Summary
Beskrevet her er den fotothrombotiske slagtilfælde model, hvor et slagtilfælde er produceret gennem intakt kraniet ved at fremkalde permanent mikrovaskulær okklusion ved hjælp af laser belysning efter administration af en lysfølsom farvestof.
Abstract
Slagtilfælde er en førende dødsårsag og erhvervet voksne handicap i de udviklede lande. På trods af omfattende undersøgelse for nye terapeutiske strategier, der fortsat begrænsede terapeutiske muligheder for slagtilfælde patienter. Derfor er der behov for mere forskning for patofysiologiske veje såsom betændelse efter slagtilfælde, angiogenese, neuronal plasticitet og regenerering. I betragtning af in vitro-modellernes manglende evne til at reproducere hjernens kompleksitet er eksperimentelle slagtilfældemodeller afgørende for analysen og den efterfølgende evaluering af nye lægemiddelmål for disse mekanismer. Desuden er der et presserende behov for detaljerede standardiserede modeller for alle procedurer for at overvinde den såkaldte replikationskrise. Som en indsats inden for ImmunoStroke forskningskonsortium beskrives en standardiseret fotothrombotisk musemodel ved hjælp af en intraperitoneal injektion af Rose Bengal og belysningen af det intakte kranium med en 561 nm laser. Denne model tillader udførelsen af slagtilfælde hos mus med tildeling til enhver kortikal region i hjernen uden invasiv kirurgi; således gør det muligt at studere slagtilfælde i forskellige områder af hjernen. I denne video demonstreres de kirurgiske metoder til slagtilfældeinduktion i den fotothrombotiske model sammen med histologiske analyser.
Introduction
Iskæmisk slagtilfælde er fortsat en hovedårsag til død og erhvervet voksen handicap i de udviklede lande i det 21. århundrede tegner sig for ca. 2,7 millioner dødsfald i 2017 på verdensplan1. Selv med den enorme indsats fra det videnskabelige samfund er der kun få behandlinger tilgængelige. Med så høje udelukkelseskriterier er disse allerede begrænsede muligheder desuden ikke tilgængelige for mange patienter, hvilket resulterer i et presserende behov for nye behandlinger for at forbedre funktionel genopretning efter slagtilfælde.
I betragtning af in vitro-modellernes manglende evne til at kopiere hjernens komplekse interaktioner er dyremodeller afgørende for præklinisk slagtilfældeforskning. Mus er den hyppigst anvendte dyremodel inden for slagtilfældeforskning. De fleste af disse musemodeller har til formål at fremkalde infarkt ved at blokere blodgennemstrømningen i den midterste cerebral arterie (MCA), da størstedelen af humane slagtilfældelæsioner er placeret i MCA-territoriet2. Selv om disse modeller bedre opsummere menneskelige slagtilfælde læsioner, de involverer kramper operationer med høj infarkt volumen variation.
Siden Rosenblum og El-Sabban's forslag om den fotothrombotiske model i 19773, og senere anvendelsen af denne model på rotter Watson et al.4, er det blevet meget udbredt i iskæmisk slagtilfælde forskning5,6. Den fotothrombotiske slagtilfælde model fremkalder en lokal og defineret kortikale infarkt som følge af fotoaktivering af en lysfølsom farvestof tidligere injiceres i blodgennemstrømningen. Dette forårsager lokal trombose af fartøjerne i de områder, der udsættes for lys. Kort, ved udsættelse for lys fra det injicerede lysfølsomme farvestof, fremkaldes lokaliseret oxidativ skade af endotelcellemembranen, hvilket fører til blodpladesammenlægning og trombrandannelse efterfulgt af lokal forstyrrelse af cerebral blodgennemstrømning7.
