Summary
Dit artikel presenteert een partieel heterotopisch osteomyocutaan flaptransplantatieprotocol bij ratten en de mogelijke uitkomsten ervan in de follow-up op middellange termijn.
Abstract
Gevasculariseerde composiet allotransplantaties (VCA) vormen de meest geavanceerde reconstructieoptie voor patiënten zonder autologe chirurgische mogelijkheden na een complex weefseldefect. Gezichts- en handtransplantaties hebben het leven van misvormde patiënten veranderd, waardoor ze een nieuw esthetisch en functioneel sociaal orgaan hebben. Ondanks veelbelovende resultaten presteert VCA nog steeds ondermaats als gevolg van levenslange immunosuppressiecomorbiditeiten en infectieuze complicaties. De rat is een ideaal diermodel voor in vivo studies naar immunologische routes en afstotingsmechanismen van transplantaten. Ratten worden ook veel gebruikt in nieuwe conserveringstechnieken voor samengesteld weefseltransplantaten, waaronder perfusie- en cryopreservatiestudies. Modellen die worden gebruikt voor VCA bij ratten moeten reproduceerbaar, betrouwbaar en efficiënt zijn met een lage postoperatieve morbiditeit en mortaliteit. Heterotope ledemaattransplantatieprocedures voldoen aan deze criteria en zijn gemakkelijker uit te voeren dan orthotopische ledemaattransplantaties. Het beheersen van microchirurgische modellen van knaagdieren vereist solide ervaring in microchirurgie en dierverzorging. Hierin wordt een betrouwbaar en reproduceerbaar model van partiële heterotope osteomyocutane flaptransplantatie bij ratten, de postoperatieve uitkomsten en de middelen om mogelijke complicaties te voorkomen gerapporteerd.
Introduction
In de afgelopen twee decennia is VCA geëvolueerd als een revolutionaire behandeling voor patiënten die lijden aan ernstige misvorming, waaronder gezicht1,amputaties van de bovenste ledematen2,penis3en andere complexe weefseldefecten4,5. De gevolgen van levenslange immunosuppressie belemmeren echter nog steeds een bredere toepassing van deze complexe reconstructieve operaties. Fundamenteel onderzoek is cruciaal om anti-afwijzingsstrategieën te verbeteren. Het verhogen van de VCA-conserveringstijd is ook essentieel om de transplantatielogistiek te verbeteren en de donorpool te vergroten (omdat VCA-donoren aan meer criteria moeten voldoen dan solide orgaandonoren, waaronder huidskleur, anatomische grootte, geslacht). In deze context worden transplantaties van ledematen van ratten veel gebruikt in studies naar de immuunafstoting van allografts6,7,nieuwe tolerantie-inductieprotocollen8en conserveringsstudies9,10,11. Daarom zijn deze VCA-modellen een belangrijk element om te beheersen voor VCA translationeel onderzoek.
Osteomyocutane flappen zijn in de literatuur beschreven als betrouwbare modellen om VCA te bestuderen bij ratten8,12,13,14. Hoewel orthotopische transplantaties van alle ledematen langdurige evaluatie van de transplantaatfunctie mogelijk maken, is het een tijdrovende procedure die gepaard gaat met hogere postoperatieve morbiditeit en mortaliteitscijfers14. Heterotope ledemaattransplantatiemodellen zijn daarentegen niet-functioneel, maar maken reproduceerbare studies op VCA mogelijk. Postoperatieve uitkomsten kunnen betrouwbaar worden verwacht vóór de start van een VCA-transplantatiestudie bij ratten. Deze studie rapporteert een partieel heterotopisch osteomyocutaan flaptransplantatiemodel bij de rat met frequente mogelijke uitkomsten en complicaties die intraoperatief en postoperatief kunnen optreden tijdens een follow-upperiode van drie weken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-protocol 2017N000184) en Animal Care and Use Review Office (ACURO) hebben alle dierprotocollen goedgekeurd. Inteelt mannelijke Lewisratten (250-400 g) werden gebruikt voor alle experimenten.
