Summary
Burada açıklanan fototrombotik inme modeli, bir inmenin, ışığa duyarlı bir boyanın kullanılmasından sonra lazer aydınlatma kullanılarak kalıcı mikrovasküler tıkanıklık indüklenerek sağlam kafatasından üretildiği yerdir.
Abstract
İnme, gelişmiş ülkelerde önde gelen bir ölüm nedeni ve edinilmiş yetişkin engelidir. Yeni terapötik stratejiler için kapsamlı araştırmalara rağmen, inme hastaları için sınırlı terapötik seçenekler vardır. Bu nedenle, inme sonrası inflamasyon, anjiogenez, nöronal plastisite ve rejenerasyon gibi patofizyolojik yollar için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. İn vitro modellerin beynin karmaşıklığını yeniden üretememesi göz önüne alındığında, deneysel inme modelleri bu mekanizmalar için yeni ilaç hedeflerinin analizi ve daha sonra değerlendirilmesi için gereklidir. Buna ek olarak, sözde çoğaltma krizinin üstesinden gelmek için tüm prosedürler için ayrıntılı standartlaştırılmış modellere acilen ihtiyaç vardır. ImmunoStroke araştırma konsorsiyumu içinde bir çaba olarak, Rose Bengal'in intraperitoneal enjeksiyonu ve sağlam kafatasının 561 nm lazerle aydınlatılması kullanılarak standartlaştırılmış bir fototrombotik fare modeli tanımlanmıştır. Bu model, invaziv cerrahi olmadan beynin herhangi bir kortikal bölgesine tahsisi ile farelerde inme performansına izin verir; böylece, beynin çeşitli bölgelerinde inme çalışmasını sağlar. Bu videoda histolojik analiz ile birlikte fototropombotik modelde inme indüksiyonunun cerrahi yöntemleri gösterilmiştir.
Introduction
İskemik inme, 2017 yılındadünyaçapında yaklaşık 2,7 milyon ölümün 21. Bilim camiasının muazzam çabalarına rağmen, çok az tedavi mevcuttur. Ayrıca, bu kadar yüksek dışlama kriterleri ile, zaten sınırlı olan bu seçeneklere birçok hasta erişilemez, bu da inme sonrası fonksiyonel iyileşmeyi iyileştirmek için yeni tedavilere acil bir ihtiyaçla sonuçlanır.
İn vitro modellerin beynin karmaşık etkileşimlerini kopyalayamamaları göz önüne alındığında, hayvan modelleri preklinik inme araştırmaları için gereklidir. Fareler inme araştırma alanında en sık kullanılan hayvan modelidir. Bu fare modellerinin çoğunluğu, insan inme lezyonlarının çoğunluğu MCA bölgesinde bulunduğundan orta serebral arter (MCA) içindeki kan akışını engelleyerek enfarktüsleri teşvik etmeyi amaçlamaktadır2. Bu modeller insan inme lezyonlarını daha iyi rekapitüle etse de, enfarktüs hacim değişkenliği yüksek konvülatlı ameliyatları içerir.
Rosenblum ve El-Sabban'ın 1977'de fototropombotik modelin önerisinden bu yana3ve daha sonra bu modelin sıçanlara uygulanması Watson ve ark.4, iskemik inme araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaya başladı5,6. Fototropotik inme modeli, daha önce kan akışına enjekte edilen ışığa duyarlı bir boyanın fotoaktivasyonu sonucu lokal ve tanımlanmış bir kortikal enfarktüse neden olur. Bu, ışığa maruz kalan bölgelerdeki damarların lokal trombozuna neden olur. Kısaca, enjekte edilen ışığa duyarlı boyadan ışığa maruz kalınca, endotel hücre zarının lokalize oksidatif yaralanması indüklenir, trombosit toplama ve trombüs oluşumuna yol haline getirilir, ardından serebral kan akışının lokal bozulması7.
