Summary
여기에서 보고된 프로토콜은 실험실에 포함된 작은 케이지 예심에서 벡터 통제를 위한 유전으로 조작된 모기의 성능을 평가하는 세 가지 대안을 보여줍니다. 각 프로토콜은 모기 균주 곰 (유전자 드라이브 또는 비 유전자 드라이브)과 측정 된 매개 변수의 유형을 특정 수정에 맞게 조정됩니다.
Abstract
유전자 변형 벡터를 사용하여 모기 매개 병원균의 제어는 기존의 제어 전략을 보완하는 유망한 도구로 제안되었습니다. CRISPR 기반 호밍 유전자 드라이브 시스템은 과학 커뮤니티 내에서 트랜스제닉 기술에 더 쉽게 접근할 수 있게 했습니다. 작은 실험실 케이지 시험에서 형질 전환 모기 성능 및 야생 형 대응과의 비교평가는 질병 예방 전략을 구체화하기 위해 후속 현장 케이지 실험 및 실험 평가의 설계에 대한 귀중한 데이터를 제공합니다. 여기에서, 우리는 말라리아의 opheline 모기 벡터에 있는 간질 퍼짐을 평가하기 위하여 실험실 조정에서 이용된 3개의 다른 프로토콜을 제시합니다. 여기에는 침수성 방출(유전자 구동 시스템 없음)과 유전자 구동 중복 및 겹치지 않는 생성 시험이 포함됩니다. 세 가지 시험은 여러 매개 변수에서 다르며 원하는 실험 설정에 맞게 조정할 수 있습니다. 또한, 작은 케이지에 있는 곤충 연구는 실험실에서 개방필드 방출로 엔지니어링곤충의 점진적인 전환의 일부입니다. 따라서 여기에 설명된 프로토콜은 궁극적으로 말라리아 제거를 위한 새로운 기술의 현장 구현을 돕는 경험적 가치를 제공하는 귀중한 도구를 나타냅니다.
Introduction
유전자 조작 모기에 근거를 둔 전략은 말라리아를 일으키는 원인이 되는 것과 같은 벡터 부담 병원체의 전송을 통제하기 위하여 추진되고 있습니다1. 여기에는 Anopheles 모기의 수와 밀도(인구 억제) 또는 2) 벡터가 인간 질환(인구 변형, 교체 또는 변경)에 책임이 있는 기생충을 전송하는 능력을 손상시키기 위한 기술 1)이 포함되며, 여기서 벡터의 변종은 병원체 전이를 방지하는 이펙터 유전자를 표현하도록 설계된다. 이러한 유전 적 접근은 CRISPR/ Cas9 기지를 둔 유전자 드라이브의 출현에 의해 강화되었습니다, 파수량 특성의 효과적인 퍼짐의 기생충 전송 모기에 있는 개념증명 및 케이지된 인구에 있는 항 기생 효과기 분자.
작은 실험실 케이지 시험은 필드 응용 프로그램에 대한 추가 개발에 대한 단계적 접근의 일환으로 형질 전환균의 특성을 평가하기위한 첫 번째 단계를 나타냅니다2. 특정 결과 고려 사항에는 경쟁 환경에서 도입 된 DNA의 발성 성, 표현형의 침투 및 표현성 및 안정성이 포함됩니다. 관련 실험 설계 기능에는 케이지의 크기, 모기 밀도, 복제 수, 겹치거나 겹치지 않는 세대, 연령 구조적 대상 인구, 엔지니어링 균주, 남성 전용, 여성 전용 또는 혼합 성 방출, 방출 비율, 혈액 식사 소스 (인공 또는 살아있는 동물) 및 스크리닝 절차가 포함됩니다.
우리는 여기에 undative 방출 (유전자 구동 시스템 없음)에 대한 아노페린 모기의 균주를 평가하는 데 사용되는 프로토콜과 Cas9 엔도니슬리스와 가이드 RNA (gRNA)에 의해 매개 된 자율 유전자 구동 시스템을 운반하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜의 응용 프로그램은 Pham 외에 나타납니다 . (2019) 2, 카르발라 르자라수 외. (2020) 3, 아돌피 외. (2020) 4.
