大鼠部分异位欣德利姆移植模型

Summary

本文介绍了大鼠部分异位骨质皮瓣移植方案及其中期随访的潜在结果。

Abstract

血管化复合异位移植 （VCA） 是患者在复杂组织缺陷后没有自体手术可能性的最高级重建选项。脸部和手部移植改变了毁容患者的生活，赋予他们新的审美和功能社会器官。尽管结果大有希望，但由于终生免疫抑制合并症和传染性并发症，VCA仍然表现不佳。大鼠是研究免疫途径和移植排斥机制 的活体 研究的理想动物模型。大鼠还广泛应用于新型复合组织移植保存技术，包括灌注和低温保存研究。大鼠VCA的模型必须可重复、可靠和高效，术后发病率和死亡率较低。异位肢体移植程序符合这些标准，比矫肢移植更容易执行。掌握啮齿动物显微外科模型需要在显微外科和动物护理方面有扎实的经验。据报道，这是大鼠部分异位骨皮瓣移植、术后结果和预防潜在并发症的方法的可靠和可重复的模型。

Introduction

在过去的二十年里， VCA 已经发展成为一种革命性的治疗患者谁遭受严重毁容，包括脸部^{1 ，}上肢截肢^{2 ，3 ，}和其他复杂的组织缺陷^{4 ， 5 。}然而，终生免疫抑制的后果仍然阻碍这些复杂的重建手术的广泛应用。基础研究对于改进反排斥策略至关重要。增加VCA保存时间对于改善移植物流和增加捐赠者库也至关重要（因为VCA捐赠者必须比实体器官捐献者满足更多的标准，包括肤色、解剖大小、性别）。在此背景下，大鼠肢体移植被广泛应用于^6、7、新耐受诱导方案^8、保存研究^9、10、11等免疫排斥的研究中。因此，这些 VCA 模型是 VCA 转化研究需要掌握的关键元素。

骨皮瓣在文献中被描述为研究^{8、12、13、14}大鼠VCA的可靠模型。虽然正位全肢移植允许长期评估移植功能，但它是一个耗时的程序，与更高的术后发病率和死亡率^14。相比之下，异位肢体移植模型是非功能性的，但能够对VCA进行可重复的研究。在开始大鼠VCA移植研究之前，可以可靠地预测术后的结果。本研究报告了大鼠的部分异位骨质皮瓣移植模型，其中包括在三周的随访期内可能出现的频繁可能的结果和术后并发症。

Protocol

所有动物都根据《国家卫生研究院护理和使用实验室动物指南》得到人道护理。机构动物护理和使用委员会（IACUC-协议2017N000184）和动物护理和使用审查办公室（ACURO）批准了所有动物协议。近亲繁殖的雄性刘易斯大鼠（250-400克）用于所有实验。

1. 手术

1. 使用异黄素吸入麻醉刘易斯大鼠。诱导感应室中5%异黄素的麻醉，通过呼吸锥体保持1.5-3%异黄酮吸入麻醉。
2. 手术前在存活程序中应用眼润滑剂。剃掉手术现场，用脱皮霜、磨砂和披肩用无菌窗帘治疗。
3. 切口前和手术过程中定期用脚趾捏测试确认完全麻醉。在整个过程中监测心脏和呼吸速率。对于所有手术，使用无菌仪器、用品、窗帘和手套保持无菌状态。有关程序使用的工具列表，请参阅 材料表 。