Bu tekniğin temel avantajı, uygulama basitliği ve lezyonun istenen bölgeye yönlendirilmesi olasılığındadır. Diğer deneysel inme modellerinden farklı olarak, lezyon sağlam kafatasının aydınlatılmasıyla indüklendikçe fototropombotik inme modelini gerçekleştirmek için küçük cerrahi uzmanlığa ihtiyaç vardır. Ayrıca, iyi sınırlanmış sınırlar (Şekil 2A ve Şekil 5B) ve lezyonu belirli bir beyin bölgesine teşvik etme esnekliği, iskemik veya bozulmamış kortikal alan içindeki hücresel yanıtların incelenmesini kolaylaştırabilir8. Bu nedenlerden dolayı, bu yaklaşım kortikal plastisitenin hücresel ve moleküler mekanizmalarının incelenmesi için uygundur.
Son birkaç on yılda, araştırma grupları arasında tekrarlanabilirlik eksikliği ile ilgili artan endişe, sözde çoğaltma krizi9. 2015 yılında ilk preklinik randomize kontrollü çok merkezli deneme çalışmasının koordinasyonundan sonra10, preklinik araştırma11 , 12,13geliştirmek için önerilen bir araç , bağımsız laboratuvarlardan preklinik çalışmalar arasında tekrarlanabilirliğin başarısız olmasının bir nedeninin deneysel inme modellerinin ve sonuç parametrelerinin yeterli standardizasyonunun olmaması olduğu doğrulandı14. Buna göre, inme iyileşmesinin mekanistik ilkelerinin altında kalan beyin-bağışıklık etkileşimlerini anlamayı amaçlayan bir işbirliği olan ImmunoStroke konsorsiyumu kurulduğunda (https://immunostroke.de/), her araştırma grubu arasındaki tüm deneysel inme modellerinin standardizasyonu esastı.
Burada açıklanan, yukarıda belirtilen araştırma konsorsiyumunda kullanıldığı gibi fototropombotik modelin indüksiyonu için standartlaştırılmış prosedürdür. Kısaca, bir hayvana anestezi uygulandı, intraperiton olarak bir Gül Bengal enjeksiyonu (10 μL / g) alındı ve bregma'dan 3 mm kalan sağlam kafatası, 20 dakika boyunca 561 nm lazerle hemen aydınlatıldı (Şekil 1). Ayrıca, bu modeldeki inme sonucunu analiz etmek için ilgili bir histolojik ve davranışsal yöntem bildirilmiştir. Tüm yöntemler laboratuvarda geliştirilen ve kullanılan standart çalışma prosedürlerine dayanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu videoda bildirilen deneyler, deney hayvanlarının kullanımına ilişkin ulusal yönergelere göre yapılmış ve protokoller Alman hükümet komiteleri (Regierung von Oberbayern, Münih, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan fareler, 10-12 haftalık erkek C57Bl/6J farelerdi ve Charles River Germany tarafından sevk edildi. Hayvanlar kontrollü sıcaklıklar (22 °C ± 2 °C) altında, 12 saat açık-karanlık döngü süresi ve peletlenmiş yiyecek ve su reklam libitum erişimi ile yerleştirildi.
1. Malzeme ve aletlerin hazırlanması
- 10 mg/ mL'lik son konsantrasyona ulaşmak için Rose Bengal'i% 0.9 salin çözeltisinde çözün. Çalışma alanını sıcak tutmak ve anestezi sırasında fare gövdesi sıcaklığını 37 °C'de tutmak için ısı battaniyesini bağlayın.
- Makas, toparla, pamuk parçaları, dekpanthenol göz merhem ve dikiş malzemesi hazırlayın. Operasyon bölgesini nemli tutmak için tuzlu su çözeltisi (iğnesiz) ile bir şırınga hazırlayın. Anestezi gazını hazırlayın (%100 O2 + izofluran).
2. Hayvanın hazırlanması
- Ameliyattan 30 dakika önce analjezi enjekte edin (4 mg/kg Carprofen ve 0.1 mg/kg Buprenorfin).