무수한 방출 예심은 야생 인구로 많은 수의 형질 전환 모기의 다중 방출에 따라 Mendelian 상속의 밑에 디자인된 전환유전자의 퍼지는 비율을 평가합니다. 드라이브 시스템에 전유전자를 부착하지 않고, 무수성 방출 시험의 데이터는 안정된 인구에 대한 관심의 전환유전자의 적합성 및 역학에 관한 정보를 제공한다.
모기 집단이 자율적인 유전자 구동 시스템을 포함하는 때, 작은 케이지 예심은 형질전환 수컷의 단 하나 소개 에 따라 지배적인 마커 증가의 비율을 결정함으로써 원하는 전환유전자의 퍼짐의 역학을 평가하기 위하여 디자인됩니다. 자율 유전자 구동 원소는 후속 세대에서 활성화될 수 있도록 Cas9 뉴클레아제, gRNA 및 지배적인 마커를 코딩하는 유전자를 운반한다.
'겹치는' 세대는 같은 케이지에 여러 세대가 동시에 존재하여 연령 구조의 연속 인구를 생성하는 반면, '겹치지 않는'은 각 연속 케이지 집단2에서 단일 이산 세대를 의미합니다. 유전자 구동 케이지 실험은 드라이브(변환) 속도의 초기 역학이 결정될 수 있고(구조에 따라 8-10세대)를 결정할 수 있고, 모기 집단 내의 트랜스진의 단기 안정성에 대한 정보를 제공하지만, 지배적인 마커 주파수가 도달하거나 완전한 도입에 가까워지거나 완전한 도입에 가까워지면 어떤 일이 일어나는지 밝히지 못할 수 있다(유전자 구동 시스템의 적어도 하나 이하의 모기를 운반하는 모든 모기).
Protocol
동물 윤리 성명서
이 연구는 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지침에 있는 권고에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 의정서는 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (동물 복지 보증 번호 A3416.01).
1. 비 유전자 드라이브 모기에 대한 undative 방출 시험 (그림 1)
- 케이지 설정 및 유지 보수
- 3주 연속 각 케이지에 60초 인스타 와일드 타입(WT) 애벌레를 추가하여 트리플리케이트 0.216 m3 케이지 3세트를 설정합니다.
참고 : 가벼운 현미경 검사법에 의해 두 번째 인스타 애벌레의 성별을 결정할 수 없으므로 각 케이지에 추가 된 샘플은 남성과 여성 으로 구성됩니다. - 매주 각 케이지에 미취처리된 마우스를 혈밀 소스(그림 2A)와 혈밀 3일 후에 배부 용기로 제공합니다.
참고: 대체 인공 공급 장치를 사용할 수 있지만, 혈액식사를 위한 살아있는 마취마우스를 제공하면 이러한 대형(0.216 m3) 케이지 형식에서 모기 먹이 성능이 향상됩니다. 이를 위해서는 쥐 사용에 대한 승인된 동물 사용 프로토콜 및 관련(예: 기관 동물 관리 및 사용 위원회, IACUC)이 필요합니다.
참고: 개별 마우스는 4 mg/마우스 케타민 HCl 및 0.4 mg/마우스 자일라진의 혼합물로 마취된다. 동물은 이 혼합물의 0.1-0.5 mL 사이에서 주입됩니다. - 매주 각 케이지에서 달걀을 부화시키고 60초 인스타(L2) 애벌레를 무작위로 선택하여 각 케이지로 돌려보내 필멸의 삶(주 4-8주)을 상쇄한다.
참고: 1.1.1~1.3단계는 케이지에 안정적이고 분산된 연령 구조 인구를 확립하는 데 필요합니다. - 9주차에 원하는 남성 방출 비율의 방출을 위해 무작위로 1.1.1 단계로 조립된 케이지를 할당합니다.
- 실험 전체의 일관성을 평가하기 위해 트리클리케이트 케이지 한 세트를 컨트롤로 지정합니다.
- 각 원하는 방출 비율에 대해 한 세트의 삼중 을 지정합니다 (예 : 1:1 또는 1:0.1 형질 전환 : WT 남성).
참고: 이 점을 '실험 단계'라고 합니다.
- 3주 연속 각 케이지에 60초 인스타 와일드 타입(WT) 애벌레를 추가하여 트리플리케이트 0.216 m3 케이지 3세트를 설정합니다.
- 복제 및 릴리스 비율
- 매주 60 WT pupae (30 남성과 30 여성)를 제어 케이지에 추가합니다.
