Summary
Burada bildirilen protokoller, laboratuvar içeren küçük kafes denemelerinde vektör kontrolüne yönelik genetik olarak tasarlanmış sivrisineklerin performansını değerlendirmenin üç alternatif yolunu göstermektedir. Her protokol, sivrisinek suşunun taşıdığı (gen tahriki veya gen dışı tahrik) ve ölçülen parametre türlerine özel modifikasyona göre uyarlanmıştır.
Abstract
Genetiği değiştirilmiş vektörler kullanılarak sivrisinek kaynaklı patojenlerin kontrolü, geleneksel kontrol stratejilerini tamamlamak için umut verici bir araç olarak önerilmiştir. CRISPR tabanlı homing gen tahrik sistemleri transgenik teknolojileri bilim camiasında daha erişilebilir hale getirmiştir. Transgenik sivrisinek performansının değerlendirilmesi ve küçük laboratuvar kafes denemelerinde vahşi tip meslektaşları ile karşılaştırmalar, hastalık önleme stratejilerini iyileştirmek için sonraki alan kafesi deneylerinin ve deneysel değerlendirmelerin tasarımı için değerli veriler sağlar. Burada, sıtma anopheline sivrisinek vektörlerinde transgene yayılımını değerlendirmek için laboratuvar ortamlarında kullanılan üç farklı protokol sunuyoruz. Bunlar arasında inundative releases (gen tahrik sistemi yok) ve gen-sürücü örtüşen ve örtüşmeyen nesil denemeleri bulunur. Üç deneme bir dizi parametreye göre değişir ve istenen deneysel ayarlara uyarlanabilir. Ayrıca, küçük kafeslerdeki böcek çalışmaları, mühendislik böceklerinin laboratuvardan açık alan salınımlarına aşamalı geçişinin bir parçasıdır. Bu nedenle, burada açıklanan protokoller, sıtma eliminasyonu için yeni teknolojilerin sahada uygulanmasına yardımcı olacak ampirik değerler sağlamak için paha biçilmez araçları temsil eder.
Introduction
Sıtmaya neden olanlar gibi vektör kaynaklı patojenlerin bulaşmasını kontrol etmek için genetik olarak tasarlanmış sivrisineklere dayalı stratejiler takip edilmektedir1. Bunlar arasında , Anopheles sivrisineklerinin sayılarını ve yoğunluklarını azaltmayı amaçlayan teknolojiler (popülasyon bastırma) veya 2) vektörlerin patojen iletimini önleyen efektör genleri ifade etmek için tasarlandığı insan hastalığından sorumlu parazitleri (popülasyon modifikasyonu, değiştirilmesi veya değiştirilmesi) iletme yeteneğini bozmayı amaçlayan teknolojiler yer almaktadır. Bu genetik yaklaşımlar CRISPR/Cas9 tabanlı gen tahriklerinin ortaya çıkmasıyla desteklenmiştir, parazit ileten sivrisineklerde yük özelliklerinin etkili bir şekilde yayılmasında ve kafesli popülasyonlarda anti-parazitik efektör moleküllerde kavram kanıtı ile desteklenmiştir.
Küçük laboratuvar kafes denemeleri, transgenik suşların özelliklerini, saha uygulamalarına yönelik daha fazla gelişimlerine yönelik aşamalı bir yaklaşımın bir parçası olarak değerlendirmek için ilk adımı temsil eder2. Spesifik sonuç değerlendirmeleri arasında, tanıtılan DNA'nın rekabet ortamında heritability, fenotipin penetrance ve ekspresyitesi ve stabilitesi sayılıyor. İlgili deneysel tasarım özellikleri arasında kafeslerin büyüklüğü, sivrisinek yoğunlukları, çoğaltma sayısı, örtüşen veya örtüşmeyen nesiller, yaş yapılandırılmış hedef popülasyonları, mühendislik suşlarının tek veya çoklu salınımları, sadece erkeklere özel, sadece kadın veya karma cinsiyet salınımları, salınım oranları, kan unu kaynakları (yapay veya canlı hayvan) ve tarama prosedürleri yer almaktadır.
Burada, anopheline sivrisineklerinin inundative salınımlar (gen tahrik sistemi yok) ve Cas9 endonucleases tarafından aracılık edilen otonom gen tahrik sistemlerini taşıyan ve RNA'lara (gRNA) rehberlik eden suşlarını değerlendirmek için kullanılan protokolleri açıklıyoruz. Bu protokollerin uygulamaları Pham ve ark. (2019) 2, Carballar-Lejarazú ve diğerleri. (2020) 3 ve Adolfi ve diğerleri. (2020) 4.