Den største fordel ved denne teknik ligger i dens enkelhed i udførelsen og muligheden for at lede læsionen til den ønskede region. I modsætning til andre eksperimentelle slagtilfælde modeller, mindre kirurgisk ekspertise er nødvendig for at udføre den fotothrombotic slagtilfælde model som læsionen er induceret gennem belysning af intakt kraniet. Desuden kan de velafgrænsede grænser ( figur 2A og figur 5B) og fleksibiliteten til at fremkalde læsionen til en bestemt hjerneregion lette undersøgelsen af cellulære reaktioner inden for det iskæmiske eller intakte kortikale område8. Af disse grunde er denne tilgang egnet til undersøgelse af cellulære og molekylære mekanismer af kortikal plasticitet.
I løbet af de sidste par årtier er den voksende bekymring over den manglende reproducerbarhed mellem forskergrupper blevet opfundet den såkaldte replikationskrise9. Efter koordineringen af den første prækliniske randomiserede kontrollerede multicenterforsøgsundersøgelse i 201510, et foreslået værktøj til forbedring af præklinisk forskning11,12,13, blev det bekræftet , at en årsag til manglende reproducerbarhed mellem prækliniske undersøgelser fra uafhængige laboratorier var manglen på tilstrækkelig standardisering af eksperimentelle slagtilfældemodeller og resultatparametre14. Derfor, da ImmunoStroke-konsortiet blev etableret (https://immunostroke.de/), var et samarbejde, der har til formål at forstå hjerneimmune interaktioner, der ligger til grund for de mekanistiske principper for slagtilfældegendannelse, standardisering af alle de eksperimentelle slagtilfældemodeller blandt hver forskningsgruppe afgørende.
Beskrevet her er den standardiserede procedure for induktion af den fotothrombotiske model, som anvendes i ovennævnte forskningskonsortium. Kort sagt gennemgik et dyr bedøvelsesmidler, fik en Rose Bengal-injektion (10 μL/g) intraperitonally, og det intakte kranium, 3 mm tilbage fra bregma, blev straks oplyst af en 561 nm laser i 20 min (Figur 1). Derudover rapporteres en relateret histologisk og adfærdsmæssig metode til at analysere slagtilfælderesultatet i denne model. Alle metoder er baseret på standard driftsprocedurer udviklet og anvendt i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De forsøg, der blev rapporteret i denne video, blev udført i overensstemmelse med de nationale retningslinjer for brug af forsøgsdyr, og protokollerne blev godkendt af de tyske regeringsudvalg (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). De mus, der blev anvendt i denne undersøgelse, var hanmus fra C57Bl/6J, 10-12 uger gamle, og afsendt af Charles River Germany. Dyrene blev anbragt under kontrollerede temperaturer (22 °C ± 2 °C) med en 12 timers lysmør cyklusperiode og adgang til pelleteret mad og vand ad libitum.
1. Udarbejdelse af materialer og instrumenter
- Rose Bengal opløses i 0,9% saltvandsopløsning for at opnå en endelig koncentration på 10 mg/mL. Tilslut varmetæppet for at holde operationsområdet varmt og holde musens kropstemperatur under anæstesi ved 37 °C.
- Forbered saks, pincet, stykker bomuld, dexpanthenol øjensæbne og suturmateriale. Forbered en sprøjte med saltvandsopløsning (uden nål) for at opretholde det indhydrerede operationsområde. Forbered anæstesi gas (100% O2 + isoflurane).
2. Tilberedning af dyret
- Analgesi injiceres 30 min før operationen (4 mg/kg Carprofen og 0,1 mg/kg Buprenorphin).
- Musens kropsvægt registreres for at justere den dosis Rose Bengal, der skal injiceres (10 μL/g, dvs. 100 μg/g).
- Placer musen i induktionskammeret med en isofluran strømningshastighed på 4% for at bedøve den, indtil kroppens spontane bevægelse og vibrissae stopper.
- Overfør musen til den stereotaktiske ramme og læg den i en udsat position med næsen ind i anæstesimasken. Fastgør dyret og hold isoflurankoncentrationen på 4% i 1 min. Derefter reduceres og opretholdes isoflurankoncentrationen med 2%.