- 1:1 비율을 유지하기 위해, 각각의 케이지에 60 (30 남성과 30 여성) WT pupae와 함께 매주 30 형질전환 남성 강아지를 추가합니다.
- 1:0.1 비율을 유지하기 위해, 각각의 케이지에 60 (30 남성과 30 여성) WT pupae와 함께 매주 300 형질 전환 남성 강아지를 추가합니다.
참고: 케이지에 야생 모기를 계속 추가하면 케이지 밀도가 유지되며, 이는 연령과 관련된 성인 사망률로 인해 매주 감소할 것으로 예상됩니다.
- 표현형 의 선별
- 각 케이지에서 총 300개의 애벌레를 무작위로 선택합니다. 형광 필터가 장착 된 스테레오 현미경의 사용으로, 애벌레와 푸팔 단계에서 형광 지배적 인 마커의 발현을위한 화면과 결과 성인의 섹스를 점수 (도 3).
참고: 표현형 스크리닝은 모기에 통합된 트랜스진 구조에 포함된 지배적인 마커(예를 들어, 디스코종 스프. 적색 형광 단백질 [DsRed], 시안 형광 단백질 [CFP], 녹색 형광 단백질 [GFP]), 및 발기인 구동 발현(모기 트랜스게니스에서 가장 많이 사용되는 3P)의 신경 발현에 의존한다. - 실험 설계에 정의된 결과 매개 변수에서 요구하는 만큼 이 프로토콜을 따르십시오.
참고: 모든 모기가 트랜스진의 적어도 하나의 사본(지배적인 형광 마커의 존재에 의해 결정) 또는 케이지에 있는 형질-WT 모기의 비율이 안정되고 몇몇 (3-5) 세대 후에 크게 변동하지 않는 때 예심은 일반적으로 종료됩니다.
- 각 케이지에서 총 300개의 애벌레를 무작위로 선택합니다. 형광 필터가 장착 된 스테레오 현미경의 사용으로, 애벌레와 푸팔 단계에서 형광 지배적 인 마커의 발현을위한 화면과 결과 성인의 섹스를 점수 (도 3).
2. 유전자 구동 모기의 중첩 세대 시험 (그림 4)
참고: 유전자 구동 시스템을 운반하는 모기는 서면 및 검토 된 프로토콜을 필요로하며, 필요한 경우 기관 생물 안전위원회 (IBC) 또는 동등한 다른 사람에 의해 승인되어야한다. 모기 봉쇄 (ACL 2+ 수준)는 권장 절차를 따라야합니다5,6,7. 특히, 유전자 드라이브 실험은 두 개의 엄격한 감금 전략을 채택해야 한다. 첫 번째는 일반적으로 유기체와 환경 사이의 물리적 장벽 (장벽 전략)입니다. 이를 위해서는 모기가 탈출할 수 없도록 안전한 곤충 및 표준 수술 절차(모니터링 포함)가 필요합니다. 두 번째 감금 전략은 분자, 생태학적 또는 생식5일 수 있다.
- 케이지 설정
- 원하는 형질전환:WT 남성 방출 비에 대해 트리플리케이트 0.216 m3 케이지 2세트를 설정합니다.
- 1:1의 남성 방출 비율을 달성하기 위하여는, 각 복제 케이지에 pupa 단계에서 120 형질전환 남성, 120 WT 남성 및 120 WT 여성을 추가합니다.
- 1:10의 방출 비율을 달성하기 위하여는, 각 복제 케이지에 pupa 단계에서 12개의 형질전환 남성, 120WT 남성 및 120WT 여성을 추가합니다.
참고: 다른 방출 비율은 시험될 수 있습니다 (1:1, 1:3, 1:10 등) 및 실험을 시작하는 데 사용되는 모기의 수는 그에 따라 다릅니다. 그러나 낮은 숫자가 데이터의 통계 평가에 미치는 영향을 고려하는 것이 중요합니다.
- 원하는 형질전환:WT 남성 방출 비에 대해 트리플리케이트 0.216 m3 케이지 2세트를 설정합니다.
- 인구 유지 및 심사
- 각 케이지에 4-7일 된 암컷에게 마취된 마우스를 사용하여 혈액식을 제공합니다(그림 2A).
- 혈액 식사 후 3 일, 각 케이지에 oviposition 용기를 삽입합니다.
- 애벌레 트레이에 계란을 부화, 선택 ~240 첫 번째 인스타 (L1) 각 케이지에서 무작위로 애벌레, 성인으로 그들을 양육하고, 각각의 케이지에 반환.
