 min før operasjonen (4 mg/kg Carprofen og 0,1 mg/kg Buprenorfin).
- Registrer musens kroppsvekt for å justere dosen av Rose Bengal som skal injiseres (10 μL/g, dvs. 100 μg/g).
- Plasser musen i induksjonskammeret med en isofluranstrømningshastighet på 4% for å bedøve den til kroppens spontane bevegelse og vibrissae stopper.
- Overfør musen inn i den stereotaktiske rammen og plasser den i en utsatt posisjon med nesen inn i anestesimasken. Fest dyret og vedlikehold isoflurankonsentrasjonen på 4% i 1 min. Reduser deretter og vedlikehold isoflurankonsentrasjonen ved 2%.
- Sett forsiktig inn rektalsonden for å overvåke temperaturen gjennom de kirurgiske prosedyrene. Still inn den tilhørende feedback-kontrollerte varmeputen for å opprettholde musens kroppstemperatur ved 37 °C.
- Påfør dekspanthenol øyesalve på begge øynene og rengjør huden og omkringliggende pels med et desinfeksjonsmiddel.
3. Fototrombose modell
- Lag et 2,0-2,5 cm langsgående snitt og trekk tilbake for å eksponere skallen. Utfør skalleeksponeringen med et enkelt kutt for å unngå sårkomplikasjoner.
- Fjern periosteum forsiktig med bomull og identifiser koronal suturer.
- Sett på beskyttelsesbrillene, slå på 561 nm laseren og merk bregmaen +3 mm til venstre.
- Slå av laseren, fest et klistremerke med et hull med diameter på 4 mm plassert ved de markerte koordinatene nevnt ovenfor.
- Injiser musen med Bengal Rose (10 μL/g), intraperitonealt. Plasser laserstrålen på 4-5 cm fra skallen, slå på 561 nm laseren og belys skallen i 20 minutter.
- Påfør to dråper 0,9% saltvann på skallen for å rehydrere, suturere såret og plasser dyret i et gjenopprettingskammer ved 37 °C for å gjenopprette fra anestesi. Etter 1 time, returner musene til burene sine i et temperaturkontrollert rom.
- Injiser analgesi hver 12 h i 3 dager etter operasjonen (4 mg/kg Carprofen og 0,1 mg/kg Buprenorfin).
4. Sham-operasjon
- Utfør to forskjellige prosedyrer for Sham-operasjoner som beskrevet i trinn 4.1.1 og 4.1.2.
- Utfør alle prosedyrene identisk med operasjonen beskrevet ovenfor. Injiser Rose Bengal uten å slå på laseren. Etter 20 min under anestesi, la dyrene holde seg i gjenopprettingskammeret i 1 time for å gjenopprette, før de returneres til burene sine.
- Utfør alle prosedyrene identisk med operasjonen beskrevet ovenfor, slå på laseren. Ikke injiser Rose Bengal. Etter 20 min med laserbelysning, la dyrene holde seg i gjenopprettingskammeret i 1 time for å gjenopprette fra anestesi, før de returneres til burene sine.
5. Laserflekk
- Koble det oppvarmede teppet for å holde operasjonsområdet varmt og opprettholde musens kroppstemperatur under anestesi ved 37 °C.
- Plasser musen i induksjonskammeret med en isofluranstrømningshastighet på 4% for å bedøve den til kroppens spontane bevegelse og vibrissae stopper og deretter overføre musen til stereotaktisk ramme.
- Plasser musen i en utsatt posisjon med nesen inn i anestesimasken. Fest dyret og vedlikehold isoflurankonsentrasjonen på 4% i 1 min. T høne redusere og opprettholde den på 2%.
- Sett forsiktig inn rektalsonden for å overvåke temperaturen gjennom de kirurgiske prosedyrene. Still inn den tilhørende feedback-kontrollerte varmeputen for å opprettholde musens kroppstemperatur ved 37 °C og påfør dekspanthenol øyesalve på begge øynene. Rengjør huden og den omkringliggende pelsen med et desinfeksjonsmiddel.