İnundative salınım denemeleri, çok sayıda transgenik sivrisineğin vahşi bir popülasyona birden fazla salınımını takiben Mendelian mirası altında tasarlanmış bir transjenin yayılma hızını değerlendirir. Transjenin bir tahrik sistemine bağlanması olmadan, inundative release denemelerinden elde edilen veriler, stabilize edilmiş bir popülasyondaki ilgi transgenesinin zindeliği ve dinamiği hakkında bilgi sağlar.
Sivrisinek popülasyonları otonom bir gen tahrik sistemi içerdiğinde, transgene'in tek bir girişinden sonra baskın belirteç artış oranını belirleyerek istenen transjenin yayılma dinamiklerini değerlendirmek için küçük kafes denemeleri tasarlanmıştır. Otonom gen tahrik elemanları, Cas9 çekirdeğini, gRNA'yı ve baskın işaretleyiciyi sonraki nesillerde aktif olacak şekilde kodlayan genleri taşır.
'Örtüşen' nesiller, yaş yapılandırılmış bir sürekli popülasyon oluşturmak için aynı kafeste birden fazla neslin aynı anda varlığını ifade ederken, 'örtüşmeyen' her ardışık kafesli popülasyonda tek ayrı nesilleri ifade eder2. Gen tahrikli kafes deneyleri, tahrik (dönüşüm) oranının ilk dinamikleri belirlenebildiğinde sonlandırılabilir (yapıya bağlı olarak 8-10 nesil) ve sivrisinek popülasyonu içindeki transjenin kısa vadeli stabilitesi hakkında bilgi sağlarken, baskın işaretleyici frekansları tam girişe ulaştığında veya yakınsa (gen tahrik sisteminin en az bir kopyasını taşıyan her sivrisinek) ne olduğunu ortaya ortaya atamayabilirler.
Protocol
Hayvan etiği beyanı
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. Protokoller Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmıştır (Hayvan Refahı Güvence Numaraları A3416.01).
1. Gensiz tahrik sivrisinekleri üzerinde inundative salınım denemeleri (Şekil 1)
- Kafes kurulumu ve bakımı
- Art arda üç hafta boyunca her kafese 60 ikinci instar vahşi tip (WT) larva ekleyerek üç set üç üçlik 0.216 m3 kafes kurun.
NOT: İkinci instar larvaların cinsiyetini ışık mikroskopisi ile belirlemek mümkün değildir, bu nedenle her kafese eklenen örnekler hem erkeklerden hem de dişilerden oluşacaktır. - Her hafta, yetişkin dişilere kan unu kaynağı olarak anestezi edilmiş fareler (Şekil 2A) ve kan unu sonrası 3 gün sonra bir yumurtlama kabı sağlayın.
NOT: Alternatif bir yapay besleme aparatı kullanılabilirken, kan değerleri için canlı uyuşturuldu fareler sağlamak, bu büyük (0.216 m3) kafes formatlarında daha iyi sivrisinek besleme performansı sağlar. Bu, onaylanmış bir hayvan kullanım protokolü ve farelerin kullanımı için ilgili (örneğin, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, IACUC) onayı gerektirir.
NOT: Bireysel fareler 4 mg / fare ketamin HCl ve 0.4 mg / fare ksilazinin karışımı ile uyuşturulur. Hayvanlara bu karışımın 0.1 - 0.5 mL arasında enjekte edilir. - Her kafesten haftalık yumurtaları yumurtadan çıkar ve mortaliteyi dengelemek için kendi kafeslerine geri dönmek için rastgele 60 ikinci instar (L2) larva seçin (hafta 4-8).
NOT: Kafeslerde 'başlangıç aşaması' olarak adlandırılan istikrarlı ve dağıtılmış bir yaş yapılandırılmış popülasyon oluşturmak için 1.1.1 ile 1.1.3 arası adımlar gereklidir. - 9. haftada, istenen erkek salınım oranının serbest bırakılması için 1.1.1 adımında rastgele üç taraflı olarak monte edilen kafesleri atayın.
- Deney boyunca tutarlılığı değerlendirmek için kontrol olarak bir üçlü kafes kümesi belirleyin.
- İstenen her salınım oranı için bir üçlü ayar seti belirleyin (örneğin, 1:1 veya 1:0.1 transgenik:WT erkekler).
NOT: Bu nokta 'Deneysel Faz' olarak adlandırılır.