2. 捐赠人权利部分后肢采购

1. 在腿部的三分之一处对脚踝上方的皮肤进行环切切。
2. 使用双极钳将尖骨动脉和流行动脉的末梢部分骨架化和烧灼。烧灼和切断胃内皮，鞋底，头骨前，和二头肌股骨肌肉，直到头骨暴露。
3. 在右侧的内侧折痕处切口 2.5 厘米。解剖内在脂肪垫，并收回它令人惊异地暴露股骨血管。使用鱼钩减记器抓住静脉韧带和夹钳，以保持在静脉脂肪垫远程。
   注意： 内皮脂肪垫包含在部分肢体的收获中。
4. 解剖股骨血管，个性化墨菲分支（深肌肉辅助分支通常位于静脉韧带和外周支部之间的中间），并以8-0连接尼龙领带。
5. 用 100 个 IU / kg 肝素对供体大鼠进行肝素化，用 27 . 5G 针注射多静脉。
6. 完成臀部周围的皮肤切口。
7. 使用双极钳对二头肌和谷胱甘肽超纤维肌进行烧结。在股骨中长烧灼和切开坐骨神经。在后股骨峰的水平上近似地暴露股骨。
   注：添加剂和四头肌被排除在采购之外。指定的脚踏车被保存下来。
8. 利盖特股骨血管与8/0尼龙领带在静脉韧带的水平。在连体下方的股动脉上进行动脉切除术，并进行扩散，以便插入 24 G 血管导管。
9. 烧灼和切割脚踏下剩余的肌肉，露出股骨前侧。
10. 分别使用骨切割机尽可能接近和尽可能切开头骨和股骨（中长）。
11. 用2mL肝素盐水（100 IU/mL）冲洗部分后肢，以获得清晰的静脉外流。将冰放在无菌纱布中，直到微血管转移（图1）。
12. 当动物处于全身麻醉状态时，通过排泄来实施安乐死，直到动物没有生命迹象（没有呼吸运动，没有心跳）。

图1：鼠局部后肢收获。 24G血管卡插入股动脉，准备异位微血管转移。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 接受手术

1. 切口前，剃掉颈部后部，皮下施用丁丙诺啡0.01-0.05毫克/千克。将鼠放在加热垫上的上位。
2. 在右侧的内侧折痕处切口 2.5 厘米。解剖内在脂肪垫，并倾斜它断然暴露股骨血管。使用钩子缩回静脉韧带和夹钳，以保持在偏心脂肪垫远程。
3. 解剖股骨血管，个性化墨菲分支，用8/0尼龙领带唇部。
4. 使用 8/0 尼龙领带将两个容器放在表胃容器上方。将近似夹子放在近处，并压平容器末端：用肝素盐水冲洗。
5. 在臀部上方的左侧切口，并创建一个皮下口袋，用皮下隧道进入皮肤折痕。
   注：插入切口位于臀部运动范围之上，以确保动物保持正常的后肢运动。此外，在移植内嵌物和微血管转移位点之间保持一个皮质的桥梁，可以更好地固定移植物（图2）。
6. 将部分肢体的近部和阴性脂肪垫通过皮下隧道进行微血管转移。使用 10/0 尼龙缝合线执行静脉和动脉麻醉剂。取下两个近似夹，观察肢体的转速。对两艘船进行"挤奶测试"，以评估每个麻醉症的轻率。
   注：静脉麻醉通常需要8至9条缝合线，动脉麻醉通常需要6条缝合线。
7. 在移植肢体的内侧进行纵向皮肤切口，并插入移植物。去除移植物的多余的皮肤，用单独的缝合线和可吸收的4/0缝合线关闭伤口。
8. 用两种独立的可吸收缝合线将移植肢体的阴性脂肪垫与接受者缝合在一起，并在微血管麻醉剂最后一次检查后关闭阴性折痕。
   注：阴性脂肪垫被紧紧缝合，在麻醉剂上方添加一层保护性脂肪，并确保移植物及其足部的安全位置。一丝不苟的封闭对伤口愈合更好：它还可防止伤口残留出血，并降低自残风险。
9. 根据围手术出血量，用1-3mL的盐水皮下补偿液体损失。
10. 将伊丽莎白领子套在动物的脖子上，并在皮肤上涂上两条松动的缝合线，使其保持在正确的位置。
11. 停止异黄素吸入，并在加热垫上持续监测动物，直到完全清醒和流动。