1. Chirurgie
- Verdoof de Lewis-ratten met behulp van isofluraaninhalatie. Induceer anesthesie met 5% isofluraan in de inductiekamer en handhaaf anesthesie met 1,5-3% isofluraaninhalatie via een ademhalingskegel.
- Breng oogsmeermiddel aan vóór de operatie bij overlevingsprocedures. Scheer de operatieplaats, behandel met ontharingscrème, scrub en drapeer met steriele gordijnen.
- Bevestig de totale anesthesie met een teenknijptest vóór de incisie en regelmatig tijdens de procedure. Controleer de hart- en ademhalingsfrequenties gedurende de hele procedure. Voor alle operaties, onderhoud steriele omstandigheden door steriele instrumenten, benodigdheden, gordijnen en handschoenen te gebruiken. Zie de tabel met materialen voor de lijst van instrumenten die voor de procedures worden gebruikt.
2. Donorrecht gedeeltelijke achterverkwerving
- Maak een omtrekkende incisie van de huid boven de enkel bij het distale derde deel van het been.
- Skeletoniseer en cauteriseer de sapheneuze slagader en de terminale tak van de popliteale slagader met behulp van een bipolaire tang. Cauteriseer en snijd de gastrocnemius, soleus, tibialis anterior en biceps femoris spieren af totdat het tibiale bot is blootgesteld.
- Maak een incisie van 2,5 cm in de rechter liesplooi. Ontleed het inguinale vetkussen en trek het distaal in om de femorale vaten bloot te leggen. Gebruik een fishhook retractor om het liesband vast te pakken en de tang vast te klemmen om het inguinale vetkussen distisch vast te houden.
OPMERKING: Het inguinale vetkussen is opgenomen in de oogst van de gedeeltelijke ledemaat. - Ontleed de femorale vaten, individualiseer Murphy-takken (diepe gespierde collaterale takken bevinden zich meestal halverwege tussen het inguinale ligament en de epigastrische tak) en ligaat met 8-0 nylon banden.
- Hepariniseer de donorrat met 100 IE/kg heparine, geïnjecteerd in de dorsale ader van de penis met behulp van een naald van 27,5 G.
- Voltooi de huidincisie rond de heup.
- Cauterize de biceps femoris en gluteus superficialis spieren met behulp van bipolaire tang. Cauteriseer en snijd de heupzenuw op de middelste dijbeenlengte. Stel het dijbeen proximaal bloot ter hoogte van de achterste femurkam.
OPMERKING: Adductor- en quadricepsspieren worden buiten de verkrijging gelaten. De innominate pedikel is bewaard gebleven. - Ligaat femorale vaten met 8/0 nylon banden ter hoogte van het inguinale ligament. Voer een arteriotomie uit op de dijbeenslagader net onder de ligatuur en verwijd om het inbrengen van een 24 G angiokatheter mogelijk te maken.
- Cauteriseer en snijd de resterende spier onder de pedikel, waardoor de voorste kant van het dijbeen wordt blootgelegd.
- Snijd het scheenbeen en het dijbeen met behulp van een botsnijder zo proximaal en distisch mogelijk ( halverwege de lengte).
- Spoel de gedeeltelijke achterpoot met 2 ml heparine zoutoplossing (100 IE/ml) om een duidelijke veneuze uitstroom te verkrijgen. Bewaren op ijs in een steriel gaas tot microvasculaire overdracht(figuur 1).
- Terwijl het dier onder algemene anesthesie is, voert u euthanasie uit door exsanguinatie totdat het dier geen teken van leven vertoont (geen ademhalingsbeweging en geen hartslag).
Figuur 1: Rat gedeeltelijk achterpoot geoogst. Een 24 G angiocath wordt ingebracht in de femorale slagader, klaar voor heterotope microvasculaire overdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Recipiente operatie
- Scheer vóór de incisie de achterkant van de nek en dien buprenorfine 0,01-0,05 mg/kg subcutaan toe. Plaats de rat in rugligging op een verwarmingskussen.