- Art arda üç hafta boyunca her kafese 60 ikinci instar vahşi tip (WT) larva ekleyerek üç set üç üçlik 0.216 m3 kafes kurun.
- Çoğaltma ve serbest bırakma oranları
- Kontrol kafeslerine haftalık 60 WT pupa (30 erkek ve 30 kadın) ekleyin.
- 1:1 oranını korumak için, her bir kafese haftalık 30 transgenik erkek pupası ve 60 (30 erkek ve 30 kadın) WT pupa ekleyin.
- 1:0.1 oranını korumak için, her bir kafese haftalık 300 transgenik erkek pupası ve 60 (30 erkek ve 30 kadın) WT pupa ekleyin.
NOT: Kafeslere yabani sivrisineklerin sürekli eklenmesi, yaşa bağlı yetişkin ölümleri nedeniyle haftalık olarak azalması beklenen kafes yoğunluğunu korur.
- Fenotiplerin taranır
- Rastgele her kafesten toplam 300 larva seçin. Floresan filtrelerle donatılmış bir stereo mikroskop kullanımı ile larva ve pupal aşamalarında floresan baskın belirtecin ekspresyöneti için ekran ve elde eden yetişkinlerin cinsiyetini puanlamak (Şekil 3).
NOT: Fenotipik tarama, sivrisineklere entegre transgene yapısında bulunan baskın işaretleyiciye bağlı olacaktır (örneğin, Discosoma sp. kırmızı floresan protein [DsRed], siyan floresan protein [CFP], yeşil floresan protein [GFP]) ve ifadesini yönlendiren organizatörde (sivrisinek transgenezinde en çok kullanılan, gözlerde ve sinir kordonunda 3xP3 promotör sürüş ifadesidir). - Deneysel tasarımda tanımlanan sonuç parametrelerinin gerektirdiği kadar nesil boyunca bu protokolü izleyin.
NOT: Deneme genellikle tüm sivrisineklerde transjenin en az bir kopyası olduğunda (baskın floresan işaretleyicinin varlığına göre belirlenir) veya bir kafesteki transgenik-WT sivrisineklerinin oranı stabilize edildiğinde ve birkaç (3-5) nesilden sonra büyük ölçüde dalgalanmadığında sonlandırılır.
- Rastgele her kafesten toplam 300 larva seçin. Floresan filtrelerle donatılmış bir stereo mikroskop kullanımı ile larva ve pupal aşamalarında floresan baskın belirtecin ekspresyöneti için ekran ve elde eden yetişkinlerin cinsiyetini puanlamak (Şekil 3).
2. Gen tahrikli sivrisineklerin örtüşen nesil denemeleri (Şekil 4)
NOT: Gen tahrik sistemleri taşıyan sivrisinekler yazılı ve gözden geçirilmiş protokoller gerektirir ve gerektiğinde Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) veya eşdeğeri ve diğerleri tarafından onaylanmalıdır. Sivrisinek muhafazası (ACL 2+ seviyesi) önerilen prosedürleri izlemelidir5,6,7. Özellikle, gen tahrik deneyleri iki sıkı hapsetme stratejisi kullanmalıdır. Birincisi genellikle organizmalar ve çevre arasındaki fiziksel engellerdir (Bariyer Stratejisi). Bu, sivrisineklerin kaçamamasını sağlamak için güvenli bir böcek ve standart çalışma prosedürlerine (izleme dahil) sahip olmayı gerektirir. İkinci hapsetme stratejisi Moleküler, Ekolojik veya Üreme5 olabilir.
- Kafes kurulumu
- İstenen her transgenik:WT erkek salınım oranı için iki set triplikat 0.216 m3 kafes kurun.
- 1:1 erkek salınım oranı elde etmek için, her bir kopya kafese pupa aşamasında 120 transgenik erkek, 120 WT erkek ve 120 WT dişi ekleyin.
- 1:10'luk bir salınım oranı elde etmek için, her bir çoğaltma kafesine pupa aşamasında 12 transgenik erkek, 120 WT erkek ve 120 WT dişi ekleyin.
NOT: Farklı salınım oranları test edilebilir (1:1, 1:3, 1:10, vb.) ve deneyleri başlatmak için kullanılan sivrisineklerin sayısı buna göre değişir. Bununla birlikte, düşük sayıların verilerin istatistiksel değerlendirmesi üzerindeki etkilerini göz önünde bulundurmak önemlidir.
- İstenen her transgenik:WT erkek salınım oranı için iki set triplikat 0.216 m3 kafes kurun.
- Nüfus bakımı ve taraması
- Her kafeste 4-7 günlük dişilere uyuşturuldulu fareler kullanarak bir kan unu sağlayın (Şekil 2A).
