Summary
Aquí se describe el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico, donde se produce un accidente cerebrovascular a través del cráneo intacto mediante la inducción de la oclusión microvascular permanente utilizando iluminación láser después de la administración de un tinte fotosensible.
Abstract
El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad adulta adquirida en los países desarrollados. A pesar de la extensa investigación de nuevas estrategias terapéuticas, sigue habiendo opciones terapéuticas limitadas para los pacientes con accidente cerebrovascular. Por lo tanto, se necesita más investigación para las vías fisiopatológicas como la inflamación posterior al accidente cerebrovascular, la angiogénesis, la plasticidad neuronal y la regeneración. Dada la incapacidad de los modelos in vitro para reproducir la complejidad del cerebro, los modelos experimentales de accidente cerebrovascular son esenciales para el análisis y la posterior evaluación de nuevos objetivos farmacológicos para estos mecanismos. Además, se necesitan urgentemente modelos estandarizados detallados para todos los procedimientos a fin de superar la llamada crisis de replicación. Como un esfuerzo dentro del consorcio de investigación ImmunoStroke, se describe un modelo de ratón fototrombótico estandarizado que utiliza una inyección intraperitoneal de Rose Bengal y la iluminación del cráneo intacto con un láser de 561 nm. Este modelo permite la realización de ictus en ratones con asignación a cualquier región cortical del cerebro sin cirugía invasiva; por lo tanto, permitiendo el estudio del accidente cerebrovascular en diversas áreas del cerebro. En este video, se demuestran los métodos quirúrgicos de inducción del accidente cerebrovascular en el modelo fototrombótico junto con el análisis histológico.
Introduction
El accidente cerebrovascular isquémico sigue siendo una de las principales causas de muerte y discapacidad adulta adquirida en los paísesdesarrollados en el siglo XXI, lo que representa aproximadamente 2,7 millones de muertes en 2017 en todo el mundo1. Incluso con los inmensos esfuerzos de la comunidad científica, hay pocos tratamientos disponibles. Además, con criterios de exclusión tan altos, estas opciones ya limitadas no son accesibles para muchos pacientes, lo que resulta en una necesidad urgente de nuevos tratamientos para mejorar la recuperación funcional después del accidente cerebrovascular.
Teniendo en cuenta la incapacidad de los modelos in vitro para replicar las complejas interacciones del cerebro, los modelos animales son esenciales para la investigación preclínica del accidente cerebrovascular. Los ratones son el modelo animal más utilizado en el campo de la investigación del accidente cerebrovascular. La mayoría de estos modelos de ratón tienen como objetivo inducir infartos bloqueando el flujo sanguíneo dentro de la arteria cerebral media (AME), ya que la mayoría de las lesiones de accidente cerebrovascular humano se encuentran en el territorio de la AQM2. Aunque estos modelos recapitulan mejor las lesiones de accidente cerebrovascular humano, implican cirugías convulsas con alta variabilidad del volumen del infarto.
Desde la propuesta de Rosenblum y El-Sabban del modelo fototrombótico en 19773,y más tarde la aplicación de este modelo a ratas Watson et al.4,se ha utilizado ampliamente en la investigación del accidente cerebrovascular isquémico5,6. El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico induce un infarto cortical local y definido como resultado de la fotoactivación de un tinte sensible a la luz previamente inyectado en el flujo sanguíneo. Esto causa trombosis local de los vasos en las áreas expuestas a la luz. Brevemente, tras la exposición a la luz del tinte fotosensible inyectado, se induce una lesión oxidativa localizada de la membrana celular endotelial, lo que lleva a la agregación plaquetaria y la formación de trombos, seguida de una interrupción local del flujo sanguíneo cerebral7.