- Maak een incisie van 2,5 cm in de rechter liesplooi. Ontleed het inguinale vetkussen en leun het distaal om de femorale vaten bloot te leggen. Gebruik een haak om het liesband in te trekken en klemtang om het inguinale vetkussen distisch vast te houden.
- Ontleed de femorale vaten, individualiseer de Murphy-takken en ligaat met 8/0 nylon banden.
- Ligate beide vaten boven de epigastrische vaten met behulp van 8/0 nylon banden. Plaats approximatorklemmen proximaal en verwijd de uiteinden van het vat; spoelen met heparine zoutoplossing.
- Maak een incisie op de linkerflank boven de heup en maak een onderhuidse pocket met een onderhuidse tunnel naar de liesplooi.
OPMERKING: De inzetincisie wordt gemaakt boven het bewegingsbereik van de heup om ervoor te zorgen dat het dier een normale achterbeweging behoudt. Bovendien zorgt het houden van een huidbrug tussen de transplantaatinzet en de microvasculaire transferplaats voor een betere fixatie van het transplantaat(figuur 2). - Plaats het proximale deel van de gedeeltelijke ledemaat en het inguinale vetkussen door de onderhuidse tunnel voor microvasculaire overdracht. Voer veneuze en arteriële anastomosen uit met behulp van 10/0 nylon hechtingen. Verwijder beide approximatorklemmen en observeer revascularisatie van de ledemaat. Voer een "melktest" uit op beide vaten om de doorgankelijkheid van elke anastomose te beoordelen.
OPMERKING: Acht tot negen hechtingen zijn meestal nodig voor veneuze anastomose, gemiddeld 6 hechtingen voor arteriële anastomose. - Maak een longitudinale huidincisie aan de mediale kant van de getransplanteerde ledemaat en breng het transplantaat in. Verwijder overtollige huid van het transplantaat en sluit de wond met afzonderlijke hechtingen en een lopende hechting met absorbeerbare 4/0 hechtingen.
- Hecht de inguinale vetkussens van de getransplanteerde ledemaat en de ontvanger aan elkaar met behulp van twee afzonderlijke absorbeerbare hechtingen en sluit de inguinale plooi helemaal aan het einde na een laatste controle van de microvasculaire anastomosen.
OPMERKING: Inguinale vetkussens worden stevig gehecht om een beschermende laag vet boven de anastomosen toe te voegen en zorgen voor een veilige positie van het transplantaat en de pedikel. Een zorgvuldige sluiting is beter voor wondgenezing; het voorkomt ook resterende bloedingen uit de wond en vermindert het risico op zelfverminking. - Compenseer vochtverlies subcutaan met 1-3 ml zoutoplossing volgens de hoeveelheid perioperatieve bloedingen.
- Plaats een Elizabethaanse kraag om de nek van het dier en breng 2 losse hechtingen aan op de huid om deze in de juiste positie te houden.
- Stop de inademing van isofluraan en controleer het dier continu op een opwarmpad totdat het volledig bij bewustzijn en ambulant is.
Figuur 2: Perioperatief beeld vóór aanvang van de osteomyocutane ledemaat. Een huidbrug van ongeveer 1 cm blijft bewaard tussen de inguinale plooiincisie en de inzet van het transplantaat boven de heup. Het transplantaat wordt onder de brug geplaatst, waarbij het stabiel blijft voor microvasculaire overdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Postoperatieve zorg
- Controleer het dier tweemaal daags gedurende 72 uur, vervolgens eenmaal daags tot postoperatieve dag (POD) 7 en vervolgens twee keer per week.
OPMERKING: De controle moet worden aangepast aan de toestand van het dier en het transplantaat (bleke ogen kunnen aanvullende vloeistoffen vereisen, porfyrinekleuring als indicator van dierlijke pijn, abnormale transplantaatkleur / temperatuur) en verdere zorg moet met de dierenarts worden besproken. Gedurende de gehele onderzoeksperiode is een enkele huisvesting vereist voor de ontvangende ratten om schade aan het transplantaat te voorkomen. - Voer analgesie uit met subcutane injectie van buprenorfine en / of niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel volgens de IACUC-richtlijnen.