- Lag et 2,0-2,5 cm langsgående snitt og trekk tilbake for å eksponere skallen. Utfør skalleeksponeringen med et enkelt kutt for å unngå sårkomplikasjoner.
- Plasser den sterotactiske rammen under laserflekken og juster høyden for å få et skarpt bilde. Fokuser kameraet for laserflekkgjennomsiktning (LSI) på kranialvinduet. Konfigurer LSI-kamerasystemet (Laser Speckle Imaging) med høy oppløsning som beskrevet tidligere15.
- Hent data fra et 1 cm x 1 cm synsfelt ved hjelp av en bølgelengde på 785 nm og 80 mW lasere med en bildefrekvens på 21 bilder/s i en arbeidsavstand på 1 cm i 1 min.
- Etter avbildning, bruk to dråper 0,9% saltvann til skallen for å rehydrere, suturer såret og legg dyret i et gjenopprettingskammer ved 37 °C for å gjenopprette fra anestesi i 1 time. Etter 1 time, returner musene til burene sine i et temperaturkontrollert rom.
6. Neuroscore
MERK: For den nevrologiske underskuddsanalysen brukes en modifisert nevrologisk skala publisert av Eckenstein et al. i 199715.
- Skår dyrene for generelt (Tabell 1) og fokusunderskudd (Tabell 2). Denne sammensatte skalaen varierer fra 0 (ingen underskudd) til 46 (alvorlige nedskrivninger).
- Utfør neuroscore på samme tid hver dag og bruk kirurgiske klær for å holde en nøytral lukt.
- Habituate musene i 30 min i rommet med et åpent bur før testingen og la dem observere hvert element i 30 s.
7. Perfusjon
- Forbered en 20 ml sprøyte som inneholder PBS-heparin (2 U/ml) og plasser den 1 m over benken for å lette/sikre tyngdekraftsdrevet perfusjon.
- Injiser intraperitoneally 100 μL ketamin og xylazin (henholdsvis 120/16 mg/kg kroppsvekt). Vent i 5 min og bekrefte opphør av spontan kroppsbevegelse og vibrissae.
- Fest dyret i en liggende stilling og desinfiser bukkroppsoverflaten med 100% etanol. Lag et 3 cm langt snitt i magen; klipp membranen og ribbeina for å visualisere hjertet helt.
- Lag et lite snitt i høyre atrium og sett perfusjonskannlene inn i venstre ventrikel og perfuse med 20 ml PBS-heparin.
- Etter perfusjon, halshugge dyret og fjern hjernen, frys det med tørris og lagre dem ved -80 °C til videre bruk.
8. Infarkt
- Kryoosectioning: Klipp hjernen serielt på en kryostat til 20 μm tykke seksjoner hver 120 μm og monter på lysbilder. Oppbevar skliene ved -80 °C inntil videre behandling.
- Cresyl fiolett (CV) farging
- For å klargjøre fargingsløsningen blander du 0,5 g CV-acetat i 500 ml H2O. Rør og varm (60 °C) til krystallene er oppløst. La løsningen avkjøles og oppbevar den i en mørk flaske. Varmes opp til 60 °C og filtrerer (papirfilter) før hver bruk.
- Tørk skliene ved romtemperatur i 30 min. Plasser dem i 95% etanol i 15 min, etterfulgt av 70% etanol i 1 min, og etterpå i 50% etanol i 1 min.
- Plasser skliene i destillert vann i 2 min, oppdater det destillerte vannet, og plasser lysbildene i vann igjen i 1 min. Plasser deretter lysbildene i den forvarmede fargingsløsningen i 10 min ved 60 °C. Vask skliene to ganger i destillert vann i 1 min.
- Plasser lysbildene i 95% etanol i 2 min. Plasser dem deretter i 100% etanol i 5 min, oppdater 100% etanol og plasser lysbildene i 100% etanol igjen i 2 minutter. Deretter dekker du lysbildene med et monteringsmedium.
- Analyse: Skann lysbildene og analyser det indirekte infarktvolumet ved Swanson-metoden16 for å korrigere for ødem: Iskemisk område = (iskemisk region)-((ipsilateral halvkule) - (kontralateral halvkule)).