La principal ventaja de esta técnica reside en su simplicidad de ejecución y la posibilidad de dirigir la lesión a la región deseada. A diferencia de otros modelos experimentales de accidente cerebrovascular, se necesita experiencia quirúrgica menor para realizar el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico a medida que la lesión se induce a través de la iluminación del cráneo intacto. Además, los bordes bien delimitados(Figura 2A y Figura 5B)y la flexibilidad para inducir la lesión a una región específica del cerebro pueden facilitar el estudio de las respuestas celulares dentro del área cortical isquémica o intacta8. Por estas razones, este enfoque es adecuado para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la plasticidad cortical.
En las últimas décadas, la creciente preocupación por la falta de reproducibilidad entre los grupos de investigación se ha acuñado como la llamada crisis de replicación9. Después de la coordinación del primer estudio preclínico aleatorizado controlado multicéntrico en 201510,una herramienta propuesta para mejorar la investigación preclínica11 , 12,13, se confirmó que una causa de falla en la reproducibilidad entre los estudios preclínicos de laboratorios independientes fue la falta de estandarización suficiente de los modelos experimentales de accidente cerebrovascular y los parámetros de resultado14. En consecuencia, cuando se estableció el consorcio ImmunoStroke (https://immunostroke.de/), una colaboración que tiene como objetivo comprender las interacciones cerebro-inmune subyacentes a los principios mecanicistas de la recuperación del accidente cerebrovascular, la estandarización de todos los modelos experimentales de accidente cerebrovascular entre cada grupo de investigación fue esencial.
Aquí se describe el procedimiento estandarizado para la inducción del modelo fototrombótico utilizado en el consorcio de investigación mencionado anteriormente. Brevemente, un animal se sometió a anestésicos, recibió una inyección de rosa de Bengala (10 μL / g) por vía intraperitonal, y el cráneo intacto, a 3 mm que quedaba de bregma, fue iluminado inmediatamente por un láser de 561 nm durante 20 minutos(Figura 1). Además, se informa un método histológico y conductual relacionado para analizar el resultado del accidente cerebrovascular en este modelo. Todos los métodos se basan en procedimientos operativos estándar desarrollados y utilizados en el laboratorio.
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Protocol
Los experimentos reportados en este video se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices nacionales para el uso de animales de experimentación, y los protocolos fueron aprobados por los comités gubernamentales alemanes (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania). Los ratones utilizados en este estudio fueron ratones machos C57Bl / 6J, de 10-12 semanas de edad, y enviados por Charles River Germany. Los animales fueron alojados a temperaturas controladas (22 °C ± 2 °C), con un período de ciclo luz-oscuridad de 12 h y acceso a alimentos granletados y agua ad libitum.
1. Preparación del material y los instrumentos
- Disolver Rosa de Bengala en solución salina al 0,9% para alcanzar una concentración final de 10 mg/ml. Conecte la manta térmica para mantener caliente el área de operación y mantenga la temperatura corporal del ratón durante la anestesia a 37 ° C.
- Prepare tijeras, fórceps, trozos de algodón, ungüento ocular dexpantenol y material de sutura. Prepare una jeringa con solución salina (sin aguja) para mantener el área de operación hidratada. Preparar el gasestésicos (100% O2 + isoflurano).
2. Preparación del animal
- Inyecte analgesia 30 min antes de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina).
- Registre el peso corporal del ratón para ajustar la dosis de rosa de bengala a inyectar (10 μL/ g, es decir, 100 μg / g).
- Coloque el ratón en la cámara de inducción con un caudal de isoflurano del 4% para anestesiarlo hasta que se detenga el movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas.
- Transfiera el ratón al marco estereotáctico y colóquelo en una posición prona con la nariz en la máscara de anestesia. Fije el animal y mantenga la concentración de isoflurano al 4% durante 1 min. Luego reduzca y mantenga la concentración de isoflurano en un 2%.
- Inserte suavemente la sonda rectal para controlar la temperatura durante los procedimientos quirúrgicos. Ajuste la almohadilla térmica controlada por retroalimentación asociada para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 °C.