- Evalueer het transplantaat en voer dagelijks lichamelijk onderzoek uit met foto's met hetzelfde apparaat.
OPMERKING: Het gebruik van ontharingscrème op de huid van het transplantaat is nuttig om de huidskleur van de transplantatie beter te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze single-operator studie werden 30 syngenegene heterotope partiële ledemaattransplantaties uitgevoerd. Succes werd op postoperatieve dag 21 gedefinieerd als de afwezigheid van VCA-falen of complicaties die euthanasie vereisen. De normale evolutie van het transplantaat is weergegeven in figuur 3. De gemiddelde duur voor gedeeltelijke ledemaatverwerving en transplantaatinstel bij de ontvanger was respectievelijk 35 en 105 min; de gemiddelde ischemietijd was 105 min. Tijdens de follow-up traden twee soorten complicaties op(tabel 1):vroeg of laat. Sommige vereisten euthanasie, andere werden gered, allemaal werden ze besproken met dierenartsen van het personeel(tabel 2). Deze studie rapporteert de ervaring en het advies van de auteurs voor beginners in knaagdiermicrochirurgie(aanvullende tabel 1).
Figuur 3: Normale evolutie van het heterotope achterpootmodel tot het einde van het onderzoek. Haargroei wordt waargenomen tijdens de eerste postoperatieve week; cutane terugtrekking verschijnt na 2 weken. Afkorting: POD = postoperatieve dag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Behandeling van perioperatieve complicaties
Arteriële of veneuze trombose is de meest voorkomende perioperatieve complicatie. De belangrijkste tip om dit te overwinnen en de operatie tot een succes te maken, is om een vroege diagnose te stellen, d.w.z. continue monitoring van de flapkleur / bloeding en terugkerende doorgankelijkheidstest zijn van fundamenteel belang voordat de operatieplaats van anastomoses wordt gesloten. De preventie van deze complicatie moet in het hoofd van de chirurg zijn zodra een incisie wordt gemaakt. De donor moet worden gehepariniseerd met iv-injectie van heparine 100 IE/kg 5 minuten voorafgaand aan de arteriële ischemie. Eenmaal geoogst, moet het transplantaat worden gespoeld met heparine zoutoplossing (100 IE / ml) totdat de veneuze uitstroom duidelijk is. In deze studie kwam in 10% van de gevallen perioperatieve arteriële trombose voor.
Bloedingen komen minder vaak voor en worden gemakkelijk verzacht met een voorzichtige cauterisatie van de transplantaatspieren en een grondige dissectie van de ontvangende plaats. De primaire oorzaak van bloedingen is het anastomotische lek in de slagader. Dit zou vanzelf binnen 3 minuten moeten verdwijnen, of zo niet, dan zijn opnieuw klemmen en revisie van de lekkende anastomose noodzakelijk. Anesthesie-gerelateerde complicaties, die in 6,7% van de gevallen optraden, komen vaker voor bij ongetrainde microchirurgen. Het gebruik van isofluraan is een betrouwbare manier om ratten te verdoven en de lengte van de anesthesie kan in realtime worden aangepast. De chirurg moet worden getraind om de machine correct te gebruiken, de richtlijnen voor inductie- en onderhoudsregime te volgen en de hart- en ademhalingsfrequenties gedurende de hele operatie nauwlettend te volgen. Afhankelijk van de soort, leeftijd of het gewicht van het dier, kan de benodigde hoeveelheid isofluraan variëren. Onvoorspelbaar verlies van dieren is een zeldzame gebeurtenis en wordt meestal niet verklaard door een verdoving of chirurgische fouten.