- Enjekte edilecek Rose Bengal dozunu ayarlamak için fare gövdesi ağırlığını kaydedin (10 μL/ g yani, 100 μg / g).
- Fareyi, vücudun ve vibrissae'nin spontan hareketi durana kadar uyuşturmak için% 4'lük bir izofluran akış hızına sahip indüksiyon odasına yerleştirin.
- Fareyi stereotaktik çerçeveye aktarın ve burnuyla anestezi maskesine eğilimli bir konuma getirin. Hayvanı sabitle ve izofluran konsantrasyonu 1 dakika boyunca% 4'te tut. Daha sonra izofluran konsantrasyonu% 2 oranında azaltın ve koruyun.
- Cerrahi prosedürler boyunca sıcaklığı izlemek için rektal probu hafifçe yerleştirin. Fare gövdesi sıcaklığını 37 °C'de tutmak için ilgili geri bildirim kontrollü ısıtma yastığını ayarlayın.
- Her iki göze de dekpanthenol göz merhemi uygulayın ve cildi ve çevresindeki kürkü bir dezenfektan maddesi ile temizleyin.
3. Fotorofoz modeli
- Kafatasını ortaya çıkarmak için 2.0-2.5 cm boyuna bir kesi yapın ve geri çekin. Yara komplikasyonlarını önlemek için kafatasına maruz kalmayı tek bir kesikle gerçekleştirin.
- Periosteumu pamukla nazikçe çıkarın ve koronal dikişleri tanımlayın.
- Koruyucu gözlükleri takın, 561 nm lazeri takın ve bregma +3 mm sola işaretleyin.
- Lazeri kapatın, yukarıda belirtilen işaretli koordinatlara yerleştirilmiş 4 mm çapında bir delikli bir etiket takın.
- Fareye intraperitoneally Bengal Rose (10 μL / g) enjekte edin. Lazer ışınını kafatasından 4-5 cm'ye yerleştirin, 561 nm lazeri kapatın ve kafatasını 20 dakika aydınlatın.
- Yeniden sulandırmak, yarayı dikmek ve anesteziden kurtulmak için hayvanı 37 ° C'de bir iyileşme odasına yerleştirmek için kafatasına iki damla% 0.9 salin uygulayın. 1 saat sonra, fareleri sıcaklık kontrollü bir odada kafeslerine geri koyun.
- Ameliyattan sonra 3 gün boyunca her 12 saatte bir analjezi enjekte edin (4 mg/kg Carprofen ve 0.1 mg/kg Buprenorfin).
4. Sham operasyonu
- 4.1.1 ve 4.1.2 adımlarında açıklandığı gibi sham işlemlerinin iki farklı prosedürünü gerçekleştirin.
- Tüm yordamları yukarıda açıklanan işlemle aynı şekilde gerçekleştirin. Lazeri açmadan Rose Bengal'e enjekte et. Anestezi altında 20 dakika sonra, hayvanların kafeslerine geri dönmeden önce iyileşme odasında 1 saat kalmasına izin verin.
- Lazeri açarak tüm prosedürleri yukarıda açıklanan operasyonla aynı şekilde gerçekleştirin. Rose Bengal'e enjekte etmeyin. 20 dakikalık lazer aydınlatmadan sonra, hayvanların kafeslerine geri dönmeden önce anesteziden kurtulmak için 1 saat boyunca iyileşme odasında kalmalarına izin verin.
5. Lazer benek
- Çalışma alanını sıcak tutmak ve anestezi sırasında fare gövdesi sıcaklığını 37 °C'de tutmak için ısıtılmış battaniyeyi bağlayın.
- Fareyi, vücudun ve vibrissae'nin spontan hareketi durana kadar uyuşturmak için% 4'lük bir izofluran akış hızına sahip indüksiyon odasına yerleştirin ve ardından fareyi stereotaktik çerçeveye aktarın.