- Aplique ungüento de dexpantenol para los ojos en ambos ojos y limpie la piel y el pelaje circundante con un agente desinfectante.
3. Modelo de fototrombosis
- Haga una incisión longitudinal de 2.0-2.5 cm y retraiga para exponer el cráneo. Realice la exposición del cráneo con un solo corte para evitar complicaciones en la herida.
- Retire el periostio suavemente con algodón e identifique las suturas coronales.
- Ponte las gafas protectoras, enciende el láser de 561 nm y marca el bregma +3 mm a la izquierda.
- Apague el láser, coloque una pegatina con un orificio de 4 mm de diámetro colocado en las coordenadas marcadas mencionadas anteriormente.
- Inyecte al ratón con rosa de Bengala (10 μL/g), por vía intraperitoneal. Coloque el rayo láser a 4-5 cm del cráneo, encienda el láser de 561 nm e ilumine el cráneo durante 20 minutos.
- Aplique dos gotas de solución salina al 0,9% en el cráneo para rehidratarse, suturar la herida y colocar al animal en una cámara de recuperación a 37 ° C para recuperarse de la anestesia. Después de 1 h, devuelva a los ratones a sus jaulas en una habitación con temperatura controlada.
- Inyecte analgesia cada 12 h durante 3 días después de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina).
4. Operación simulada
- Llevar a cabo dos procedimientos diferentes de operaciones Simuladas como se describe en los pasos 4.1.1 y 4.1.2.
- Realice todos los procedimientos de forma idéntica a la operación descrita anteriormente. Inyecte Rose Bengal sin encender el láser. Después de 20 minutos bajo anestesia, permita que los animales permanezcan en la cámara de recuperación durante 1 h para recuperarse, antes de ser devueltos a sus jaulas.
- Realice todos los procedimientos de manera idéntica a la operación descrita anteriormente, encendiendo el láser. No se inyecte Rosa de Bengala. Después de 20 minutos de iluminación láser, permita que los animales permanezcan en la cámara de recuperación durante 1 h para recuperarse de la anestesia, antes de ser devueltos a sus jaulas.
5. Manchas láser
- Conecte la manta calentada para mantener caliente el área de operación y mantenga la temperatura corporal del ratón durante la anestesia a 37 ° C.
- Coloque el ratón en la cámara de inducción con un caudal de isoflurano del 4% para anestesiarlo hasta que se detenga el movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas y luego transfiera el ratón al marco estereotáctico.
- Coloque el ratón en posición prona con la nariz en la máscara de anestesia. Fijar el animal y mantener la concentración de isoflurano al 4% durante 1 min. T gallina reducirla y mantenerla en el 2%.
- Inserte suavemente la sonda rectal para controlar la temperatura durante los procedimientos quirúrgicos. Ajuste la almohadilla térmica controlada por retroalimentación asociada para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 ° C y aplique ungüento ocular dexpantenol en ambos ojos. Limpie la piel y el pelaje circundante con un agente desinfectante.
- Haga una incisión longitudinal de 2.0-2.5 cm y retraiga para exponer el cráneo. Realice la exposición del cráneo con un solo corte para evitar complicaciones en la herida.
- Coloque el marco estenotáctico debajo de la mancha láser y ajuste la altura para obtener una imagen nítida. Enfoque la cámara de imágenes de perfusión moteada con láser (LSI) en la ventana craneal. Configure el sistema de cámara de imágenes de manchas láser (LSI) de alta resolución como se describió anteriormente15.
- Adquiera datos de un campo de visión de 1 cm x 1 cm utilizando una longitud de onda de 785 nm y láseres de 80 mW con una velocidad de fotogramas de 21 imágenes/s a una distancia de trabajo de 1 cm durante 1 min.
- Después de la imagen, aplique dos gotas de solución salina al 0,9% en el cráneo para rehidratarse, suturar la herida y colocar al animal en una cámara de recuperación a 37 ° C para recuperarse de la anestesia durante 1 h. Después de 1 h, devuelva a los ratones a sus jaulas en una habitación con temperatura controlada.