Vroege complicaties (
VCA-falen kan optreden tijdens de eerste postoperatieve week als gevolg van microvasculaire trombose (veneuze trombose komt vaker voor dan arteriële). Perioperatieve pedikelinstel op lieshoogte is een zeer belangrijke stap. Het verplaatsen van de achterpoot van de rat om het effect van de beweging op de pedikel na te bootsen is cruciaal; de pedikel mag nooit te los of te strak zitten. Intensieve monitoring is een fundamentele vereiste, omdat obductie moet worden uitgevoerd zodra een VCA-storingsdiagnose wordt gesteld. Tijdens obductie geeft een analyse van de positie van de pedikel (knikken of spanning) en de kwaliteit van de trombosed anastomose (achterwandnaad, intraluminale flap) veel informatie over wat kan worden verbeterd tijdens de volgende procedure en moet dus worden uitgevoerd door de opererende chirurg. Veneuze trombose was in 20% van de gevallen een oorzaak van vroege euthanasie, die allemaal vóór POD5 plaatsvonden(figuur 4).
Figuur 4: Postoperatieve veneuze trombose. De huid lijkt blauw en wordt elke dag donkerder. Afkorting: POD = postoperatieve dag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zelfverminking (of autofagie) is een ernstige zorg bij niet-sensuele grafts; het komt vaak voor tussen POD2 en POD7. Indien beperkt tot minder dan een derde van het transplantaatoppervlak en alleen betrekking hebbend op de huid, kunnen chirurgische debridement en hechtingen met behulp van niet-absorbeerbare hechtingen worden besproken met de dierenarts van het personeel (figuur 5A-C). Preventie is afhankelijk van het gebruik van een E-halsband die aan de nek is gehecht tot POD7 en het reinigen van bloed of korst op de chirurgische wonden van het dier. Herhaalde autofagie of diepe verminking vereist euthanasie(figuur 5D).
Figuur 5: Postoperatieve zelfverminking van het niet-sensuele transplantaat. (A-C) Het beperkte oppervlak van auto-verminking bij (A) POD2. (B) Chirurgisch gedebrideerd en opnieuw gehecht; (C) aspect bij POD21. (D) Ernstige autofagie van meerdere lagen van het transplantaat die leiden tot euthanasie van het dier. Afkorting: POD = postoperatieve dag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Late complicaties (>POD7)
Minder frequent en minder dodelijk, deze complicaties vereisen raadpleging van een dierenarts om een adequate behandeling te bieden. Ten eerste kan botblootstelling worden waargenomen in dit model, meestal na de eerste genezing in de derde week na de operatie. Preventie is gebaseerd op zorgvuldig botsnijden (gebruik van botsnijder waardoor gladde randen ontstaan); het bedekken van de botranden met omliggende spieren terwijl rekening wordt gehouden met latere spieratrofie is nuttig. Als het dier vroeg wordt ontdekt en het in goede conditie is, kan chirurgische revisie met de dierenarts worden besproken. Ten tweede kunnen dermale cysten na twee weken rond de operatieplaats optreden(figuur 6). Ze interfereren meestal niet met de toestand van de rat of het transplantaat, maar kunnen op de huid fistelen en geïnfecteerd raken. Het wassen van de chirurgische plaats van de transplantaatinstel om achtergebleven haar in de wond te voorkomen, voorkomt de aanmaak van de cyste. De indicatie voor chirurgische drainage kan worden geëvalueerd met de dierenarts.