- Sæt forsigtigt rektalsonden ind for at overvåge temperaturen under hele de kirurgiske indgreb. Indstil den tilhørende feedbackstyrede varmepude for at holde musens kropstemperatur ved 37 °C.
- Påfør dexpanthenol øjensætning på begge øjne og rengør huden og den omgivende pels med et desinfektionsmiddel.
3. Fotothrombose model
- Lav et 2,0-2,5 cm langsgående snit og træk tilbage for at udsætte kraniet. Udfør kraniet eksponering med et enkelt snit for at undgå sår komplikationer.
- Fjern periosteum forsigtigt med bomuld og identificere koronar suturer.
- Sæt beskyttelsesbrillerne på, tænd for 561 nm laseren og marker bregma +3 mm tilbage.
- Sluk for laseren, fastgør et klistermærke med et hul med en diameter på 4 mm placeret ved de markerede koordinater, der er nævnt ovenfor.
- Musen indsprøjtes med Bengal Rose (10 μL/g), intraperitoneally. Placer laserstrålen på 4-5 cm fra kraniet, tænd for 561 nm laser og belys kraniet i 20 min.
- Påfør to dråber på 0,9% saltvand på kraniet for at rehydrere, sutur såret, og læg dyret i et genopretningskammer ved 37 °C for at komme sig efter anæstesi. Efter 1 time skal du returnere musene til deres bure i et temperaturstyret rum.
- Analgesi injiceres hver 12. time i 3 dage efter operationen (4 mg/kg Carprofen og 0,1 mg/kg Buprenorphin).
4. Sham operation
- Der gennemføres to forskellige procedurer for Sham-operationer som beskrevet i trin 4.1.1 og 4.1.2.
- Udfør alle de procedurer, der er identiske med den handling, der er beskrevet ovenfor. Injicere Rose Bengal uden at tænde for laseren. Efter 20 minutter under anæstesi, lad dyrene blive i genopretningskammeret i 1 time for at komme sig, før de returneres til deres bure.
- Udfør alle de procedurer, der er identiske med den operation, der er beskrevet ovenfor, og tænd for laseren. Tilfør ikke Rose Bengal. Efter 20 minutters laserbelysning skal dyrene blive i opvågningskammeret i 1 time for at komme sig efter anæstesi, før de returneres til deres bure.
5. Laser speckle
- Tilslut det opvarmede tæppe for at holde operationsområdet varmt og holde musens kropstemperatur under anæstesi ved 37 °C.
- Placer musen i induktionskammeret med en isofluran strømningshastighed på 4% for at bedøve den, indtil kroppens spontane bevægelse og vibrissae stopper og derefter overfører musen til den stereotaktiske ramme.
- Placer musen i en udsat position med næsen ind i anæstesimasken. Fix dyret og opretholde isoflurane koncentrationen på 4% i 1 min. T høne reducere og vedligeholde det på 2%.
- Sæt forsigtigt rektalsonden ind for at overvåge temperaturen under hele de kirurgiske indgreb. Indstil den tilhørende feedbackstyrede varmepude for at holde musens kropstemperatur ved 37 °C og anvende dexpanthenol øjensalven på begge øjne. Rengør huden og den omgivende pels med et desinfektionsmiddel.
- Lav et 2,0-2,5 cm langsgående snit og træk tilbage for at udsætte kraniet. Udfør kraniet eksponering med et enkelt snit for at undgå sår komplikationer.
- Placer den sterotaktiske ramme under laserspeglet, og juster højden for at få et skarpt billede. Fokuser kameraet til laserspekuleret perfusionsbilledbehandling (LSI) på kranievinduet. Konfigurer LSI-kamerasystemet (High Resolution Laser Speckle Imaging) som tidligere beskrevet15.
- Anskaf data fra et 1 cm x 1 cm synsfelt ved hjælp af en bølgelængde på 785 nm og 80 mW lasere med en billedhastighed på 21 billeder/s i en arbejdsafstand på 1 cm i 1 min.