6. Neuropuntuación
NOTA: Para el análisis del déficit neurológico, se utiliza una escala neurológica modificada publicada por Eckenstein et al. en 199715.
- Puntuar a los animales por déficits generales (Tabla 1) y focales (Tabla 2). Esta escala compuesta oscila entre 0 (sin déficits) y 46 (deficiencias graves).
- Realice el neuropuntuación a la misma hora todos los días y use ropa quirúrgica para mantener un olor neutro.
- Habitúe a los ratones durante 30 minutos en la habitación con una jaula abierta antes de la prueba y permítales observar cada elemento durante 30 s.
7. Perfusión
- Prepare una jeringa de 20 ml que contenga PBS-heparina (2 U/ml) y colóquela 1 m por encima del banco para facilitar/asegurar la perfusión impulsada por la gravedad.
- Inyecte por vía intraperitoneal 100 μL de ketamina y xilazina (120/16 mg/kg de peso corporal, respectivamente). Espere 5 minutos y corrobore el cese del movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas.
- Fijar al animal en posición supina y desinfectar la superficie corporal abdominal con etanol al 100%. Haga una incisión de 3 cm de largo en el abdomen; cortar el diafragma y las costillas para visualizar completamente el corazón.
- Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha e inserte la cánula de perfusión en el ventrículo izquierdo y perfunda con 20 ml de PBS-heparina.
- Después de la perfusión, decapitar al animal y extraer el cerebro, congelarlo con hielo seco y almacenarlos a -80 ° C hasta su uso posterior.
8. Volumetría de infarto
- Crioseccionación: Cortar el cerebro en serie en un criostato a secciones de 20 μm de espesor cada 120 μm y montar en diapositivas. Guarde las diapositivas a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
- Tinción de violeta cresil (CV)
- Para preparar la solución de tinción, mezcle 0,5 g de acetato CV en 500 ml de H2O. Revuelva y caliente (60 °C) hasta que los cristales se disuelvan. Deje que la solución se enfríe y guárdelo en una botella oscura. Vuelva a calentar a 60 °C y filtre (filtro de papel) antes de cada uso.
- Secar los toboganes a temperatura ambiente durante 30 min. Colóquelos en etanol al 95% durante 15 minutos, seguido de etanol al 70% durante 1 minuto, y luego en etanol al 50% durante 1 minuto.
- Coloque los toboganes en agua destilada durante 2 minutos, refresque el agua destilada y vuelva a colocar los toboganes en agua durante 1 minuto. Luego, coloque las diapositivas en la solución de tinción precalentada durante 10 minutos a 60 ° C. Lave los toboganes dos veces en agua destilada durante 1 min.
- Coloque las diapositivas en etanol al 95% durante 2 min. Luego colóquelos en etanol al 100% durante 5 minutos, refresque el etanol al 100% y coloque las diapositivas en etanol al 100% nuevamente durante 2 minutos. Después, cubra las diapositivas con un medio de montaje.
- Análisis: Escanear las diapositivas y analizar el volumen del infarto indirecto por el método de Swanson16 para corregir el edema: Área isquémica = (región isquémica)-((hemisferio ipsilateral) - (hemisferio contralateral)).
9. Tinción tunel (kit de detecciónde apoptosis in situ)
- Secar los portaobjetos, post-fijar en paraformaldehído al 4% en PBS (ph 7.4) durante 10-20 min en RT. Lavar en PBS, post-fijar en etanol preenfriado: ácido acético 2:1 durante 5 min a -20 °C.
- Lavar en PBS y aplicar tampón de equilibrio (10 s a un máximo de 60 min en RT) y aplicar la enzima TdT de fuerza de trabajo (1 h a 37 °C en cámara humidificada)
- Aplique la enzima de parada/ lavado de fuerza de trabajo (10 min a RT), lave en PBS y aplique conjugado anti-digoxigenina de fuerza de trabajo calentada (RT) (30 min a RT en la oscuridad)
- Lavar en PBS, incubar con DAPI durante 5 min en RT y montar los portaobjetos con medios fluoromontables.