图2：骨质疏松肢体开始前的围手术图像。 在皮肤折痕切口和臀部上方移植物的插入之间保留着一座约1厘米的皮质桥。移植物被放置在桥下，保持其稳定用于微血管转移。 请单击此处查看此图的较大版本。

4. 术后护理

1. 每天监测动物两次，持续72小时，然后每天监测一次，直到术后一天（POD）7，然后每周监测两次。
   注：监测必须根据动物和移植情况进行调整（苍白的眼睛可能需要补充液体，作为动物疼痛的指标，移植颜色/温度异常），并应与兽医讨论进一步护理。在整个研究期间，受体大鼠需要单一的住房，以避免对移植物造成任何损害。
2. 根据 IACUC 指南，用皮下注射丁丙诺啡和/或非类固醇抗炎药物进行镇痛。
3. 评估移植物，并每天使用同一设备使用图片进行身体检查。
   注：在移植物的皮肤上使用脱毛霜有助于更好地评估移植的肤色。

Representative Results

在这项单操作者研究中，进行了30例同步异位部分肢体移植。成功定义为术后第21天没有VCA失败或需要安乐死的并发症。移植物的正常演变表现在图3中。接受者部分肢体采购和移植插入的平均持续时间分别为35分钟和105分钟：平均缺血时间是105分钟。在随访过程中，发生两种类型的并发症（表1）早或晚。有的需要安乐死，有的需要抢救，都与兽医人员讨论过（表2）。本研究报告了作者对啮齿动物显微外科初学者的经验和建议（补充表1）。

图3：异位后肢模型的正常演化，直到研究结束。 在术后第一周观察头发再生;皮肤缩回出现后2周。缩写：POD = 术后日。 请单击此处查看此图的较大版本。

围手术并发症的管理
动脉或静脉血栓形成是最常见的围手术并发症。克服这一点并使手术成功最重要的秘诀是进行早期诊断，即在关闭麻醉剂手术部位之前，持续监测皮瓣颜色/出血和复发性瓣状测试是基本的。一旦切口，预防这种并发症应该在外科医生的脑海中。捐赠者应在移植动脉缺血前5分钟注射4针肝素100 IU/kg。一旦收获，移植物应用肝素盐水（100 IU/mL）冲洗，直到静脉流出清晰。在这项研究中，10%的病例发生腹膜动脉血栓。

出血是不太频繁的发生，很容易缓解与移植肌肉的谨慎烧灼和彻底解剖接受者部位。出血的主要原因是动脉的麻醉性泄漏。这应该在3分钟内自行解决，否则，需要重新夹紧和修正泄漏的麻醉。麻醉相关并发症，发生在6.7%的病例中，在未经训练的显微外科医生中更为常见。使用异黄素是麻醉大鼠的可靠方法，麻醉时间可以实时调整。外科医生必须接受正确使用机器的培训，遵循诱导和维护方案指南，并在整个手术过程中密切监测心脏和呼吸速率。根据动物的种类、年龄或重量，所需的异黄素量可能会有所不同。不可预知的动物损失是一个罕见的事件，通常不会由麻醉剂或手术错误来解释。

早期并发症（
由于微血管血栓（静脉血栓比动脉更频繁），在术后第一周可能发生VCA故障。腹股沟水平内嵌的围手术足疗是一个非常重要的步骤。移动大鼠的后肢以模仿运动对足部的影响至关重要：脚踏车不应该太松，也不应该太紧。强化监测是一项基本要求，因为一旦做出 VCA 故障诊断，就必须进行尸检。在尸检期间，对足部位置（扭结或张力）和血栓形成的腺瘤（后壁缝合、肠内皮瓣）的质量的分析提供了大量信息，说明在下一个手术过程中可以改进哪些方面，因此，应由手术外科医生进行。在20%的病例中，静脉血栓是导致早期安乐死的原因，所有这些病例都发生在POD5之前（图4）。