9. Tunel farging(in situ apoptosis deteksjonssett)
- Tørk lysbildene, post-fix i 4% paraformaldehyd i PBS (ph 7.4) i 10-20 min ved RT. Vask i PBS, post-fix i precooled etanol: eddiksyre 2:1 i 5 min ved -20 °C.
- Vask i PBS og påfør likevektsbuffer (10 s til maksimalt 60 min ved RT) og påfør arbeidsstyrke TdT-enzymet (1 t ved 37 °C i fuktet kammer)
- Påfør arbeidsstyrkestopp/vask enzym (10 min ved RT), vask i PBS og påfør oppvarmet (RT) arbeidsstyrke anti-digoksigeninkonjugat (30 min ved RT i mørket)
- Vask i PBS, inkuber med DAPI i 5 min ved RT og monter lysbildene med fluoromount media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modellen beskrevet her er en fototrombotisk slagmodell av Rose Bengal injeksjon og intakt hodeskallebelysning i 20 min, ved en konstant 561 nm bølgelengde og 25 mW utgangseffekt ved fiberen. Selv om den komplette fototrombotiske operasjonen varer 30 min, holdes dyret under lav anestesi og hjerneskaden er moderat. Omtrent 10 min etter overføring til burene var alle dyrene våken, beveger seg fritt i buret og samhandler med kullkamerater.
Infarkt ble utført ved hjelp av cresylfiolett farget seriell koronal hjerne seksjoner 24 h etter hjerneslag induksjon (Figur 2A). Gjennomsnittlig infarktvolum var 29,3 mm3, som representerer 23% av en hjernehalvdel. Videre er variasjonen av denne slagmodellen usedvanlig lav med et standardavvik på ca. 3,5% (figur 2B). Lesjonsområdet omfatter motor cortex uten hengivenhet av subkortiske strukturer.
Fototrombose forårsaket en moderat, langsiktig sensorisk svekkelse, indikert av kompositt Neuroscore17 (Figur 3); generelt og fokusunderskudd ble målt 24 timer, 3 dager og 7 dager etter operasjonen. Den generelle Neuroscore har fem elementer, inkludert evaluering av pels, ører, øyne, holdning og spontan aktivitet, med en maksimal poengsum på 18 (Tabell 1). Fokal Neuroscore består av syv elementer, inkludert evaluering av kroppssymmetri, gang, klatring, sirklende oppførsel, forelimbsymmetri, obligatorisk sykling og whiskers respons, med en maksimal poengsum på 28 (Tabell 2). Slagdyr hadde en betydelig endring i kompositt neuroscore 24 timer etter operasjonen sammenlignet med Sham-opererte dyr. Disse forskjellene vedvarte, selv om slagmus forbedret seg over tid (Figur 3).
Dødelighet i observasjonstiden forekommer sjelden hos 1-2% av dyrene. I denne rapporten måtte ingen av de 10 dyrene som ble studert utelukkes, og alle overlevde den 7-dagers observasjonsperioden. Kroppsvekten og temperaturendringene i musene ble overvåket ved 24 timer, 3 dager og 7 dager etter operasjonen (Figur 4A,B). Data viste at kroppsvekt og temperatur ble redusert 24 timer etter operasjonen bare i Rose Bengal + belysningsgruppen, men gjenopprettet til nivået av sham-opererte dyr i 3 dager etter operasjonen.
For å bekrefte en induksjon av iskemiske endringer, 24 timer etter operasjonen, gjennomgikk dyrene en laseravbildningstest. En laserflekk kontrast avbildning målt blod perfusjon av cortex i en varighet på 1 min og et gjennomsnittlig fargekodet bilde ble oppnådd for hvert dyr. Dette viser at Rose Bengal eller laserbelysning alene ikke produserer en lesjon, mens samtidig påføring av Rose Bengal og laserbelysning genererer et rundt hypoperfused område med 4 mm diameter omgitt av en smal oligemic sone (Figur 5A). I tillegg viste en cresylfiolett og Tunel farging for vurdering av det infarktvolumet 24 timer etter operasjonen ingen vevsskade verken i Rose Bengal eller laserbelysningsoperasjoner. På den annen side genererte Rose Bengal + laserbelysning en godt avgrenset lesjon (Figur 5B).