- 2.2.1 단계에서 설명된 바와 같이 새로 출현한 성인을 위해 3-4일마다 추가(2-3) 혈액식을 제공한다.
참고: 후속 세대 중 추가 형질전환 수컷은 추가되지 않습니다. - 각 케이지에서 총 300개의 애벌레를 무작위로 선택하고 형광 스테레오 현미경을 사용하여 애벌레 및 푸팔 단계에서 지배적 인 마커 표현형의 존재를 선별하고 성에 대한 신흥 성인점수 (도 3).
참고: 이전과 마찬가지로, 현상전형 스크리닝은 유전자 구동 시스템에 포함되고 형질형 모기(예를 들어, DsRed, CFP 또는 GFP)에 통합된 지배적인 마커 및 프로모터에 의존할 것이다. 표적 유전자의 동종구 또는 이종성 중단이 눈에 보이는 표현형(예를 들어, 눈 색소침착과 관련된 유전자)을 초래하는 경우, 이 특성의 검열은 변경된 표현형을 시각화하는 것이 가장 쉬운 단계에 달려 있습니다. - 실험 설계에 정의된 결과 매개 변수에서 요구하는 만큼 이 프로토콜을 따르십시오.
참고: 각 세대(혈액 식사에 의해 구분)는 ~3주가 걸립니다. 모든 모기가 유전자 구동 구조에 대해 동종구로 간주되거나 인구가 유전자 드라이브 구조의 적어도 하나의 사본을 운반하는 모기의 최대 비율로 안정될 때 예심은 일반적으로 종료됩니다.
3. 유전자 구동 모기의 중복되지 않는 세대 시험 (그림 5).
- 케이지 설정
- 조사할 WT 남성에 대한 형질형 간염의 각 특정 방출 비율에 대해 0.005 m3 케이지 모집단을 트리플리케이트(triplicate)를 설정합니다(예: 각각 1:1, 1:3, 1:10 방출 비율로 설정된 3세트의 트리플리케이트 케이지 세트). 남성과 여성의 동일한 총 수와 모든 케이지를 설정합니다.
참고 : 보충 파일 은 0.005 m3 식민지 케이지의 건설을 보여주는 비디오입니다.- 추가 50 형질 성 남성, 50 WT 남성, 그리고 100 WT 여성 각각 3 개의 복제 케이지의 1:1 남성 방출 비율을 달성 하.
- 추가 25 형질 성 남성, 75 WT 남성, 그리고 100 WT 여성 각각 3 개의 복제 케이지의 1:3 남성 방출 비율을 달성 하.
- 추가 9 형질성 남성, 90 WT 남성, 그리고 100 WT 여성 각각 3 복제 케이지의 1:10 남성 방출 비율을 달성.
참고: 다른 방출 비율을 시험할 수 있고 실험을 시작하는 데 사용되는 모기의 수는 그에 따라 다를 수 있습니다. 그러나, 통계 분석에 모기의 낮은 수의 영향을 고려하는 것이 중요합니다. 단일 릴리스입니다. 어떤 후속 세대에 추가 된 형질 전환 수 컷이 추가되지 않습니다.
- 조사할 WT 남성에 대한 형질형 간염의 각 특정 방출 비율에 대해 0.005 m3 케이지 모집단을 트리플리케이트(triplicate)를 설정합니다(예: 각각 1:1, 1:3, 1:10 방출 비율로 설정된 3세트의 트리플리케이트 케이지 세트). 남성과 여성의 동일한 총 수와 모든 케이지를 설정합니다.
- 인구 유지 및 심사
- 각 케이지에 4-7일 된 암컷에게 인공 수유 장치(도 2B)를 이용하여 혈액식을 2일 연속으로 제공합니다.
참고: 여성을 위한 일상적인 혈액 식사는 수유 장치에서 제공하는 혈액(예를 들면, 송아지의 혈액)의 상업적으로 이용 가능한 근원으로 이루어져 있습니다. 살아있는 마취 마우스는 더 나은 공급 성능을 위해 더 큰 (0.216 m3) 케이지 형식으로 혈류를 제공하기 위해서만 사용됩니다. - 두 번째 혈밀 후 3 일 동안 oviposition 용기를 추가합니다. 3일 후, oviposition 용기를 제거합니다.