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Representative Results
El modelo descrito aquí es un modelo de trazo fototrombótico por inyección de Rose Bengal e iluminación intacta del cráneo durante 20 min, a una longitud de onda constante de 561 nm y una potencia de salida de 25 mW en la fibra. Aunque la cirugía fototrombótica completa dura 30 min, el animal se mantiene bajo anestesia baja y el daño cerebral es moderado. Aproximadamente 10 minutos después de la transferencia a sus jaulas, todos los animales estaban despiertos, moviéndose libremente en la jaula e interactuando con sus compañeros de camada.
La volumetría del infarto se realizó utilizando secciones cerebrales coronales seriadas teñidas de violeta cresilo 24 h después de la inducción del accidente cerebrovascular(Figura 2A). El volumen medio de infarto fue de 29,3 mm3,representando el 23% de un hemisferio cerebral. Además, la variabilidad de este modelo de accidente cerebrovascular es excepcionalmente baja con una desviación estándar de aproximadamente el 3,5%(Figura 2B). El área de la lesión abarca la corteza motora sin la afección de las estructuras subcorticales.
La fototrombosis causó un deterioro sensoriomotor moderado y a largo plazo, indicado por el compuesto Neuroscore17 (Figura 3); los déficits generales y focales se midieron 24 h, 3 días y 7 días después de la cirugía. El Neuroscore general tiene cinco ítems, incluyendo la evaluación del pelaje, orejas, ojos, postura y actividad espontánea, con una puntuación máxima de 18 (Tabla 1). El Neuroscore focal comprende siete ítems, incluyendo la evaluación de la simetría corporal, la marcha, la escalada, el comportamiento en círculos, la simetría de las extremidades anteriores, el ciclismo obligatorio y la respuesta de los bigotes, con una puntuación máxima de 28 (Tabla 2). Los animales con accidente cerebrovascular tuvieron un cambio significativo en la neuropuntuación compuesta 24 horas después de la cirugía en comparación con los animales operados por simulación. Estas diferencias persistieron, aunque los ratones con accidente cerebrovascular mejoraron con el tiempo(Figura 3).
La mortalidad durante el tiempo de observación rara vez ocurre en el 1-2% de los animales. En este informe, ninguno de los 10 animales estudiados tuvo que ser excluido y todos ellos sobrevivieron al período de observación de 7 días. El peso corporal y los cambios de temperatura en los ratones fueron monitoreados a las 24 h, 3 días y 7 días después de la cirugía(Figura 4A,B). Los datos mostraron que el peso corporal y la temperatura disminuyeron 24 h después de la cirugía solo en el grupo de iluminación Rose Bengal +, pero se recuperaron al nivel de los animales operados por Sham en 3 días después de la cirugía.
Para confirmar una inducción de cambios isquémicos, 24 horas después de la cirugía, los animales se sometieron a una prueba de imagen con láser. Una imagen de contraste de manchas láser midió la perfusión sanguínea de la corteza durante 1 minuto y se obtuvo una imagen codificada por colores promedio para cada animal. Esto demuestra que rose bengal o iluminación láser por sí sola no produce una lesión, mientras que la aplicación simultánea de Rose Bengal y la iluminación láser genera un área redonda hipoperfundida de 4 mm de diámetro rodeada por una zona oligémica estrecha(Figura 5A). Además, una tinción de violeta cresyl y Tunel para la evaluación del volumen del infarto 24 h después de la cirugía no reveló daño tisular ni en cirugías de rosa de Bengala ni en las de iluminación láser. Por otro lado, Rose Bengal + iluminación láser generó una lesión bien demarcada(Figura 5B).