- Kan yemeğinden üç gün sonra, her kafese bir yumurtlama kabı yerleştirin.
- Yumurtaları bir larva tepsisinde yumurtadan çıkar, her kafesten rastgele ~240 ilk başlangıç (L1) larvasını seçin, yetişkinliğe kadar yetiştirin ve kendi kafeslerine geri döndürün.
- 2.2.1. adımda açıklandığı gibi, yeni ortaya çıkan yetişkinler için her 3-4 günde bir ek (2-3) kan yemeği sağlayın.
NOT: Sonraki nesillerin hiçbirinde ek transgenik erkek eklenmez. - Her kafesten rastgele toplam 300 larva seçin ve floresan stereo mikroskop kullanarak larva ve pupal aşamalarında baskın belirteç fenotipinin varlığını tarayın ve seks için ortaya çıkan yetişkinleri puanlayın (Şekil 3).
NOT: Daha önce olduğu gibi, fenotipik tarama gen tahrik sistemine dahil edilen ve transgenik sivrisineklere (örneğin, DsRed, CFP veya GFP) entegre edilen baskın işaretleyiciye ve promotöre bağlı olacaktır. Hedeflenen genlerin homozigot veya heteroallik bozulmaları görünür bir fenotiple (örneğin, göz pigmentasyonu ile ilgili genler) sonuçlanırsa, bu özelliğin taranması, değiştirilen fenotipi görselleştirmenin en kolay olduğu aşamaya bağlı olacaktır. - Deneysel tasarımda tanımlanan sonuç parametrelerinin gerektirdiği kadar nesil boyunca bu protokolü izleyin.
NOT: Her nesil (kan unu ile sınırlandırılmış) ~ üç hafta sürer. Deneme genellikle tüm sivrisinekler gen tahrik yapısı için homozigöz olarak kabul edildiğinde veya popülasyonlar gen tahrikli yapının en az bir kopyasını taşıyan sivrisineklerin maksimum yüzdesinde stabilize edildiğinde sona erer.
3. Gen tahrikli sivrisineklerin örtüşmeyen nesil denemeleri (Şekil 5).
- Kafes kurulumu
- Araştırılacak transgeniklerin WT erkeklerine her bir spesifik salınım oranı için üç taraflı 0.005 m3 kafes popülasyonları ayarlayın (örneğin, her biri 1:1, 1:3, 1:10 serbest bırakma oranlarıyla kurulan üç üç üçlik kafes seti). Tüm kafesleri eşit sayıda erkek ve dişi ile kurun.
NOT: Ek Dosya , 0.005 m3 koloni kafesinin yapımını gösteren bir videodur.- 1:1 erkek salınım oranı elde etmek için üç çoğaltma kafesinin her birine 50 transgenik erkek, 50 WT erkek ve 100 WT dişi ekleyin.
- 1:3 erkek salınım oranı elde etmek için üç çoğaltma kafesinin her birine 25 transgenik erkek, 75 WT erkek ve 100 WT dişi ekleyin.
- 1:10 erkek salınım oranı elde etmek için üç çoğaltma kafesinin her birine 9 transgenik erkek, 90 WT erkek ve 100 WT dişi ekleyin.
NOT: Farklı salınım oranları test edilebilir ve deneyleri başlatmak için kullanılan sivrisineklerin sayısı buna göre değişebilir. Bununla birlikte, düşük sayıda sivrisineklerin istatistiksel analizler üzerindeki etkisini göz önünde bulundurmak önemlidir. Bunlar tek sürümlerdir; sonraki nesillerde ek transgenik erkek eklenmez.
- Araştırılacak transgeniklerin WT erkeklerine her bir spesifik salınım oranı için üç taraflı 0.005 m3 kafes popülasyonları ayarlayın (örneğin, her biri 1:1, 1:3, 1:10 serbest bırakma oranlarıyla kurulan üç üç üçlik kafes seti). Tüm kafesleri eşit sayıda erkek ve dişi ile kurun.
- Nüfus bakımı ve taraması
- Her kafesteki 4-7 günlük dişilere art arda iki gün boyunca yapay bir beslenme aparatı (Şekil 2B) kullanarak kan yemekleri sağlayın.
NOT: Kadınlar için rutin kan yemekleri, bir besleme cihazından sağlanan ticari olarak mevcut bir kan kaynağından (örneğin, baldır kanı) oluşur. Canlı uyuşturuluz fareler, daha iyi beslenme performansı için sadece daha büyük (0.216 m3) kafes formatlarında kan metriyalleri sağlamak için kullanılır. - İkinci kan unu 3 gün sonra bir yumurtlama kabı ekleyin. Üç gün sonra, yumurtlama kaplarını çıkarın.