- Fareyi burnu anestezi maskesine doğru eğilimli bir konuma getirin. Hayvanı sabitle ve izofluran konsantrasyonu 1 dakika boyunca% 4'te koruyun.
- Cerrahi prosedürler boyunca sıcaklığı izlemek için rektal probu hafifçe yerleştirin. Fare gövdesi sıcaklığını 37 °C'de tutmak için ilgili geri bildirim kontrollü ısıtma yastığını ayarlayın ve her iki göze de dekpanthenol göz merhemi uygulayın. Cildi ve çevresindeki kürkü bir dezenfektan maddesi ile temizleyin.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için 2.0-2.5 cm boyuna bir kesi yapın ve geri çekin. Yara komplikasyonlarını önlemek için kafatasına maruz kalmayı tek bir kesikle gerçekleştirin.
- Sterotaktik çerçeveyi lazer lekesinin altına yerleştirin ve keskin bir görüntü elde etmek için yüksekliği ayarlayın. Lazer benekli perfüzyon görüntüleme (LSI) kamerasını kranial pencereye odakla. Yüksek çözünürlüklü lazer benek görüntüleme (LSI) kamera sistemini daha önce açıklandığı gibi yapılandırın15.
- 1 cm çalışma mesafesinde 21 görüntü/s kare hızına sahip 785 nm dalga boyu ve 80 mW lazer kullanarak 1 cm x 1 cm görüş alanından veri alın.
- Görüntülemeden sonra, yeniden su vermek, yarayı dikiş etmek ve hayvanı 1 saat boyunca anesteziden kurtulmak için 37 ° C'de bir iyileşme odasına yerleştirmek için kafatasına iki damla% 0.9 salin uygulayın. 1 saat sonra, fareleri sıcaklık kontrollü bir odada kafeslerine geri koyun.
6. Nöroscore
NOT: Nörolojik eksiklik analizi için Eckenstein ve ark. tarafından 1997 yılında yayınlanan modifiye nörolojik ölçek15.
- Hayvanları genel (Tablo 1) ve odak açıkları için puanla (Tablo 2). Bu bileşik ölçek 0 (açık yok) ile 46 (ciddi bozukluklar) arasında değişmektedir.
- Nöroscore'u her gün aynı saatte gerçekleştirin ve nötr bir kokuyu korumak için cerrahi kıyafetler kullanın.
- Fareleri test etmeden önce açık bir kafesle odada 30 dakika boyunca alışkanlık haline getirin ve her öğeyi 30 s boyunca gözlemlemelerine izin verin.
7. Perfüzyon
- PBS-heparin (2 U/mL) içeren 20 mL şırınna hazırlayın ve yerçekimi tahrikli perfüzyonu kolaylaştırmak /sağlamak için tezgahın 1 m üstüne yerleştirin.
- intraperitoneally enjekte 100 μL ketamin ve ksilazin (sırasıyla 120/16 mg/kg vücut ağırlığı). 5 dakika bekleyin ve spontan vücut hareketinin ve vibrissae'nin durmasını doğrula.
- Hayvanı sırtüstü bir pozisyonda sabitlayın ve karın vücut yüzeyini% 100 etanol ile dezenfekte edin. Karın bölgesinde 3 cm uzunluğunda bir kesi yapın; kalbi tamamen görselleştirmek için diyaframı ve kaburgaları kesin.
- Sağ kulakçıkta küçük bir kesi yapın ve perfüzyon kanülini sol ventrikül içine yerleştirin ve 20 mL PBS-heparin ile perfuse yapın.
- Perfüzyondan sonra, hayvanın kafasını koparın ve beyni çıkarın, kuru buz kullanarak dondurun ve bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
8. Enfarktüs hacmi
- Kriyoseksiyon: Beyni bir kriyostat üzerinde seri olarak her 120 μm'de 20 μm kalınlığında bölümlere kesin ve slaytlara monte edin. Bir sonraki işleme kadar slaytları -80 °C'de saklayın.