图4：术后静脉血栓形成。 皮肤看起来是蓝色的，每天都变黑。缩写：POD = 术后日。 请单击此处查看此图的较大版本。

自残（或自噬）是非敏感移植的严重问题;它经常发生在 POD2 和 POD7 之间。如果仅限于不到三分之一的移植表面，只涉及皮肤，手术脱脂和缝合使用不可吸收的缝合线可以与工作人员兽医讨论（图5A-C）。预防依赖于使用缝合在颈部的电子领子，直到POD7和清洁动物手术伤口上的任何血液或地壳。反复自噬或深度残害需要安乐死（图5D）。

图5：术后自残的非敏感移植。 （A-C）在（A） POD2 自动残害的有限表面。（B） 手术脱脂和重新缝合：（C） POD21 的方面。（D） 多层移植物的严重自噬导致动物安乐死。缩写：POD = 术后日。 请单击此处查看此图的较大版本。

晚期并发症（>POD7）
这些并发症的频率较低，杀伤力较小，需要兽医会诊以提供适当的治疗。首先，骨暴露可以观察到在这个模型中，通常是在手术后第三周初步愈合后。预防是基于仔细的骨切割（使用骨切割机创建光滑的边缘）：覆盖骨边缘与周围的肌肉，同时考虑后期肌肉萎缩是有帮助的。如果检测早期和动物状况良好，手术修订可以与兽医讨论。其次，皮肤囊肿可能发生在手术部位周围两周后（图6）。它们通常不会干扰大鼠或移植物的状况，但可以猛击皮肤并感染。清洗移植内嵌的手术部位，以避免伤口中任何残留的头发，防止囊肿的产生。手术排水的指示可以与兽医评估。

图6： 皮肤囊肿。 皮肤囊肿出现（A） 后 POD14，（B） 有时与皮质坏死中心之前的膀胱。缩写：POD = 术后日。 请单击此处查看此图的较大版本。

	并发症	溶液	预防
周边操作	微血管血栓	冲洗后，以肝素盐水结束并证明良好的流动，快速重新做腺肿。	使捐赠者肝素化，冲洗皮瓣，掌握骨质疏松技术，并使用足够的仪器和缝合。
	出血	如果从肌肉中取出，如果从麻醉中取出，并且不会在3分钟内自发停止。	嫁接收获期间彻底烧灼
	麻醉相关死亡	与兽医人员讨论遇到的问题。	麻醉机和围手术鼠监测使用培训
早期 （	微血管血栓	早期安乐死和尸检揭示血栓形成的原因	取决于原因
	自动残害	讨论手术修复与兽医，如果第一次事件和表面损害的移植物。	从 POD-2 到 POD7 的电子领
迟到（>POD7）	骨骼暴露	与兽医讨论手术修订。	用骨切割机切骨，确保边缘光滑，恢复与周围的肌肉，占后期肌肉萎缩（切短）。
	皮肤囊肿	与兽医讨论外科排水和抗生素治疗	用水清洗嵌入位点;避免在手术现场留下任何头发。

表1：潜在结果。 预防和解决方案。

学习结束
本模型的研究结束设置为 POD21：动物被安乐死使用_CO2 窒息或灭绝。作为一种非功能性移植物，肌肉萎缩和脂肪退化被观察为缺乏再造的后果。皮肤和肌肉的活检保存为病理分析。如果在研究结束前实施安乐死，则阴性折痕将重新打开，用于评估血管足部（放置、足部）。

咨询兽医的五个理由

1） 在研究开始前，通知她/他您的研究性质、计划中的镇痛、后续策略和预期结果

2） 特殊饮食或补充营养物质，可以帮助改善动物状况在研究期间

3） 意外麻醉相关死亡

4） 动物状况不明原因恶化

5） 手术并发症评估安乐死的抢救可能性或适应症

表2：何时给兽医打电话。 与工作人员的沟通对于进行 体内 研究至关重要。

补充表1："做和不要。 为年轻的显微外科学员提供建议。 请点击这里下载此表。