참고: 이 단계에서 5-10 명의 여성은 각 케이지에서 무작위로 선택하고 필요한 경우 불임 및 fecundity와 같은 추가 피트니스 매개 변수를 평가하기 위해 바이알에 개별적으로 배치 할 수 있습니다. - 섹스에 의해 점수 모든 성인 (죽은 살아) 케이지에 남아 분자 분석을 위해 -80 ° C에 저장.
- 계란을 부화하고 무작위로 선택 200 L1 애벌레에서 1:1 과 1:3 비율 케이지다음 세대를 위한 새로운 케이지를 채우기 위해.
참고: 1:10 비율 케이지에서 형질 전환 개인의 빈도가 낮기 때문에 무작위 샘플링은 다음 세대에서 트랜스제닉 자손의 과도한 손실로 이어질 수 있습니다. - 1:10 케이지와 충분한 수의 형질전환 모기에 대한 정확한 샘플링을 보장하기 위해, 지배적인 마커를 위해 모든 애벌레를 선별하고 관찰된 트랜스진 주파수를 반영하는 200개의 애벌레를 선택하여 새로운 케이지를 채웁니다.
참고: 1:10 케이지는 ≥80%의 유전자 주파수에 도달하면 1:1 및 1:3 케이지와 동일하게 유지관리할 수 있습니다. - 심층 분석을 위해 각 케이지에서 500개의 애벌레를 무작위로 선택합니다. 유충 및 푸팔 단계에서 예상되는 마커 표현형을 위한 형광 스테레오 현미경의 밑에 스크린 및 성인의 성점수 (그림 3).
참고: '예외적' 표현형은 내성 골자 형성을 모니터링하기 위해 분자적으로 교차하고 분석하도록 선택할 수 있다. - 이 프로토콜은 실험 설계에 정의된 결과 매개 변수에 필요한 만큼의 세대에 대해 따를 수 있습니다.
참고: 각 세대는 혈밀에 의해 구분되며 ~ 3주가 걸립니다. 재판은 일반적으로 모든 모기가 유전자 드라이브 구조 또는 인구가 형질 전환 모기의 최대 보급에서 안정하기 위해 동질이라고 간주될 때 종료됩니다. 그리고 이전과 마찬가지로, 표현형에 대한 스크리닝은 형질형 모기(예를 들어, DsRed, CFP, GFP)에 통합된 지배적인 마커 및 프로모터에 의존하거나 눈에 보이는 표현형(예를 들어, 안료침착과 관련된 유전자)을 제시하는 경우 표적 유전자에 의존할 것이다.
- 각 케이지에 4-7일 된 암컷에게 인공 수유 장치(도 2B)를 이용하여 혈액식을 2일 연속으로 제공합니다.
Representative Results
비 유전자 드라이브 또는 자율 유전자 드라이브 수정을 부담하기 위하여 생성된 Transgenic 편성 편도모기는 프로토콜 단면도에 기술된 것과 같이 케이지 예심을 위해 설치됩니다. 여기에 표시된 대표적인 결과는 Pham 등에서 수행한 각 케이지 시험 실험의 가장 성과가 뛰어난 복제의 표현형 역학을 묘사합니다. (2019) 2 아노페레스 스티븐스 모기. 3개의 예심 (1 - 3, 각각: 무수성 비 유전자 드라이브, 겹치는 유전자 드라이브 및 비 겹치는 유전자 드라이브)는 케이지의 크기(0.216 m3 대 0.005 m3), 표적 인구가 노화 구조화되었는지 여부( 마우스 또는 인공 사료)의 항성 및 방출 비율과 같은 다른 매개 변수에서 다양합니다. 표현의 수단으로 , 도 6 은 7세대의 과정에서 사용되는 세 프로토콜 모두에 대해 동일한 방출 비율(1:1)에서 선택된 관찰된 데이터를 표시합니다.