- Efter billeddannelse påføres to dråber 0,9% saltvand på kraniet for at rehydrere, suturere såret og placere dyret i et genopretningskammer ved 37 °C for at komme sig efter anæstesi i 1 time. Efter 1 time skal du returnere musene til deres bure i et temperaturstyret rum.
6. Neuroscore
BEMÆRK: Til analyse af neurologisk underskud anvendes en modificeret neurologisk skala offentliggjort af Eckenstein et al. i 199715.
- Dyr, der er generelt(tabel 1),og fokale underskud(tabel 2)scorers . Denne sammensatte skala varierer fra 0 (ingen underskud) til 46 (alvorlige værdiforringelser).
- Udfør neuroscore på samme tidspunkt hver dag og bruge kirurgisk tøj til at holde en neutral lugt.
- Tilvænn musene i 30 minutter i rummet med et åbent bur før testen og lad dem observere hvert element i 30 s.
7. Perfusion
- Forbered en 20 mL sprøjte indeholdende PBS-heparin (2 U/mL), og placer den 1 m over bænken for at lette/sikre tyngdekraftsdrevet perfusion.
- Intraperitonealt injiceres 100 μL ketamin og xylazin (henholdsvis 120/16 mg/kg legemsvægt). Vent i 5 minutter og bekræfter ophør af spontan kropsbevægelse og vibrissae.
- Fastgør dyret i en liggende stilling og desinficer abdominal kropsoverfladen med 100% ethanol. Lav et 3 cm langt snit i maven; skær mellemgulvet og ribbenene for helt at visualisere hjertet.
- Lav et lille snit i højre atrium og indsæt perfusionskantylen i venstre ventrikel og perfuse med 20 mL PBS-heparin.
- Efter perfusion halshugges dyret og fjernes hjernen, fryses det ved hjælp af tøris og opbevares ved -80 °C, indtil de anvendes yderligere.
8. Infarkt volumen
- Cryosectioning: Skær hjernen serielt på en kryostat til 20 μm tykke sektioner hver 120 μm og montere på dias. Diasene opbevares ved -80 °C indtil videreforarbejdning.
- Cresyl violet (CV) farvning
- For at forberede farvningsopløsningen blandes 0,5 g CV-acetat i 500 ml H2O. Rør og opvarm (60 °C), indtil krystallerne er opløst. Lad opløsningen køle af og opbevar den i en mørk flaske. Genopvarm til 60 °C og filtrer (papirfilter) før hver brug.
- Tør rutsjebanerne ved stuetemperatur i 30 minutter. Placer dem i 95% ethanol i 15 min, efterfulgt af 70% ethanol i 1 min, og bagefter i 50% ethanol i 1 min.
- Placer rutsjebanerne i destilleret vand i 2 minutter, opdater det destillerede vand, og læg rutsjebanerne i vand igen i 1 minut. Placer derefter rutsjebanerne i den forvarmede farvningsopløsning i 10 minutter ved 60 °C. Vask rutsjebanerne to gange i destilleret vand i 1 min.
- Placer dias i 95% ethanol i 2 min. Placer dem derefter i 100% ethanol i 5 minutter, opdater 100% ethanol og læg diasene i 100% ethanol igen i 2 minutter. Bagefter dække dias med en montering medium.
- Analyse: Scan dias og analysere den indirekte infarkt volumen ved Swanson metode16 til at korrigere for ødem: Iskæmisk område = (iskæmisk region)-((ipsilateral halvkugle) - (kontralateral halvkugle)).
9. Tunel farvning(in situ apoptose detektion kit)
- Lysbillederne tørres, efter hæs i 4% paraformaldehyd i PBS (ph. 7.4) i 10-20 min ved RT. Vask i PBS, efter rettelse i forkølet ethanol: eddikesyre 2:1 i 5 min ved -20 °C.