Figuur 6: Dermale cysten. Dermale cysten verschijnen(A) na POD14, (B) soms met een cutaan necrotisch centrum voorafgaand aan de fistel. Afkorting: POD = postoperatieve dag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Complicatie | Oplossing | Preventie | |
| Peri-operatief | Microvasculaire trombose | Doe de anastomose snel opnieuw na het spoelen van het vat eindigt met heparine zoutoplossing en getuigt van een goede doorstroming. | Hepariniseer de donor, spoel de flap, beheers de anastomosetechniek en gebruik adequate instrumenten en hechting. |
| Bloeding | Cauteriseren als van spieren, reclamp als van de anastomose en niet spontaan stoppen binnen 3 min. | Grondige cauterisatie tijdens de entoogst | |
| Anesthesie-gerelateerde dood | Bespreek het ondervonden probleem met dierenartspersoneel. | Training in het gebruik van anesthesieapparaat en perioperatieve rattenmonitoring | |
| Vroeg ( |
Microvasculaire trombose | Vroege euthanasie en obductie om de oorzaak van trombose te onthullen | Hangt af van de oorzaak |
| Autoverminking | Bespreek chirurgische reparatie met de dierenarts als eerste gebeurtenis en oppervlakkige schade aan het transplantaat. | E-collar van POD-2 tot POD7 | |
| Laat (>POD7) | Blootstelling aan botten | Bespreek chirurgische revisie met de dierenarts. | Snijd het bot met botsnijder, zorg ervoor dat de rand glad is, herstel met omliggende spieren, rekening houden met latere spieratrofie (kortgesneden). |
| Dermale cyste | Bespreek chirurgische drainage en antibioticabehandeling met de dierenarts | Was de inzetplaats met water; vermijd het achterlaten van haar op de operatieplaats. |
Tabel 1: Mogelijke uitkomsten. Preventie en oplossingen.
Einde studie
Het einde van de studie in dit model werd vastgesteld op POD21; dieren werden geëuthanaseerd met behulp van CO2-verstikking of door exsanguinatie. Als een niet-functioneel transplantaat werden spieratrofie en vetdegeneratie waargenomen als gevolgen van het gebrek aan reïnnervatie. Biopsieën van de huid en spieren worden opgeslagen voor histologische analyse. De liesplooi wordt heropend voor de evaluatie van de vasculaire pedikel (plaatsing, doorgankelijkheid) als euthanasie wordt uitgevoerd voor het einde van het onderzoek.
| Vijf redenen om de dierenarts van het personeel te raadplegen |
| 1) Voor de start van het onderzoek om haar/hem te informeren over de aard van uw studie, geplande analgesie en follow-up strategieën en verwachte resultaten |
| 2) Speciale voeding of aanvullende voedingsstoffen die kunnen helpen de dierconditie tijdens het onderzoek te verbeteren |
| 3) Onverwachte anesthesie-gerelateerde dood |
| 4) Onverklaarbare verslechtering van de dierconditie |
| 5) Chirurgische complicatie om bergingsmogelijkheden of indicaties voor euthanasie te beoordelen |
Tabel 2: Wanneer de dierenarts bellen. Communicatie met het personeel is essentieel voor het uitvoeren van een in vivo onderzoek.
Aanvullende tabel 1: "Do's & Don'ts." Advies voor jonge microchirurgische stagiairs. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orthotopische ledemaattransplantatiemodellen bij knaagdieren zijn beschreven in de literatuur15,16,17; ze vereisen echter een zenuwherstel, spierherbevestiging en een perfecte osteosynthese van het dijbeen, wat een zeer moeilijke stap kan zijn. Deze modellen zijn ook geassocieerd met een hogere morbiditeit en mortaliteit bij knaagdieren14, vooral in de follow-up op korte termijn, omdat het herstel van een normale functie van een getransplanteerde hindlimb enkele maanden kan duren18. Ze maken echter een beoordeling op langere termijn van de entfunctie mogelijk in geval van succes. De belangrijkste beperking bij heterotope ledemaattransplantatie is de spieratrofie veroorzaakt door het ontbreken van reïnnervatie van het transplantaat. Zoals eerder gepubliceerd in de literatuur, kunnen spiervezelblessures optreden zodra vijf dagen na denervatie19. Dit veroorzaakt aanzienlijke spieratrofie en vetdegeneratie na één maand, waardoor het gebruik van dit model voor in vivo studies van meer dan drie weken wordt voorkomen. Vanuit dit oogpunt zijn partiële heterotope osteomyocutane flapmodellen het beste voor kortetermijnstudies naar weefselbehoud10, weefselbio-engineering en immunosuppressiestrategieën20.