1:1 비드라이브 릴리스는 6-7세대 내에서 >80% 트랜스진 도입에 도달합니다. 유전자 구동 형질전환 케이지 시험의 경우, 1:1 은 3-4 세대 이내에 이 수준에 도달하는 비 겹침 및 중첩 프로토콜 모두에서 방출되므로 유전자 구동 시스템의 단일 방출이 트랜스진 도입을위한 비 드라이브 침전성 릴리스보다 더 효율적일 수 있다는 기대를 검증합니다. 더 빠른 궤도는 또한 추세선의 경사에 의해 확인될 수 있습니다. 두 유전자 구동 프로토콜, 다른 설정에도 불구하고, 유사한 각도와 경사 추세를 제시. 관찰의 끝에서, 비 드라이브 케이지 달성 ~80% 트랜스 진을 베어링 개인의, 유전자 드라이브 개인 케이지 완료에 도달 하는 동안 (또는 거의 완전 한) 소개. 여기에 설명된 프로토콜을 이용한 개별 실험 결과에 대한 완전한 데이터 및 처리 세부 정보는 Pham 외의 그림 1-3에서 확인할 수 있다 . (2019) 2, 카발라 르자라수 외의 그림 2-3 . (2020) 3 및 그림 3 아돌피 외의. (2020) 4.
그림 1. 비 드라이브 무수한 릴리스 시험 회로도. 90.216 m3 케이지는 각각 60 야생 형 두 번째 인스타 (혼합 남녀) 애벌레로 설정됩니다. 3주차부터 암컷은 매주 혈밀을 제공하며 계란은 수집되고 부화됩니다. 8주차까지 60개의 애벌레가 무작위로 선택되어 매주 각 케이지로 돌아와 케이지(초기 단계)에 연령 구조화 된 인구를 만듭니다. 9주차부터 9개의 케이지는 트랜스제닉:야생형 남성 방출비율(실험상)에 따라 트리플리케이트에 무작위로 배정됩니다. 케이지 A(컨트롤)에는 형질전환 푸파가 추가되지 않습니다. 암컷은 매주 혈밀을 제공하며 계란은 수집, 부화 및 푸파로 사육됩니다. 30 명의 남성과 30 명의 여성 야생 형 새끼가 케이지에 다시 추가됩니다. 케이지 1:1에는 30개의 형질전환 수컷 푸파가 추가되었습니다. 케이지 1:0.1에는 추가된 300개의 형질전환 수컷 푸파가 추가되었습니다. 9케이지 각각에서 300개의 애벌레가 무작위로 선택되고 형광 마커를 선별한다. 이 절차는 유전자 고정 (몇 세대 후 형질 전환 형 야생 형 모기의 안정화 된 비율)까지 매주 반복되었다. 팜 외에서 적응 . (2019) 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 케이지 인구의 혈액 공급. (A) 마취 마우스 또는 (B) 혈청 혈액 공급제는 각각 0.216 m3 케이지 또는 작은 0.005 m3 케이지에 여성 모기를 먹이는 혈액공급에 대해 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 비 드라이브, 겹치는 유전자 드라이브 및 겹치는 유전자 드라이브 케이지 시험을 위한 표현형을 선별합니다. 유충의 형광 이미지, 푸파 와 형질 전환 또는 야생 형 표현형의 성인. 이 예에서, An. stephensi 개인은 눈에 있는 3xP3 프로모터에 의해 구동된 DsRed 마커를 위해 검열되었다 (DsRed+ 또는 DsRed-), 모든 세 단계로 볼 수 있고, 성인은 섹스 (♀ 또는 ♂)를 위해 검열되었다. 미드구트의 음식 볼루스와 관련된 야생 형 애벌레의 배경 형광에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 중복 유전자 드라이브 케이지 시험 회로도. 6 개의 0.216 m3 케이지는 유전자 드라이브 : 야생 형 남성 방출 비율에 따라 삼중 케이지에 설치됩니다. 각 케이지에 야생형 남성 120마리와 야생형 암컷 120마리가 추가되었습니다. 1:1 유전자 드라이브 남성 방출 비율을 가진 케이지는 추가120 형질 전환수컷이 추가되었습니다. 1:10 남성 방출 비율을 가진 케이지는 추가12 형질 전환 수컷이 추가되었습니다. 트랜스진의 완전한 소개까지, 매 3 주마다, 성인 여성은 혈액 식사와 함께 제공되며 계란은 수집 및 부화됩니다. 총 240개의 애벌레가 무작위로 선택되어 각각의 케이지로 돌아왔습니다. 삼백(300) 애벌레는 무작위로 선택되어 지배적인 마커를 위해 선별된다. 그들은 나중에 눈 색깔과 섹스에 대한 강아지와 성인으로 선별됩니다. 원래 케이지에 추가 된 형질 전환 수컷이 추가되지 않습니다. 