- Vask i PBS og påfør ækvilibreringsbuffer (10 s til maksimalt 60 min ved RT) og påfør arbejdsstyrke TdT-enzym (1 time ved 37 °C i befugtet kammer)
- Påfør arbejdsstyrke stop/vask enzym (10 min ved RT), vask i PBS og påfør opvarmet (RT) arbejdsstyrke anti-digoxigenin konjugat (30 min ved RT i mørke)
- Vask i PBS, inkuber med DAPI i 5 min på RT og montere dias med fluoromount medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modellen beskrevet her er en fotothrombotic slagtilfælde model af Rose Bengal injektion og intakt kraniet belysning i 20 min, på en konstant 561 nm bølgelængde og 25 mW udgangseffekt på fiberen. Selvom den komplette fotothrombotiske operation varer 30 minutter, holdes dyret under lav anæstesi, og hjerneskaden er moderat. Ca. 10 minutter efter overførsel til deres bure var alle dyrene vågne, frit bevægede sig i buret og interagerede med littermates.
Infarkt volumetry blev udført ved hjælp af cresyl violet farvede seriel koronar hjerne sektioner 24 timer efter slagtilfælde induktion (Figur 2A). Den gennemsnitlige infarkt volumen var 29,3 mm3, der repræsenterer 23% af en hjernehalvdel. Desuden er variationen af denne slagtilfælde model usædvanlig lav med en standardafvigelse på ca 3,5% (Figur 2B). Læsionsområdet omfatter den motoriske cortex uden kærlighed fra subkortikale strukturer.
Fotothrombosis forårsagede en moderat, langsigtet sensorimotorisk svækkelse, angivet ved den sammensatte Neuroscore17 (Figur 3); generelle og fokale underskud blev målt 24 timer, 3 dage og 7 dage efter operationen. Den generelle Neuroscore har fem punkter, herunder evaluering af pels, ører, øjne, kropsholdning og spontan aktivitet, med en maksimal score på 18(Tabel 1). Den centrale Neuroscore består af syv punkter, herunder evaluering af kroppens symmetri, gangart, klatring, kredser adfærd, forben symmetri, obligatorisk cykling, og whiskers respons, med en maksimal score på 28 (Tabel 2). Slagtilfælde dyr havde en betydelig ændring i den sammensatte neuroscore 24 timer efter operationen i forhold til Sham-opererede dyr. Disse forskelle fortsatte, selv om slagtilfældemus forbedredes med tiden (figur 3).
Dødelighed i observationstiden forekommer sjældent hos 1-2% af dyrene. I denne rapport måtte ingen af de 10 undersøgte dyr udelukkes, og de overlevede alle 7-dages observationsperioden. Kropsvægten og temperaturændringerne i musene blev overvåget ved 24 timer, 3 dage og 7 dage efter operationen(Figur 4A,B). Data viste, at kropsvægt og temperatur blev reduceret 24 timer efter operationen kun i Rose Bengal + belysning gruppe, men inddrives til niveauet for Sham-opererede dyr i 3 dage efter operationen.
For at bekræfte en induktion af iskæmiske ændringer, 24 timer efter operationen, gennemgik dyrene en laserbilledtest. En laser speckle kontrast imaging målt blodperfusion af cortex for en varighed på 1 min og en gennemsnitlig farvekodet billede blev opnået for hvert dyr. Dette viser, at Rose Bengal eller laserbelysning alene ikke giver en læsion, mens samtidig anvendelse af Rose Bengal og laserbelysning genererer et rundt hypoperfunderet område med en diameter på 4 mm omgivet af en smal oligemisk zone (Figur 5A). Hertil kommer, en cresyl violet og Tunel farvning til vurdering af den infarkt volumen 24 timer efter operationen afslørede ingen vævsskader enten i Rose Bengal eller laser belysning operationer. På den anden side genererede Rose Bengal + laserbelysning en velafgrænset læsion (Figur 5B).