NOT: Bu adımda, her kafesten rastgele 5-10 kadın seçilebilir ve gerekirse doğurganlık ve doğurganlık gibi ek fitness parametrelerini değerlendirmek için şişelere ayrı ayrı yerlenebilir. - Kafeste kalan tüm yetişkinleri (ölü ve diri) cinsiyete göre puanlayın ve moleküler analiz için -80 °C'de saklayın.
- Yumurtaları yumurtadan çıkar ve yeni nesil için yeni kafesleri doldurmak için 1:1 ve 1:3 oranlı kafeslerden rastgele 200 L1 larva seçin.
NOT: 1:10 oranlı kafeslerde transgenik bireye başlama sıklığının düşüklüğü nedeniyle, rastgele örnekleme, popülasyonu devam ettirmek için gelecek nesilde aşırı transgenik soy kaybına yol açabilir. - 1:10 kafesleri ve yeterli sayıda transgenik sivrisinek için doğru bir örnekleme sağlamak için, baskın işaretleyici için tüm larvaları tarayın ve yeni kafesleri doldurmak için gözlemlenen transgene frekansını yansıtan 200 larva seçin.
NOT: 1:10 kafesler% 80'≥ transgene frekansa ulaştıklarında 1:1 ve 1:3 kafesleriyle aynı şekilde tutulabilir. - Derinlemesine bir analiz için her kafesten rastgele 500 larva seçin. Larva ve pupal evrelerinde beklenen belirteç fenotipleri için floresan stereo mikroskop altında tarama yapın ve yetişkinlerin seks puanını (Şekil 3).
NOT: Dirençli alele oluşumunu izlemek için moleküler olarak daha fazla çaprazlanacak ve analiz edilecek 'olağanüstü' fenotipler seçilebilir. - Bu protokol, deneysel tasarımda tanımlanan sonuç parametrelerinin gerektirdiği kadar nesil boyunca takip edilebilir.
NOT: Her nesil kan kütlü tarafından sınırlandırılmıştır ve ~ üç hafta sürer. Deneme genellikle tüm sivrisinekler gen tahrik yapısı için homozigöz olarak kabul edildiğinde veya popülasyonlar transgenik sivrisineklerin maksimum yaygınlığında stabilize edildiğinde sona erer. Ve daha önce olduğu gibi, fenotip taraması transgenik sivrisineklere (örneğin, DsRed, CFP, GFP) veya görünür bir fenotip (örneğin, göz pigmentasyonu ile ilgili genler) sundukları takdirde hedeflenen genlere entegre edilen baskın belirteçlere ve promotöre bağlı olacaktır.
- Her kafesteki 4-7 günlük dişilere art arda iki gün boyunca yapay bir beslenme aparatı (Şekil 2B) kullanarak kan yemekleri sağlayın.
Representative Results
Gen dışı tahrik veya otonom gen tahriki modifikasyonları taşımak için üretilen transgenik anopheline sivrisinekleri, Protokoller bölümünde açıklandığı gibi kafes denemeleri için ayarlanır. Burada gösterilen temsili sonuçlar, Pham ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilen kafes denemeleri deneylerinin en iyi performans gösteren kopyalarının fenotip dinamiklerini tasvir eder. (2019) Anopheles stephensi sivrisinekleri için 2. Üç deneme (sırasıyla 1 - 3: inundative non-gen drive, çakışan gen tahriki ve örtüşmeyen gen tahriki), kafesin büyüklüğü (0.216 m3 vs 0.005 m3), hedef popülasyonun yaş yapılandırılmış olup olmadığı, kan unu kaynağı (fareler veya yapay besleyici) ve serbest bırakma oranları gibi farklı parametrelerde farklı parametrelerde değişti. Temsil aracı olarak Şekil 6, yedi nesil boyunca kullanılan üç protokol için de aynı sürüm oranından (1:1) seçilen gözlemlenen verileri görüntüler.