팜 외에서 적응 . (2019) 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 겹치지 않는 유전자 구동 케이지 시험 회로도. 9 개의 작은 0.005 m3 케이지는 유전자 드라이브 : 야생 형 남성 방출 비율에 따라 트리플 리케이트에 설치됩니다. 1:1 남성 방출 비율을 가진 케이지에는 100개의 야생형 암컷, 50명의 야생형 남성 및 50명의 유전자 구동 남성이 추가되었습니다. 1:3 남성 방출 비율을 가진 케이지에는 100명의 야생 형 암컷, 75개의 야생형 남성 및 25명의 유전자 구동 남성이 추가되었습니다. 케이지 1:10 남성 방출 비율은 100 야생 형 암컷, 90 야생 형 남성, 9 유전자 구동 남성이 추가되었습니다. 암컷은 혈액 식사와 계란수집 및 부화가 제공됩니다. 1:1과 1:3 케이지의 경우, 200개의 애벌레가 무작위로 선택되어 다음 세대를 위해 부모의 새장과 는 별개로 새 케이지를 채우는 데 사용됩니다. 추가 500 애벌레는 무작위로 선택되고 푸파에 사육되며, 지배적인 마커 유전자를 위해 선별됩니다. 500 pupae는 성인에게 양육되고 섹스로 점수가 매겨져 있습니다. 나머지 모든 애벌레는 마커를 위해 선별됩니다. 1:10 케이지의 경우, 모든 애벌레는 기존 트랜스진 주파수를 반영하는 1-12 세대 및 200 개의 애벌레에서 새로운 케이지를 채우는 데 사용됩니다. 13세대부터 이 케이지는 1:1 및 1:3 케이지와 동일하게 설정됩니다. 팜 외에서 적응 . (2019) 2 와 카르발라 르자라수 외. (2020) 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 다른 인구 대체 케이지 시험에 대한 예측 된 유전자 고정 역학. Pham 외에서 수행한 각 케이지 시험 실험에 대해 가장 성과가 뛰어난 복제의 예상 표현형 역학을 표현한다 . (2019) 2, 7 세대 이상 모니터링. 실험 설정은 프로토콜에 설명되어 있습니다. 예측은 1:1 릴리스 모델의 모든 9개의 실험의 데이터를 기반으로 합니다(세 가지 다른 케이지 평가판 프로토콜 각각에 대해 트리플리케이트 복제). X축은 초기 도입 후 생성 번호이며 Y축은 시간이 지남에 따라 DsRed 마커 표현형(DsRed+)을 나타내는 애벌레의 비율입니다. 대시선은 데이터의 선형 추세선을 나타냅니다. DsRed+ 표현형은 수정된 본인의 복사본을 하나 이상 갖는 결과를 낳습니다. 따라서 결과는 유전자 구동 시스템에서 신속한 전환유전자의 확산을 반영하고, 관찰의 끝에 (가까이) 완전한 소개에 도달한다. 복제본과 실험에 대한 전체 상세 데이터 간의 가변성을 보려면 Pham 외를 참조하십시오 . (2019) 2, 카르발라 르자라수 R 외.(2020)3 및 아돌피 A 외 (2020)4. Pham TB 외에서 적응된 심정. (2019) 말라리아 벡터 모기의 실험인구 수정, Anopheles stephensi. PLOS Genet 15 (12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A 외. (2020) 말라리아 모기 Anopheles stephensi에서 효율적인 인구 수정 유전자 드라이브 구조 시스템. 낫 코먼 11 (1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 및 카르발라 르자라수 R 외. (2020) 말라리아 벡터 모기, Anopheles 감비아의 인구 변형을 위한 차세대 유전자 드라이브. 프락 나틀 아카드 Sci 미국 117 (37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 : 0.005 m3 콜로니 케이지 의 건설. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
병원균 차단 능력이 있거나 불임 유전자를 견딜 수 있는 유전자 조작 모기는 벡터 매개 질병을 제어하는 새로운 도구를 구성합니다. 이러한 대체 접근법을 구성하는 매개 변수의 복합성을 감안할 때, 그들의 연구에서 중요한 단계는 대조목적을 위해 합성 유전자 방출의 잠재적 결과에 빠르고 안전한 예측을 허용하는 실험실 에 국한된 실험 평가로 이루어져 있습니다1.