- Cresyl mor (CV) boyama
- Boyama çözeltisini hazırlamak için, 500 mL H2O'da 0,5 g CV asetat karıştırın ve kristaller çözünene kadar ısıtın (60 °C). Çözeltinin soğumasını bekleyin ve koyu bir şişede saklayın. Her kullanımdan önce 60 °C'ye ısıtın ve filtreleyin (kağıt filtresi).
- Slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kurutun. Onları 15 dakika boyunca% 95 etanol, ardından 1 dakika boyunca% 70 etanol ve daha sonra 1 dakika boyunca% 50 etanol içine yerleştirin.
- Slaytları 2 dakika damıtılmış suya yerleştirin, damıtılmış suyu yenileyin ve slaytları 1 dakika boyunca tekrar suya yerleştirin. Ardından, slaytları önceden ısıtılmış boyama çözeltisine 60 °C'de 10 dakika yerleştirin. Slaytları damıtılmış suda iki kez 1 dakika yıkayın.
- Slaytları 2 dakika boyunca% 95 etanol içine yerleştirin. Sonra onları 5 dakika boyunca% 100 etanol içine yerleştirin,% 100 etanol yenileyin ve slaytları tekrar 2 dakika boyunca% 100 etanol içine yerleştirin. Daha sonra, slaytları bir montaj ortamı ile örtün.
- Analiz: Slaytları tarayın ve ödemi düzeltmek için Swanson yöntemi16 ile dolaylı enfarktüs hacmini analiz edin: İskemik alan = (iskemik bölge)-((ipsilateral yarımküre) - (kontrallateral yarımküre)).
9. Tunel boyama(yerinde apoptoz tespit kiti)
- Slaytları kurutun, PBS'de %4 paraformaldehitte (ph 7.4) 10-20 dakika boyunca RT'de yıkayın.
- PBS'de yıkayın ve denge tamponu uygulayın (RT'de maksimum 60 dakikaya 10 sn) ve çalışma mukavemeti TdT enzimi (nemlendirilmiş odada 37 °C'de 1 saat) uygulayın
- Çalışma mukavemeti durdurma/yıkama enzimi uygulayın (RT'de 10 dk), PBS'de yıkayın ve ısıtılmış (RT) çalışma mukavemeti anti-digoksigenin konjuge uygulayın (karanlıkta RT'de 30 dk)
- PBS'de yıkayın, RT'de 5 dakika DAPI ile kuluçkaya yatırın ve slaytları florokmount ortamla monte edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan model, Rose Bengal enjeksiyonu ve 20 dakika boyunca bozulmamış kafatası aydınlatması ile, fiberde sabit bir 561 nm dalga boyunda ve 25 mW çıkış gücünde fototropotik bir inme modelidir. Fototropotik cerrahinin tamamı 30 dakika sürmesine rağmen, hayvan düşük anestezi altında tutulur ve beyin hasarı orta derecededir. Kafeslerine transfer edildikten yaklaşık 10 dakika sonra, tüm hayvanlar uyanıktı, kafeste serbestçe hareket ediyordu ve çöp arkadaşlarıyla etkileşime giriyordu.
İnfarktüs hacimliliği inme indüksiyonu sonrası 24 saat cresyl violet lekeli seri koronal beyin bölümleri kullanılarak gerçeklendirilmiştir(Şekil 2A). Ortalama enfarktüs hacmi 29.3 mm3idi , bir beyin yarımküresinin% 23'ünü temsil ediyordu. Ayrıca, bu strok modelinin değişkenliği yaklaşık% 3,5 standart sapma ile son derece düşüktür (Şekil 2B). Lezyon alanı, subkortikal yapıların sevgisi olmadan motor korteksi kapsar.