Tabla 1: Neuroscore General. Por cada uno de los cinco déficits generales medidos, los animales pueden recibir entre 0 y 4 puntos dependiendo de la gravedad. Los puntajes en las cinco áreas se suman para proporcionar un puntaje general total que varía de 0 a 18. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Neuropuntuación Focal. Por cada uno de los siete déficits generales medidos, los animales pueden recibir entre 0 y 4 puntos dependiendo de la gravedad. Los puntajes en las cinco áreas se suman para proporcionar un puntaje general total que varía de 0 a 28. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Figura 1: Fototrombosis (PT). Diagrama que representa el área fototrombótica, a 3 mm de Bregma. El punto verde indica la posición del láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de infarto volumétrico y resultado del infarto 24 h después de PT. (A) Cerebro coronal teñido de violeta cresil representativo, secciones cada 120 μm a las 24 h después de PT. Líneas discontinuas demarcan el área de la lesión. (B) Análisis del volumen de infarto de 10 cerebros (cada punto representa un cerebro individual) 24 h después de PT. La línea roja horizontal representa la media (29,32 mm3), las barras de error indican la desviación estándar (3,45 mm3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Neuropuntuación para déficits funcionales después de la PT. Neuroscore compuesto antes, 24 h, 3 días y 7 días después de PT. BL = antes de PT, RB = Rosa de Bengala. n = 5 por grupo. *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:Análisis de peso corporal y temperatura después de PT. (A) El peso corporal y (B) la temperatura se redujeron ligeramente en animales PT en comparación con los grupos operados por simulación a las 24 h y se recuperaron 3 días después de PT. BL = antes de PT, RB = Rosa de Bengala. n = 5 por grupo.*p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Confirmación de la lesión después de la PT. (A) Imágenes de manchas láser (B) Violeta cresílico (paneles superiores) y tinción Tunel (paneles inferiores) confirmaron la lesión solo después de la administración de Rose Bengal y la posterior iluminación láser. RB = Rosa de Bengala. Barra de escala = 1.000 μm en el panel superior B, barra de escala = 20 μm en el panel inferior B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo presentado describe el modelo experimental de accidente cerebrovascular de fototrombosis iluminando el cráneo intacto con un láser de 561 nm, con una inyección intraperitoneal previa de Rosa de Bengala. Hasta hace poco, el uso de este modelo ha sido bajo, pero está aumentando constantemente.
La mortalidad durante la inducción del accidente cerebrovascular en este modelo está ausente. La mortalidad global de menos del 5% surge durante la operación debido a complicaciones anestesiológicas o sacrificio después de cumplir con los criterios de exclusión. Para garantizar la baja variabilidad de este modelo y su reproducibilidad, se sugieren los siguientes criterios de exclusión: 1) tiempo de operación superior a 30 min; 2) infección de la sutura; 3) herida por mordedura; y 4) sin infarto o sin asimetría previa a las 24 h después de la PT.
Un modelo experimental de accidente cerebrovascular ampliamente utilizado es la oclusión transitoria del MCA, mediante el uso de un filamento de sutura, que se introduce en la arteria carótida interna hasta que la punta recubierta de silicio ocluye el origen del MCA. Este modelo permite la reperfusión mediante la eliminación del filamento e imita el escenario clínico humano, en el que se realiza una restauración del flujo sanguíneo cerebral tras la lisis espontánea o terapéutica (rtPA) de un coágulo embólico18,19. Sin embargo, implica una cirugía compleja con alta variabilidad del infarto final y alta tasa de mortalidad10. Por el contrario, la oclusión permanente del MCA distal de las arterias lenticuloestriatales se puede lograr mediante la coagulación de la arteria20,21,que induce lesiones definidas localmente en el neocórtex22. Aunque este modelo tiene una menor tasa de mortalidad, requiere cirugía invasiva al animal por trepanación del cráneo sobre el MCA para posteriormente coagularlo23. En consecuencia, se requieren altas habilidades quirúrgicas para un estudio de accidente cerebrovascular in vivo exitoso e imparcial.