Tabell 1: Generell neuroscore. For hvert av de fem generelle underskuddene som måles, kan dyr motta mellom 0 og 4 poeng avhengig av alvorlighetsgraden. Poengsummene på de fem områdene summeres deretter for å gi en total generell poengsum fra 0-18. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Fokal Neuroscore. For hvert av de syv generelle underskuddene som måles, kan dyr motta mellom 0 og 4 poeng avhengig av alvorlighetsgraden. Poengsummene på de fem områdene summeres deretter for å gi en total generell poengsum fra 0-28. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Figur 1: Fototrombose (PT). Diagram som viser det fototrombotiske området, 3 mm fra Bregma. Den grønne prikken indikerer laserens posisjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Volumetrisk infarktanalyse og infarktutfall 24 timer etter PT. (A) Representativ cresylfiolett farget koronalhjerne, seksjoner hver 120 μm ved 24 timer etter PT. Stiplede linjer avgrenser lesjonsområdet. (B) Infarkt volumanalyse av 10 hjerner (hver prikk som representerer en individuell hjerne) 24 timer etter PT. Den vannrette røde linjen representerer gjennomsnittet (29,32 mm3), feilfelt angir standardavvik (3,45 mm3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Neuroscore for funksjonelle underskudd etter PT. Kompositt Neuroscore før, 24 timer, 3 dager og 7 dager etter PT. BL = før PT, RB = Rose Bengal. n = 5 per gruppe. *p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kroppsvekts- og temperaturanalyse etter PT. (A) Kroppsvekt og (B) temperatur ble litt redusert hos PT-dyr sammenlignet med Sham-opererte grupper ved 24 timer og gjenvunnet 3 dager etter PT. BL = før PT, RB = Rose Bengal. n = 5 per gruppe.*p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Lesjonsbekreftelse etter PT. (A) Laser Speckle imaging (B) Cresyl fiolett (øvre paneler) og Tunel farging (nedre paneler) bekreftet lesjonen bare etter administrering av Rose Bengal og påfølgende laserbelysning. RB = Rose Bengal. Skalastang = 1000 μm i øvre panel B, skalalinje = 20 μm i nedre panel B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen beskriver den eksperimentelle slagmodellen for fototrombose ved å belyse den intakte skallen med en 561 nm laser, med en tidligere intraperitoneal injeksjon av Rose Bengal. Inntil nylig har bruken av denne modellen vært lav, men øker stadig.
Dødelighet under hjerneslaginduksjon i denne modellen er fraværende. Den totale dødeligheten på mindre enn 5% oppstår under drift på grunn av anestesiologiske komplikasjoner eller offer etter å ha møtt eksklusjonskriteriene. For å garantere den lave variasjonen av denne modellen og dens reproduserbarhet, foreslås følgende eksklusjonskriterier: 1) driftstid lenger enn 30 min; 2) infeksjon av suturen; 3) bite sår; og 4) ingen infarkt eller ingen forgrunn ved 24 timer etter PT.
En mye brukt eksperimentell slagmodeller er den forbigående okklusjonen av MCA, ved å bruke en suturfilament, som introduseres i den indre halspulsåren til den silisiumbelagte spissen okkluderer opprinnelsen til MCA. Denne modellen tillater reperfusjon ved å fjerne filamentet og etterligner det menneskelige kliniske scenariet, der det er en restaurering av hjerneblodstrømmen etter spontan eller terapeutisk (rtPA) lysis av en embolisk blodpropp18,19. Det innebærer imidlertid en kompleks kirurgi med høy variasjon av den endelige infarkt og høy dødelighet10. I motsetning kan den permanente okklusjonen av MCA-distal av lenticulostriatal arteriene oppnås ved koagulasjon av arterien20,21, som induserer lokalt definerte lesjoner i neocortex22. Selv om denne modellen har en lavere dødelighet, krever den invasiv kirurgi til dyret ved trepanasjon av skallen over MCA for senere å koagulere den23. Følgelig kreves høye kirurgiske ferdigheter for en vellykket og objektiv in vivo slagstudie.