Fotoromboz, kompozit Neuroscore17 (Şekil 3) ile belirtilen orta, uzun süreli sensorimotor bozukluğuna neden oldu; genel ve odak açıkları ameliyattan 24 saat, 3 gün ve 7 gün sonra ölçüldü. Genel Neuroscore, kürk, kulak, göz, duruş ve spontan aktivitenin değerlendirilmesi dahil olmak üzere maksimum 18 puan alan beş öğeye sahiptir (Tablo 1). Odak Nöroscore, vücut simetrisinin değerlendirilmesi, yürüyüş, tırmanma, daire davranışı, ön ayak simetrisi, zorunlu bisiklet ve bıyık tepkisi dahil olmak üzere en fazla 28 puan alan yedi maddeden oluşur (Tablo 2). İnme hayvanları, ameliyattan sonra Sham tarafından ameliyat edilen hayvanlara kıyasla kompozit nöroscore 24 saat içinde önemli bir değişiklik yaşadı. İnme fareleri zamanla iyileşmesine rağmen bu farklılıklar devam etti(Şekil 3).
Gözlem süresi boyunca mortalite nadiren hayvanların% 1-2'sinde görülür. Bu raporda, incelenen 10 hayvanın hiçbirinin dışlanmaları gerekmemiştir ve hepsi 7 günlük gözlem süresinden sağ çıkmıştır. Farelerdeki vücut ağırlığı ve sıcaklık değişimleri ameliyattan 24 saat, 3 gün ve 7 gün sonra izlendi (Şekil 4A,B). Veriler, sadece Rose Bengal + aydınlatma grubunda ameliyattan sonra vücut ağırlığının ve sıcaklığının 24 saat azaldığını, ancak ameliyattan sonraki 3 gün içinde Sham tarafından işletilen hayvanların seviyesine geri kazanıldığını gösterdi.
İskemik değişikliklerin indüksiyonunu doğrulamak için, ameliyattan 24 saat sonra, hayvanlar lazer görüntüleme testinden geçirildi. Lazer benek kontrast görüntülemesi korteksin kan perfüzyonunu 1 dakika boyunca ölçtü ve her hayvan için ortalama renk kodlu bir resim elde edildi. Bu, Rose Bengal veya lazer aydınlatmanın tek başına bir lezyon üretmediğini gösterirken, Rose Bengal ve lazer aydınlatmanın eşzamanlı uygulaması, dar bir olijemik bölge ile çevrili 4 mm çapında yuvarlak bir hipoperfüze alan oluşturur (Şekil 5A). Ek olarak, ameliyattan sonra 24 saat enfarktüs hacminin değerlendirilmesi için bir kresil menekşe ve Tunel lekeleme, Rose Bengal veya lazer aydınlatma ameliyatlarında doku hasarı olmadığını ortaya koydu. Öte yandan, Rose Bengal + lazer aydınlatma iyi çizilmiş bir lezyon üretti (Şekil 5B).