1:1 sürücüsüz sürüm, 6-7 nesil içinde %80'> transgene girişe ulaşır. Gen tahrikli transgenik kafes denemeleri için, hem örtüşmeyen hem de örtüşen protokollerdeki 1:1 sürümleri 3-4 nesil içinde bu seviyeye ulaşır, böylece bir gen tahrik sisteminin tek bir salınımının transgene giriş için sürücü olmayan inundative sürümlerden daha verimli olabileceği beklentisini doğrular. Daha hızlı yörünge, eğilim çizgilerinin eğimi ile de doğrulanabilir. Her iki gen tahrik protokolü de, farklı kurulumlara rağmen, benzer açılar ve eğim eğilimleri sunar. Gözlem sonunda, tahriksiz kafesler transgene taşıyan bireylerin ~% 80'ini elde ederken, gen tahrikli bireylere sahip kafesler tam (veya neredeyse tam) girişe ulaşır. Burada açıklanan protokolleri kullanarak bireysel deney sonuçlarına ilişkin tam veri ve işleme ayrıntıları Pham ve ark. 'ın Şekil 1-3'lerinde bulunabilir. (2019) 2, Şekil 2-3 Carballar-Lejarazú ve diğerleri. (2020) Adolfi ve ark.'ın 3 ve Şekil 3'ün. (2020) 4.
Şekil 1. Sürücüsüz sürüm deneme şeması. Her birine eklenen 60 vahşi tip ikinci instar (karışık cinsiyet) larva ile dokuz 0.216 m3 kafes kurulur. 3. haftadan itibaren, dişilere haftalık kan metrik bir yardım verilir ve yumurtalar toplanır ve yumurtadan çıkar. 8. haftaya kadar, 60 larva rastgele seçilir ve kafeslerde yaş yapılandırılmış bir popülasyon oluşturmak için haftalık olarak kendi kafeslerine geri döner (ilk aşama). 9. haftadan itibaren, dokuz kafes transgenik:vahşi tip erkek salınım oranlarına (deneysel faz) göre rastgele üç taraflı olarak atanır. Kafes A (Kontrol) transgenik pupa eklenmez. Dişilere haftalık kan sineği verilir ve yumurtalar toplanır, yumurtadan çıkar ve pupalara yetiştirilir. 30 erkek ve 30 dişi yabani tip pupa kafeslerine geri eklenir. Kafes 1:1'e ilave 30 transgenik erkek pupası eklenmez. Kafes 1:0.1 ek 300 transgenik erkek pupası eklenmez. 9 kafesin her birinden 300 larva rastgele seçilir ve floresan işaretleyici için taranır. Bu prosedür transgene fiksasyonuna kadar haftalık olarak tekrarlandı (transgenik-wildtype sivrisineklerin birkaç nesil sonra stabilize oranı). Pham ve ark.'dan uyarlanmıştır. (2019) 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Kafes popülasyonlarının kan beslemesi. (A) Uyuşturuldu fareler veya (B) Hemotek kan besleyiciler, sırasıyla 0.216 m3 kafeslerde veya küçük 0.005 m3 kafeslerde dişi sivrisinekleri kan beslemek için sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Sürücüsüz, çakışan gen tahrikli ve örtüşmeyen gen tahrikli kafes denemeleri için fenotiplerin taranması. Transgenik veya vahşi tip fenotiplerin larva, pupa ve yetişkininin floresan görüntüleri. Bu örnekte, An. stephensi bireyleri, gözlerdeki 3xP3 promotörü (DsRed+ veya DsRed-) tarafından yönlendirilen DsRed işaretleyicisi için tarandı, üç aşamada da görülebilir ve yetişkinler seks için tarandı ( ♀ veya ♂ ). Midgut'taki yiyecek bolus ile ilişkili vahşi tip larvalarda arka plan floresansına dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Çakışan gen sürücü kafesi deneme şeması. Gen tahriki:vahşi tip erkek salınım oranlarına göre altı 0.216 m3 kafes üç taraflı olarak kurulur. Her kafese 120 vahşi tip erkek ve 120 vahşi tip dişi eklendi. 1:1 gen tahrikli erkek salınım oranına sahip kafeslere ek 120 transgenik erkek eklendi. 1:10 erkek salınım oranına sahip kafeslere ek 12 transgenik erkek eklendi. Transjenin tam tanıtımına kadar, her 3 haftada bir, yetişkin kadınlara kan metriyalleri sağlanır ve yumurtalar toplanır ve yumurtadan çıkar. Toplam 240 larva rastgele seçildi ve kendi kafeslerine geri döndü. Üç yüz (300) larva rastgele seçilir ve baskın işaretleyici için taranır. Daha sonra göz rengi ve seks için pupa ve yetişkinler olarak taranırlar. Orijinal kafeslere ek transgenik erkek eklenmez. Pham ve ark.'dan uyarlanmıştır. (2019) 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Örtüşmeyen gen sürücü kafesi deneme şeması. Gen tahriki:vahşi tip erkek salınım oranlarına göre dokuz küçük 0.005 m3 kafes üç taraflı olarak kurulur. 