Sammenlignet med andre hjerne iskemi modeller, fototrombotisk modell som utført i denne videoen har fordelen av ingen kraniotomi eller større kirurgi på dyret, i motsetning til andre modeller som involverer komplekse operasjoner eller hjerne kraniotomi. Videre gjør den enkle utførelsen av modellen operasjonen tilgjengelig for mange med lav tidkrevende trening. Lav dødelighet, moderat infarktvolum og fleksibilitet til å indusere lesjonen til en bestemt hjerneregion, understreke fordelen med dette eksperimentelle paradigmet for hjerneregenerering og slagstudier24,25,26,27.
Til tross for de åpenbare fordelene, bør noen begrensninger i denne slagmodellen tas i betraktning. Den lange eksponeringen av bedøvelse for dyret kan være en kritisk faktor å ta hensyn til, da virkningen av bedøvelse på nevrobeskyttelse og slagutfall allerede er velkjent28. Selv om varigheten av denne kirurgiske prosedyren tar ca 30 min, kan dyret være under lave bedøvelseskonsentrasjoner på grunn av minimal manipulering av dyret i løpet av 20 min laserbelysning. Fordi denne modellen induserer moderate hjerneskader, er bare mindre atferdsunderskudd påvisbare. Dermed mer avanserte testsystemer med høyere følsomhet og kvalitative testparametere, for eksempel den dyktige nå test29 og Neuroscore17, som beskrevet her, kanskje mer egnet for å oppdage langsiktige funksjonelle resultater i denne modellen. Til slutt, på grunn av permanent aggregering av blodplater i de opplyste blodkarene, kan ingen reperfusjon oppnås, noe som er en funksjon observert i en betydelig prosentandel av slagpasienter på grunn av spontan blodpropplys eller terapi30.
En lignende fototrombotisk slagmodell ble publisert i 2013 av Labat-gest og Tomasi, som beskriver en PT-protokoll ved hjelp av en kaldt lyslampe i stedet for en 561 nm grønn laser8. Både laser- og kaldlyskilder kan brukes til å indusere Rose Bengal-eksitasjon. En fordel med laserbaserte lyskilder over kaldt lyslamper er at lasere kan brukes til å målrette individuelle overflatearterioler for in vivo karspesifikk koagulering31. Selv om vi ikke var rettet mot spesifikke arterioler, brukte vi en 561 nm grønn laser for hjernebelysning og fototromboseinduksjon, på grunn av Rose Bengal absortion peak på 562 nm. For å sikre riktig laserintensitet under belysningen ble Cobolt Monitor Software-6.1.0.0 brukt til å kalibrere laseren. Videre var en Rose Bengal-dose på 10 μL/g (100 μg/g) i den nåværende studien tilstrekkelig til å indusere fototrombose, mens den forrige protokollen rapporterte en høyere dose (150 μg/g)8. I tillegg gir protokollen en atferdsmessig metode for å analysere slagutfallet (Neuroscore) og en ekstra sham-control-gruppe (laserbelysning) for å bevise at laseren selv ikke produserer noen vevsskade, så bare kombinasjonen av Rose Bengal + laserbelysning induserer en hjernelesjon.
Totalt sett muliggjør denne ikke-invasive enkle kirurgiske prosedyren høy reproduserbarhet og direksjonalitet av slaglesjonen til hjernen sammen med muligheten for langsiktig observasjon på grunn av minimal dødelighet. Denne fototrombotiske slagmodellen utmerker seg som et verdifullt eksperimentelt paradigme for grunnleggende og translasjonell slagforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle våre samarbeidspartnere i Immunostroke Consortia (FOR 2879, Fra immunceller til hjerneslaggjenoppretting) for forslag og diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy innenfor rammen av München Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) og under tilskuddene LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 og LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
- Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
- Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).