Tablo 1: Genel Neuroscore. Ölçülen beş genel açığın her biri için, hayvanlar şiddetine bağlı olarak 0 ila 4 puan alabilirler. Beş alandaki puanlar daha sonra 0-18 arasında değişen toplam genel bir puan sağlamak için toplanır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Odak Nöroscore. Ölçülen yedi genel açığın her biri için, hayvanlar şiddetine bağlı olarak 0 ila 4 puan alabilirler. Beş alandaki puanlar daha sonra 0-28 arasında değişen toplam genel bir puan sağlamak için toplanır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 1: Fotoromboz (PT). Bregma'dan 3 mm uzaklıktaki fototropotik alanı gösteren diyagram. Yeşil nokta lazerin konumunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hacimsel enfarktüs analizi ve enfarktüs sonucu PT'den 24 saat sonra. (A) Temsili cresyl violet lekeli koronal beyin, PT'den sonra 24 saat her 120 μm'de bölümler. (B) PT'den 24 saat sonra 10 beynin enfarktüs hacim analizi (her bir beyin bir ayrı beyni temsil eder). Yatay kırmızı çizgi ortalamayı temsil eder (29,32 mm3),hata çubukları standart sapmayı (3,45 mm3)gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PT sonrası fonksiyonel açıklar için nöroscore. Kompozit Neuroscore önce, 24 saat, 3 gün ve 7 gün sonra PT. BL = ÖNCE PT, RB = Rose Bengal. n = Grup başına 5. *p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: PT. (A) Vücut ağırlığı ve(B)sonrası vücut ağırlığı ve sıcaklık analizi, PT hayvanlarında 24 saatte Sham tarafından işletilen gruplara kıyasla biraz azaldı ve PT. BL = PT'den 3 gün önce, RB = Rose Bengal'den sonra iyileşti. n = Grup başına 5.*p < 0,05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: PT sonrası lezyon onayı. (A) Lazer Benek görüntüleme (B) Cresyl violet (üst paneller) ve Tunel boyama (alt paneller) lezyonu ancak Rose Bengal ve sonraki lazer aydınlatması sonrasında doğruladı. RB = Gül Bengal. Ölçek çubuğu = üst panel B'de 1.000 μm, B alt panelinde ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan protokol, sağlam kafatasını 561 nm lazerle aydınlatarak, rose Bengal'in önceki intraperitoneal enjeksiyonu ile fotorombozun deneysel inme modelini açıklar. Yakın zamana kadar, bu modelin kullanımı düşük olmuştur, ancak sürekli olarak artmaktadır.
Bu modelde inme indüksiyonu sırasında mortalite yoktur. Genel mortalite% 5'ten az, ameliyat sırasında anestezik komplikasyonlar veya dışlama kriterlerini yerine geldikten sonra kurban etme nedeniyle ortaya çıkar. Bu modelin düşük değişkenliğini ve tekrarlanabilirliğini garanti etmek için aşağıdaki dışlama kriterleri önerilir: 1) 30 dakikadan uzun çalışma süresi; 2) dikiş enfeksiyonu; 3) ısırık yarası; ve 4) PT'den sonra 24 saat içinde enfarktüs veya ön asimetri yoktur.
Yaygın olarak kullanılan deneysel strok modelleri, silikon kaplı uç MCA'nın kökenini tıkayana kadar iç karotid arterde tanıtılan bir dikiş filamenti kullanılarak MCA'nın geçici tıkanıklığıdır. Bu model filamenti çıkararak reperfüzyona izin verir ve embolik bir pıhtının spontan veya terapötik (rtPA) lizizden sonra serebral kan akışının restorasyonunun olduğu insan klinik senaryosunu taklit eder18,19. Bununla birlikte, son enfarktüs ve yüksek ölüm oranı10'unyüksek değişkenliğine sahip karmaşık bir cerrahi içerir. Buna karşılık, lentikülostriatal arterlerin MCA distalinin kalıcı tıkanması, neokorteks22'delokal olarak tanımlanmış lezyonlara neden olan arter 20,21'inpıhtılaşmasıyla elde edilebilir. Bu model daha düşük bir ölüm oranına sahip olmasına rağmen, daha sonra pıhtılaştırmak için kafatasının MCA üzerinde trepanasyonu ile hayvana invaziv cerrahi gerektirir23. Sonuç olarak, başarılı ve tarafsız bir in vivo inme çalışması için yüksek cerrahi beceriler gereklidir.
Diğer beyin iskemi modellerine kıyasla, bu videoda gerçekleştirilen fototropotik model, karmaşık ameliyatlar veya beyin kraniyotomisi içeren diğer modellerin aksine, hayvan üzerinde kraniyotomi veya büyük bir ameliyat olmaması avantajına sahiptir. Ayrıca, modelin basit bir şekilde yürütülmesi, düşük zaman alan eğitimlerle ameliyatı birçok kişi için erişilebilir hale getirir. Düşük mortalite, orta enfarktüs hacmi ve lezyonu belirli bir beyin bölgesine indükleme esnekliği, beyin yenilenmesi ve inme çalışmaları için bu deneysel paradigmanın avantajını vurgulamaktadır24,25,26,27.