In het voorgestelde model zijn zowel chirurgische als postoperatieve complicaties beperkt en kunnen ze gemakkelijk en snel worden aangepakt door een microchirurgisch onderzoeker. We schatten dat succes kan worden bereikt in dit model na 3-6 transplantaties voor een jonge chirurg, gezien het feit dat ze basiscursussen microchirurgie hebben gekregen. Het is ook een procedure die door een enkele operator in minder dan 3 uur kan worden uitgevoerd met een ischemietijd van minder dan 2 uur. Dit model kan ook worden uitgevoerd door twee operators, waardoor de ischemietijd wordt verkort tot de tijd van alleen microvasculaire anastomosen. De cruciale stap in dit model is de transplantaatinstel en het zorgen voor een goede plaatsing van de pedikel om knikken of spanning te voorkomen die microvasculaire trombose zou veroorzaken. Om deze reden moet dissectie van de femorale vaten zo proximaal en distaal mogelijk verlopen bij respectievelijk de donor en de ontvanger. Cutane vascularisatie moet grondig worden bewaard door de huid rond de ledemaat gewikkeld te houden tot transplantaatrevascularisatie om een afschorend effect op de arteriële huidperforaties te voorkomen, wat een lage huidperfusie en daaropvolgende huidnecrose kan veroorzaken.
In de literatuur worden complicaties in VCA-modellen met knaagdieren niet goed gerapporteerd. De kennis van elke mogelijke uitkomst is essentieel om complicaties te kunnen voorkomen en anticiperen. Deze studie benadrukt de noodzaak van goede communicatie met de dierenarts van het personeel. Het verwerven van vaardigheden in het hanteren van ratten en lichamelijk onderzoek is cruciaal voor het welzijn van het dier en het juiste verloop van het onderzoek. Zodra deze techniek onder de knie is, kan dit model worden gebruikt voor VCA-onderzoek met een slagingspercentage van bijna 100%. Hoewel niet-functionele modellen niet geschikt zijn voor langetermijnevaluaties, zijn ze van groot belang voor vroege transplantaatbeoordeling in immunologisch onderzoek naar full-mismatch VCA-transplantatie of evaluatie van ischemie-reperfusieletsels. Het beschreven model biedt een grote huidcomponent en spiervolume dat herhaaldelijk kan worden bemonsterd met behulp van ponsbiopten, waarbij verschillende histologische en immunologische testen worden gegenereerd, evenals beeldvormende evaluatietechnieken13. Dit precieze protocol biedt een reproduceerbaar en betrouwbaar VCA-model bij ratten met verminderde morbiditeit zodra de mogelijke complicaties zijn voorzien en actief zijn voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Bureau van de Assistent-minister van Defensie voor Gezondheidszaken via het Congressionally Directed Medical Research Program onder Award No. W81XWH-17-1-0680. Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteurs en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van Defensie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 GA angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381412 | |
| 4-0 suture Black monofilament non absorbable suture | Ethicon | 1667 | Used to suture the E-collar to the back of the neck |
| 4-0 suture Coated Vicryl Plus Antibacterial | Ethicon | VCP496 | |
| Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform | ASSI | ASSI.ATK26426 | |
| Bipolar cords | ASSI | 228000C | |
| Black Polyamide Monofilament USP 10-0, 4 mm 3/8c | AROSurgical | T04A10N07-13 | Used to perform the microvascular anastomoses |
| Buprenorphine HCl | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| Dilating Forceps | Fine science tools (FST) | 18131-12 | |
| Dissecting Scissors 15 cm, Round Handle 8 mm diameter, Straight Slender Tapered Blade 7 mm, Lipshultz Pattern | ASSI | ASSI.SAS15RVL | |
| Double Micro Clamps 5.5 x 1.5 mm | Fine science tools (FST) | 18040-22 | |
| Elizabethan collar | Braintree Scientific | EC-R1 | |
| Forceps 13.5 cm long, Flat Handle, 9 mm wide Straight Tips 0.1 mm diameter (x2) | ASSI | ASSI.JFL31 | |
| Halsey Micro Needle Holder | Fine science tools (FST) | 12500-12 | |
| Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter | ASSI | ASSI.BPNS11223 | |
| Lone Star Elastic Stays | CooperSurgical | 3314-8G | Used to retract the inguinal ligament for femoral vessels dissection |
| Lone Star Self-Retaining Retractors | CooperSurgical | 3301G | |
| Micro-Mosquito Hemostats | Fine science tools (FST) | 13010-12 | Used to retract the inguinal fat pad distally |
| Needle Holder, 15 cm Round Handle, 8 mm diameter, Superfine Curved Jaw 0.2 mm tip diameter, without lock | ASSI | ASSI.B1582 | |
| Nylon Suture Black Monolfilament 8-0, 6.5 mm 3/8c | Ethilon | 2808G | Used to ligate collateral branches on the femoral vessels |
| Offset Bone Nippers | Fine science tools (FST) | 16101-10 | |
| S&T Vascular Clamps 5.5 x 1.5 mm | Fine science tools (FST) | 00398-02 | |
| Walton scissors | Fine science tools (FST) | 14077-09 |
References
- Lanteiri, L., et al. Feasibility, reproducibility, risks and benefits of face transplantation: a prospective study of outcomes. American Journal of Transplantation. 11 (2), 367-378 (2011).