1:1 erkek salınım oranına sahip kafeslerde 100 vahşi tip dişi, 50 vahşi tip erkek ve 50 gen sürücü erkek ilavesi vardır. 1:3 erkek salınım oranına sahip kafeslerde 100 vahşi tip dişi, 75 vahşi tip erkek ve 25 gen sürücü erkek ilavesi vardır. Kafesler 1:10 erkek salınım oranı 100 vahşi tip dişi, 90 vahşi tip erkek ve 9 gen sürücü erkek ekledi. Dişilere kan unu ve yumurtaların toplanıp yumurtadan çıkması sağlanır. 1:1 ve 1:3 kafesleri için, 200 larva rastgele seçilir ve yeni nesiller için ebeveynlerinden ayrı olarak yeni kafesleri doldurmak için kullanılır. Ek 500 larva rastgele seçilir ve baskın belirteç geni için tarandıklarında pupalara yetiştirilir. 500 pupa daha sonra yetişkinlere yetiştirilir ve seks tarafından puanlanır. Kalan tüm larvalar işaretleyici için taranır. 1:10 kafesleri için, tüm larvalar nesiller halinde puanlanır 1-12 ve mevcut transgene frekansını yansıtan 200 larva yeni kafesleri doldurmak için kullanılır. 13. nesilden başlayarak, bu kafesler 1:1 ve 1:3 kafesleriyle aynı şekilde kurulur. Pham ve ark.'dan uyarlanmıştır. (2019) 2 ve Carballar-Lejarazú ve diğerleri. (2020) 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Farklı popülasyon değiştirme kafesi denemeleri için öngörülen transgene fiksasyon dinamikleri. Pham ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilen kafes denemeleri deneylerinin her biri için en iyi performans gösteren kopyaların beklenen fenotip dinamiklerinin temsili. (2019) 2, 7 nesilden fazla izlendi. Deneme kurulumları Protokoller'de açıklanmıştır. Tahminler, 1:1 sürüm modellerindeki 9 deneyin tümünden elde edilen verilere dayanmaktadır (üç farklı kafes deneme protokolünün her biri için üç taraflı çoğaltma). X ekseni ilk giriş sonrası nesil numarasıdır ve Y ekseni zaman içinde DsRed işaretleyici fenotipini (DsRed+) gösteren larvaların oranıdır. Kesikli çizgiler, verilerin doğrusal eğilim çizgilerini temsil eder. DsRed+ fenotipi, değiştirilmiş alelenin en az bir kopyasına sahip olmaktan kaynaklanır. Bu nedenle sonuçlar, gen tahrik sisteminde hızlandırılmış transjenin yayılmasını yansıtır ve gözlemin sonunda tam girişe ulaşır. Çoğaltmalar ve deneylerle ilgili tam ayrıntılı veriler arasındaki değişkenlik için lütfen Pham ve ark. 'a bakın. (2019) 2, Carballar-Lejarazú R ve ark. (2020)3 ve Adolfi A ve ark. (2020)4. Pham TB ve ark. (2019) Sıtma vektör sivrisinek , Anopheles stephensi deneysel popülasyon modifikasyonu uyarlanmış görüntüler. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A ve ark. (2020) Sıtma sivrisinek Anopheles stephensi verimli nüfus modifikasyonu gen sürücü kurtarma sistemi. Nat Komün 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 ve Carballar-Lejarazú R ve ark. (2020) Sıtma vektör sivrisinek, Anopheles gambiae popülasyon modifikasyonu için yeni nesil gen sürücü. Proc Natl Acad Sci ABD 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya: 0.005 m3 koloni kafesinin yapımı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Patojen engelleme yeteneğine sahip veya sterilite genleri taşıyan genetik olarak tasarlanmış sivrisinekler vektör kaynaklı hastalıkları kontrol etmek için yeni araçlar oluşturur. Bu alternatif yaklaşımları oluşturan parametrelerin çokluğu göz önüne alındığında, araştırmalarında kritik bir adım, kontrol amacıyla sentetik bir transgene salınımının potansiyel sonuçlarının hızlı ve güvenli bir şekilde tahminini sağlayan laboratuvar sınırlı deneysel değerlendirmelerden oluşur1.