Bariz avantajlara rağmen, bu inme modelinin birkaç sınırlaması göz önünde bulundurulmalıdır. Anesteziklerin nöroproteksyon ve inme sonucu üzerindeki etkisi zaten iyi bilindiğinden, anesteziklerin hayvana uzun süre maruz kalması dikkate alınması gereken kritik bir faktör olabilir28. Bu cerrahi işlemin süresi yaklaşık 30 dakika sürse de, lazer aydınlatmanın 20 dakikası boyunca hayvanın minimum manipülasyonu nedeniyle hayvan düşük anestezi konsantrasyonları altında olabilir. Bu model orta derecede beyin yaralanmalarına neden olduğundan, sadece küçük davranışsal eksiklikler tespit edilebilir. Bu nedenle, daha yüksek hassasiyete ve nitel test parametrelerine sahip daha gelişmiş test sistemleri, yetenekli ulaşan test29 ve Neuroscore17, burada açıklandığı gibi, belki de bu modelde uzun vadeli fonksiyonel sonuçları tespit etmek için daha uygundur. Son olarak, trombositlerin aydınlatılmış kan damarlarına kalıcı olarak toplanması nedeniyle, spontan pıhtı lizisi veya tedavisi nedeniyle inme hastalarının önemli bir yüzdesinde gözlenen bir özellik olan reperfüzyon elde edilemez30.
Benzer bir fototrombotik inme modeli 2013 yılında Labat-gest ve Tomasi tarafından yayınlandı ve 561 nm yeşil lazer8yerine soğuk ışık lambası kullanan bir PT protokolünü tanımladı. Hem lazer hem de soğuk ışık kaynakları Rose Bengal'i heyecanlandırmak için kullanılabilir. Lazer tabanlı ışık kaynaklarının soğuk ışık lambalarına göre bir avantajı, lazerlerin in vivo damara özgü pıhtılaşma için bireysel yüzey arteriyoüllerini hedeflemek için kullanılabilmesidir31. Belirli arteriyolları hedeflemememize rağmen, 562 nm'deki Rose Bengal emilim zirvesi nedeniyle beyin aydınlatması ve fototrombosis indüksiyonu için 561 nm yeşil lazer kullandık. Aydınlatma sırasında uygun bir lazer yoğunluğu sağlamak için, lazeri kalibre etmek için Cobolt Monitör Yazılımı-6.1.0.0 kullanıldı. Ayrıca, mevcut çalışmada fototrombozu teşvik etmek için 10 μL / g (100 μg / g) bir Rose Bengal dozu yeterliyken, önceki protokol daha yüksek bir doz (150 μg / g)8bildirdi. Ek olarak, protokol, lazerin kendisinin herhangi bir doku hasarı üretmediğini kanıtlamak için inme sonucunu (Neuroscore) ve ek bir sham-kontrol grubunu (lazer aydınlatma) analiz etmek için bir davranışsal yöntem sağlar, bu nedenle sadece Rose Bengal + lazer aydınlatma kombinasyonu bir beyin lezyonunu indükler.
Genel olarak, bu non-invaziv basit cerrahi prosedür, inme lezyonunun beyne yüksek tekrarlanabilirliğini ve yönlülüğünü ve minimum mortalite nedeniyle uzun süreli gözlem olasılığını sağlar. Bu fototropombotik inme modeli, temel ve çevirisel inme araştırmaları için değerli bir deneysel paradigma olarak ayırt edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak rakip çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Immunostroke Konsorsiyumu'nun (FOR 2879, For immune cells to stroke recovery) tüm işbirliği ortaklarımıza öneriler ve tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Münih Sistem Nörolojisi Kümesi (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) çerçevesinde ve LI-2534/6-1 hibeleri kapsamında Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi kapsamında finanse edildi. LI-2534/7-1 ve LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
- Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
- Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).