Tabel 1: Generel neuroscore. For hvert af de fem målte generelle underskud kan dyrene modtage mellem 0 og 4 point afhængigt af sværhedsgraden. Scorerne på de fem områder lægges derefter sammen for at give en samlet generel score fra 0-18. Klik her for at hente denne tabel.
Tabel 2: Fokal neuroscore. For hvert af de syv målte generelle underskud kan dyrene modtage mellem 0 og 4 point afhængigt af sværhedsgraden. Scorerne på de fem områder lægges derefter sammen for at give en samlet generel score fra 0-28. Klik her for at hente denne tabel.
Figur 1: Fotothrombose (PT). Diagram, der viser det fotothrombotiske område, 3 mm fra Bregma. Den grønne prik angiver laserens position. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Volumetrisk infarktanalyse og infarkt resultat 24 timer efter PT. (A) Repræsentativ cresylviolet farvet koronahjerne, sektioner hver 120 μm ved 24 timer efter PT. Stiplede linjer afgrænser læsionsområdet. (B) Infarkt volumen analyse af 10 hjerner (hver prik, der repræsenterer en individuel hjerne) 24 timer efter PT. Den vandrette røde linje repræsenterer middelværdien (29,32 mm3), fejllinjer angiver standardafvigelsen (3,45 mm3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Neuroscore for funktionelle underskud efter PT. Sammensat Neuroscore før, 24 timer, 3 dage og 7 dage efter PT. BL = før PT, RB = Rose Bengal. n = 5 pr. gruppe. *p < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kropsvægt og temperaturanalyse efter PT. (A) Kropsvægt og (B) temperatur blev reduceret en smule hos PT-dyr sammenlignet med Sham-opererede grupper ved 24 timer og genvundet 3 dage efter PT. BL = før PT, RB = Rose Bengal. n = 5 pr. gruppe.*p < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Bekræftelse af læsion efter PT. (A) Laser Speckle imaging (B) Cresyl violet (øvre paneler) og Tunel farvning (lavere paneler) bekræftede læsionen først efter administration af Rose Bengal og efterfølgende laser belysning. RB = Rose Bengal. Skalalinje = 1.000 μm i øverste panel B, skalalinje = 20 μm i nederste panel B. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver den eksperimentelle slagtilfælde model af fotothrombose ved at belyse den intakte kraniet med en 561 nm laser, med en tidligere intraperitoneal injektion af Rose Bengal. Indtil for nylig har brugen af denne model været lav, men er støt stigende.
Dødelighed under slagtilfælde induktion i denne model er fraværende. Den samlede dødelighed på under 5% opstår under drift på grund af anæstesiologiske komplikationer eller ofre efter at have opfyldt udelukkelseskriterierne. For at garantere denne models lave variabilitet og reproducerbarhed foreslås følgende udelukkelseskriterier: 1) driftstid, der er længere end 30 min. 2) infektion i suturen; 3) bid sår; og 4) ingen infarkt eller ingen forgrunden asymmetri på 24 timer efter PT.
En meget anvendt eksperimentel slagtilfælde modeller er forbigående okklusion af MCA, ved hjælp af en sutur filament, som er indført i den interne halspulsåren, indtil silicium-belagt spids okkluder oprindelsen af MCA. Denne model tillader reperfusion ved at fjerne glødetråden og efterligner det menneskelige kliniske scenario, hvor der er en restaurering af hjerneblodgennemstrømningen efter spontan eller terapeutisk (rtPA) lysis af en embolic clot18,19. Det indebærer dog en kompleks operation med høj variation af den endelige infarkt og højdødelighed 10. I modsætning hertil kan den permanente okklusion af MCA distal af lenticulostriatal arterierne opnås ved koagulering af arterie20,21, som fremkalder lokalt definerede læsioner i neocortex22. Selvom denne model har en lavere dødelighed, kræver det invasiv kirurgi til dyret ved trepanation af kraniet over MCA for senere at koagulere det23. Derfor er høje kirurgiske færdigheder er nødvendige for en vellykket og upartisk in vivo slagtilfælde undersøgelse.