- Park, S. H., Eun, S. C., Kwon, S. T. Hand transplantation: current status and immunologic obstacles. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (1), 97-104 (2019).
- Cetrulo, C. L., et al. Penis transplantation: first US experience. Annals of Surgery. 267 (5), 983-988 (2018).
- Grajek, M., et al. First complex allotransplantation of neck organs: larynx, trachea, pharynx, esophagus, thyroid, parathyroid glands, and anterior cervical wall: a case report. Annals of Surgery. 266 (2), 19-24 (2017).
- Pribaz, J. J., Caterson, E. J. Evolution and limitations of conventional autologous reconstruction of the head and neck. Journal of Craniofacial Surgery. 24 (1), 99-107 (2013).
- Lipson, R. A., et al. Vascularized limb transplantation in the rat. I. Results with syngeneic grafts. Transplantation. 35 (4), 293-299 (1983).
- Lipson, R. A., et al. Vascularized limb transplantation in the rat. II. Results with allogeneic grafts. Transplantation. 35 (4), 300-304 (1983).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Arav, A., Friedman, O., Natan, Y., Gur, E., Shani, N. Rat hindlimb cryopreservation and transplantation: a step toward "organ banking". American Journal of Transplantation. 17 (11), 2820-2828 (2017).
- Gok, E., et al. Development of an ex-situ limb perfusion system for a rodent model. ASAIO Journal. 65 (2), 167-172 (2019).
- Gok, E., Rojas-Pena, A., Bartlett, R. H., Ozer, K. Rodent skeletal muscle metabolomic changes associated with static cold storage. Transplantation Proceedings. 51 (3), 979-986 (2019).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Fleissig, Y., et al. Modified heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap model in the rat for translational vascularized composite allotransplantation research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59458 (2019).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Jang, Y., Park, Y. E., Yun, C. W., Kim, D. H., Chung, H. The vest-collar as a rodent collar to prevent licking and scratching during experiments. Lab Anim. 50 (4), 296-304 (2016).
- Kern, B., et al. A novel rodent orthotopic forelimb transplantation model that allows for reliable assessment of functional recovery resulting from nerve regeneration. American Journal of Transplantation. 17 (3), 622-634 (2017).
- Perez-Abadia, G., et al. Low-dose immunosuppression in a rat hind-limb transplantation model. Transplant International. 16 (12), 835-842 (2003).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022 (2010).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 2050312120968721 (2020).
- Lindboe, C. F., Presthus, J. Effects of denervation, immobilization and cachexia on fibre size in the anterior tibial muscle of the rat. Acta Neuropathologica. 66 (1), 42-51 (1985).
- Nazzal, J. A., Johnson, T. S., Gordon, C. R., Randolph, M. A., Lee, W. P. Heterotopic limb allotransplantation model to study skin rejection in the rat. Microsurgery. 24 (6), 448-453 (2004).