En comparación con otros modelos de isquemia cerebral, el modelo fototrombótico como se lleva a cabo en este video tiene la ventaja de no tener craneotomía o cirugía mayor en el animal, a diferencia de otros modelos que involucran cirugías complejas o craneotomía cerebral. Además, la simple ejecución del modelo hace que la cirugía sea accesible para muchos con un entrenamiento que consume poco tiempo. La baja mortalidad, el volumen moderado de infarto y la flexibilidad para inducir la lesión a una región específica del cerebro, enfatizan la ventaja de este paradigma experimental para la regeneración cerebral y los estudios de accidente cerebrovascular24,25,26,27.
A pesar de las ventajas obvias, se deben tener en cuenta algunas limitaciones de este modelo de accidente cerebrovascular. La larga exposición de los anestésicos al animal podría ser un factor crítico a tener en cuenta, ya que el impacto de los anestésicos en la neuroprotección y el resultado del accidente cerebrovascular ya es bien conocido28. Aunque la duración de este procedimiento quirúrgico dura aproximadamente 30 min, el animal puede estar bajo bajas concentraciones anestésicas debido a la mínima manipulación del animal durante los 20 min de iluminación láser. Debido a que este modelo induce lesiones cerebrales moderadas, solo los déficits conductuales menores son detectables. Por lo tanto, los sistemas de prueba más avanzados con mayor sensibilidad y parámetros de prueba cualitativos, como la prueba de alcance experto29 y Neuroscore17,como se describe aquí, pueden ser más adecuados para detectar resultados funcionales a largo plazo en este modelo. Finalmente, debido a la agregación permanente de las plaquetas en los vasos sanguíneos iluminados, no se puede obtener reperfusión, que es una característica observada en un porcentaje sustancial de pacientes con accidente cerebrovascular debido a la lisis espontánea de coágulos o terapia30.
Un modelo similar de accidente cerebrovascular fototrombótico fue publicado en 2013 por Labat-gest y Tomasi, describiendo un protocolo PT utilizando una lámpara de luz fría en lugar de un láser verde de 561 nm8. Tanto el láser como las fuentes de luz fría se pueden utilizar para inducir la excitación de Rose Bengal. Una ventaja de las fuentes de luz basadas en láser sobre las lámparas de luz fría es que los láseres se pueden usar para apuntar a arteriolas superficiales individuales para la coagulación in vivo específica de un vaso31. Aunque no nos dirigíamos a arteriolas específicas, utilizamos un láser verde de 561 nm para la inducción de iluminación cerebral y fototrombosis, debido al pico de absorción de rosa de Bengala a 562 nm. Para garantizar una intensidad láser adecuada durante la iluminación, se utilizó el Cobolt Monitor Software-6.1.0.0 para calibrar el láser. Además, en el presente estudio una dosis de Rose Bengal de 10 μL/g (100 μg/g) fue suficiente para inducir fototrombosis, mientras que el protocolo anterior informó una dosis más alta (150 μg/g)8. Además, el protocolo proporciona un método conductual para analizar el resultado del accidente cerebrovascular (Neuroscore) y un grupo adicional de control simulado (iluminación láser) para demostrar que el láser en sí no produce ningún daño tisular, por lo que solo la combinación de Rose Bengal + iluminación láser induce una lesión cerebral.
En general, este procedimiento quirúrgico directo no invasivo permite una alta reproducibilidad y direccionalidad de la lesión del accidente cerebrovascular en el cerebro junto con la posibilidad de observación a largo plazo debido a la mortalidad mínima. Este modelo de trazo fototrombótico se distingue como un valioso paradigma experimental para la investigación básica y traslacional del ictus.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos nuestros socios de colaboración de los Consorcios de Immunostroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) por sus sugerencias y discusiones. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania en el marco del Clúster de Munich para neurología de sistemas (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) y bajo las subvenciones LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 y LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
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