Sammenlignet med andre hjerneiskæmimodeller har den fotothrombotiske model, der udføres i denne video, fordelen ved ingen kraniotomi eller større operation på dyret, i modsætning til andre modeller, der involverer komplekse operationer eller hjernetestenomi. Desuden gør den enkle udførelse af modellen operationen tilgængelig for mange med lav tidskrævende træning. Lav dødelighed, moderat infarkt volumen og fleksibilitet til at fremkalde læsionen til en bestemt hjerneregion, understreger fordelen ved dette eksperimentelle paradigme for hjerneregenerering og slagtilfældestudier24,25,26,27.
På trods af de åbenlyse fordele bør der tages hensyn til nogle få begrænsninger i denne slagmodel. Den lange eksponering af bedøvelsesmidler til dyret kan være en kritisk faktor at tage højde for, da virkningen af bedøvelsesmidler på neurobeskyttelse og slagtilfælderesultat allerede er velkendt28. Selvom varigheden af denne kirurgiske procedure tager ca. 30 minutter, kan dyret være under lave bedøvelseskoncentrationer på grund af den minimale manipulation af dyret i løbet af 20 minutters laserbelysning. Fordi denne model fremkalder moderate hjerneskader, er det kun mindre adfærdsmæssige underskud, der kan påvises. Således mere avancerede testsystemer med højere følsomhed og kvalitative testparametre, såsom den dygtige nå test29 og Neuroscore17, som beskrevet her, måske mere egnet til at opdage langsigtede funktionelle resultater i denne model. Endelig kan der på grund af den permanente sammenlægning af blodpladerne i de belyste blodkar ikke opnås reperfusion, hvilket er en funktion observeret i en betydelig procentdel af slagtilfældepatienter på grund af spontan blodprop lysis eller terapi30.
En lignende fototrombotisk slagtilfælde model blev offentliggjort i 2013 af Labat-gest og Tomasi, der beskriver en PT-protokol ved hjælp af en kold lyslampe i stedet for en 561 nm grøn laser8. Både laser og kolde lyskilder kan bruges til at fremkalde Rose Bengal excitation. En fordel ved laserbaserede lyskilder i forhold til koldtlyslamper er, at lasere kan bruges til at målrette individuelle overfladearterioler mod in vivo-fartøjsspecifikk koagulation31. Selv om vi ikke var rettet mod specifikke arterioler, vi brugte en 561 nm grøn laser til hjernen belysning og fototrombose induktion, på grund af Rose Bengal absortion peak på 562 nm. For at sikre en korrekt laserintensitet under belysningen blev Cobolt Monitor Software-6.1.0.0 brugt til at kalibrere laseren. Desuden var en Rose Bengal-dosis på 10 μL/g (100 μg/g) i denne undersøgelse tilstrækkelig til at fremkalde fototrombose, mens den tidligere protokol rapporterede en højere dosis (150 μg/g)8. Derudover giver protokollen en adfærdsmæssig metode til at analysere slagtilfælde resultatet (Neuroscore) og en ekstra fingeret-kontrol gruppe (laser belysning) for at bevise, at laseren selv ikke producerer nogen vævsskader, så kun kombinationen af Rose Bengal + laser belysning fremkalde en hjernelæsion.
Samlet set denne ikke-invasive ligetil kirurgisk procedure muliggør høj reproducerbarhed og retningsbestemthed af slagtilfælde læsion til hjernen sammen med muligheden for langsigtet observation på grund af minimal dødelighed. Denne fotothrombotiske slagtilfælde model er kendetegnet som et værdifuldt eksperimentelt paradigme for grundlæggende og translationel slagtilfælde forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle vores samarbejdspartnere i Immunostroke Consortia (FOR 2879, Fra immunceller til slagtilfælde opsving) for forslag og diskussioner. Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands excellencestrategi inden for rammerne af München-klyngen for system neurologi (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) og under tilskud LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 og LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
- Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
- Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).