케이지 된 인구에서 트랜스 진 역학의 모니터링은 몇 달 동안 연장 할 수 있기 때문에, 프로토콜의 중심 측면 중 하나는 복제 사이의 실험 설계의 일관성입니다 (모기 사육, 케이지 크기, 연령 구조 인구, 고정 방출 비율, 안정적인 혈액 식사 소스 및 최소 침습 적 선별 절차 포함).
남성 전용 방출은 남성 모기가 병원균을 전송하거나 인간에게 먹이지 못하기 때문에 이상적인 것으로 간주되므로 야생 인구에 헤아링 가능한 특성을 안전하게 도입 할 수 있습니다. 실험실 케이지 실험에서, 그것은 감소 남성 짝짓기 경쟁력 및 트랜스 유전자 통합과 관련된 다른 피트 니스 부하와 형질 균주를 감지 할 수있다. 그러나, 대형 케이지10에서 실시된 것과 같은 직접적이고 구체적인 실험은 남성의 경쟁력을 적절히 분석하기 위해 수행될 수 있을 뿐만 아니라, 여성의 특성을 보다 자연적인 모기 밀도2에서 적절히 분석할 수 있다2. 또한 케이지 시험의 경험적 데이터를 사용하여 내성 알렐 형성을 포함한 케이지 인구 역학 모델을 매개변수화하고 제안된 기술의 효과및 가능한 조정에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 정기적인 곤충 인프라 및 조건에 대한 최소한의 요구 사항과 함께 필요에 따라 다른 실험 설계에 쉽게 적응할 수 있습니다. 또한, 상업용 케이지 및 현미경을 제외하고 대부분의 재료는 저렴하며 저비용 다중 복제 및 시험 반복을 허용합니다. 특히, 이것은 또한 다중 형질 전환균이 단계적 시험 경로에서 앞으로 이동하는 최고 성능의 응시자의 우선 순위를 지정하고 최적 성능이 없는 그에 대한 테스트를 중단하기 위해 작은 케이지 시험에서 사전 심사할 수 있게 합니다.
마지막으로, 유전자 변형 유기체의 사용에 관한 관심사는 모기 매개 질병의 예방을 위한 유전 전략의 개발, 평가 및 적용을 위한 프레임워크의 정교화를 동기를 부여합니다5,8,9. 여기에 정의된 프로토콜의 관련성 및 실행은 이러한 지침과 일치합니다.
Disclosures
저자는 공개가 없습니다.
Acknowledgments
드루실라 스틸링거, 키오나 파커, 패리시 파월, 매들린 노톨리에게 모기 축산에 감사드립니다. 기금은 캘리포니아 어바인 말라리아 이니셔티브의 대학에 의해 제공되었다. AAJ는 캘리포니아 대학교 어바인의 도널드 브렌 교수입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial feeders | Hemotek | SP6W1-3 | Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs |
| Cage, commercial | BioQuip | 1450D | Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" - 0.216 m3 (60 cm3) |
| Cage tub (popcorn) | Amazon.com | VP170-0006 | 0.005 m3 (170 fl oz) |
| Dissecting microscope with fluorescence light and filters | Leica | M165FC | |
| Glue sticks | Michaels | 88646598807 | Gluesticks 40 pk, 0.4X4” |
| Hot glue gun | Woodwards Ace | 2382513 | Stanley, 40 watt, GR20 |
| Nylon screen (netting) | Joann.com | 1102912 | Tulle 108" Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2) |
| Oviposition cups | Fisher | 259126 | Beaker PP grad 50 mL |
| Razor cutting tool | Office Depot | 487899 | Box cutters |
| Scissors | Office Depot | 978561 | Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8" |
| Stapler | Office Depot | 908194 | Swingline Commercial Desk Stapler |
| Surgical sleeve (stockinette) | VWR | 56612-664 | ~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y) |
| Zip ties | Home Depot | 295715 | Pk of 100, 14” cable ties - 35.6 cm (14 in) |
References
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).
- Akbari, O. S., et al. Safeguarding gene drive experiments in the laboratory. Science. 349 (6251), 927-929 (2015).
- Benedict, M. Q., et al. Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).
- CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. (6th Edition). , Available from: http://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf 1 (2020).
- Adelman, Z., et al. Rules of the road for insect gene drive research and testing. Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).
- Long, K. C., et al. Core commitments for field trials of gene drive organisms. Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).
- Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector. Parasites Vectors. 12, 70 (2019).