Kafesli popülasyonlardaki transgene dinamiklerinin izlenmesi birkaç ay boyunca uzayabildiğinden, protokollerin merkezi yönlerinden biri, çoğaltmalar arasındaki deneysel tasarımdaki tutarlılıktır (sivrisinek yetiştirme, kafes büyüklüğü, yaş yapılandırılmış popülasyonlar, sabit salınım oranları, istikrarlı kan unu kaynakları ve minimal invaziv tarama prosedürleri dahil).
Sadece erkek salınımlar ideal olarak kabul edilir, çünkü erkek sivrisinekler ne patojenleri iletir ne de insanları besler, bu nedenle vahşi popülasyonlara kalıtsal özellikleri güvenle sokabilirler. Laboratuvar kafesi deneylerinde, erkek çiftleşme rekabet gücünün azalması ve transgene entegrasyonu ile ilişkili diğer fitness yükleri ile transgenik suşları tespit etmek mümkündür. Bununla birlikte, büyük kafeslerde yapılanlar gibi doğrudan ve spesifik deneyler10, erkek rekabet gücünün yanı sıra daha doğal sivrisinek yoğunluklarında kadın doğurganlığını düzgün bir şekilde analiz etmek için yapılabilir2. Ayrıca, kafes denemelerinden elde edilen ampirik veriler, dirençli alele oluşumu da dahil olmak üzere kafes popülasyonu dinamiklerinin modellerini parametreleştirmek ve önerilen teknolojideki etkinlik ve olası ayarlamalar hakkında yararlı bilgiler sağlamak için kullanılabilir.
Burada açıklanan protokoller, düzenli böcek altyapısı ve koşulları ile ilgili minimum gereksinimlerle, gerektiğinde diğer deneysel tasarımlara kolayca uyarlanabilir. Ek olarak, ticari kafesler ve mikroskoplar hariç, malzemelerin çoğu ucuzdur ve denemelerin düşük maliyetli çoklu çoğaltmalarına ve tekrarlarına izin verir. Özellikle, bu aynı zamanda en iyi performans gösteren adayların aşamalı test yolunda ileriye taşınmasına öncelik vermek ve en uygun performansı gösterenler üzerinde testleri askıya almak için küçük kafes denemelerinde birden fazla transgenik suşun ön taramaya alınmasını sağlar.
Son olarak, genetiği değiştirilmiş organizmaların kullanımına ilişkin endişe, sivrisinek kaynaklı hastalıkların önlenmesi için genetik stratejilerin geliştirilmesi, değerlendirilmesi ve uygulanması için çerçevelerin detaylandırılmasını motive eder5,8,9. Burada tanımlanan protokollerin ilgisi ve yürütülmesi bu yönergelerle tutarlıdır.
Disclosures
Yazarların hiçbir açıklaması yok.
Acknowledgments
Sivrisinek hayvancılığı için Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell ve Madeline Nottoli'ye minnettarız. Finansman Kaliforniya Üniversitesi Irvine Sıtma Girişimi tarafından sağlandı. AAJ, Irvine Kaliforniya Üniversitesi'nde Donald Bren Profesörüdür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial feeders | Hemotek | SP6W1-3 | Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs |
| Cage, commercial | BioQuip | 1450D | Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" - 0.216 m3 (60 cm3) |
| Cage tub (popcorn) | Amazon.com | VP170-0006 | 0.005 m3 (170 fl oz) |
| Dissecting microscope with fluorescence light and filters | Leica | M165FC | |
| Glue sticks | Michaels | 88646598807 | Gluesticks 40 pk, 0.4X4” |
| Hot glue gun | Woodwards Ace | 2382513 | Stanley, 40 watt, GR20 |
| Nylon screen (netting) | Joann.com | 1102912 | Tulle 108" Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2) |
| Oviposition cups | Fisher | 259126 | Beaker PP grad 50 mL |
| Razor cutting tool | Office Depot | 487899 | Box cutters |
| Scissors | Office Depot | 978561 | Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8" |
| Stapler | Office Depot | 908194 | Swingline Commercial Desk Stapler |
| Surgical sleeve (stockinette) | VWR | 56612-664 | ~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y) |
| Zip ties | Home Depot | 295715 | Pk of 100, 14” cable ties - 35.6 cm (14 in) |
References
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).
- Akbari, O. S., et al. Safeguarding gene drive experiments in the laboratory. Science. 349 (6251), 927-929 (2015).
- Benedict, M. Q., et al. Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).
- CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. (6th Edition). , Available from: http://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf 1 (2020).
- Adelman, Z., et al. Rules of the road for insect gene drive research and testing. Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).
- Long, K. C., et al. Core commitments for field trials of gene drive organisms. Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).
- Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector. Parasites Vectors. 12, 70 (2019).
