Summary
显微注射技术对于将外源基因引入蚊子的基因组至关重要。该协议解释了詹姆斯实验室使用的一种方法，该方法将DNA构建体微注射到 冈比亚按蚊 胚胎中以产生转化的蚊子。
Abstract
胚胎显微注射技术对于许多昆虫物种的分子和遗传学研究至关重要。它们提供了一种以稳定和可遗传的方式将编码感兴趣基因的外源DNA片段以及有利性状引入昆虫种系的方法。由此产生的转基因菌株可以研究由整合DNA的表达引起的表型变化，以回答基本问题或用于实际应用。虽然该技术很简单，但它需要调查人员的耐心和实践，以实现最大化效率的技能水平。这里展示的是一种对非洲疟疾蚊子冈 比亚按蚊胚胎进行显微注射的方法。目标是通过显微注射外源DNA递送到胚胎中，以便它可以在发育中的种系（极点）细胞中被吸收。转座酶、整合酶、重组酶或其他核酸酶（例如CRISPR相关蛋白，Cas）的注射DNA的表达可以触发导致其共价插入染色体的事件。由这些技术产生的转基因 冈比亚锥虫 已被用于免疫系统成分，参与血液喂养的基因和嗅觉系统元素的基础研究。此外，这些技术已被用于生产 冈比亚锥虫 菌株，其性状可能有助于控制疟疾寄生虫的传播。
Introduction
自20世纪初以来，显微注射技术已被用于实验性地操纵生物体1。显微注射已用于研究基本生物学功能和/或在所需生物体的生物学中引入重要变化。显微注射技术一直受到载体生物学家的特别兴趣，并已被广泛用于操纵载体基因组2-11。节肢动物载体中的转基因实验通常旨在通过实施降低载体适应性或增加对它们传播的病原体的难治性的改变来降低载体传播病原体的效率。蚊子传播多种人类病原体，对全世界的发病率和死亡率产生重大影响。蚊子的按蚊属传播人类疟疾寄生虫病原体疟原虫属。按蚊的基因工程实验旨在更好地了解这些蚊子的生物学并降低其媒介能力，以制定新的疟疾消除策略。
全世界疟疾感染最多的蚊媒位于 冈比亚按蚊 物种群中。然而，大多数成功的转基因实验都是在印度次大陆的疟疾病媒 按蚊斯蒂芬西上进行的。虽然存在大量实验室适应的 冈比亚按蚊 菌株，但文献中报道的转基因 冈比亚按蚊属 系的数量与 按蚊斯蒂芬西的菌株无法相比。据认为， 冈比亚按蚊 胚胎比 按蚊更难注射并实现成功的转基因，尽管这些差异的原因尚不清楚。该协议描述了一种已被证明通过显微注射实现 冈比亚按蚊 胚胎转基因遗传的方法。该协议基于Hervé Bossin和Mark Benedict12 先前开发的方法，并添加了一些额外的细节和更改，这些细节和更改已被发现可以提高转基因的效率。
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Protocol
1. 准备蚊子进行显微注射
- 在13（~5000厘米3）的笼子里播种，其中约100只雄性和200-300只雌性1-2天成虫，并让它们交配2天。
- 交配期过后，根据昆虫实践，使用2毫升带有人工喂养装置的血液或活麻醉动物为蚊子提供血粉14。第二天为蚊子提供第二份血餐，以确保所有交配的雌性都有机会进食，并且部分喂养的蚊子已经完全充血。
- 在第二次血粉后2-4天利用蚊子进行胚胎收集。
注意：幼虫营养对成虫健壮和生殖健康很重要。请参阅Benedict等人（2020）以获取有关如何饲养健康昆虫的信息14。当蚊子在人工饲养器或活体麻醉动物上喂食时，没有观察到产卵的显着差异。使用昆虫中冈 比亚按蚊 常规使用的任何方法。
2. 胚胎制备
- 使用吸气器将20-30名女性置于透明的50 mL锥形管中，该锥形管已被切割（用带锯）在两端打开，一端覆盖乳胶牙科薄膜，另一端覆盖尼龙网和滤纸（图1）。
注意：蚊子会将卵沉积在滤纸上，尼龙网会将滤纸牢固地固定在适当的位置。蚊子卵呈圆柱形，长度约为500μm，最宽处直径约为200μm，前端和后端逐渐变细（图2）。 - 将充满蚊子的管子放入装有双蒸馏水（ddH2O）的小（60 mm x 15 mm）培养皿中。将管和培养皿置于28°C的培养箱中45分钟（图3）。
- 从培养箱中取出试管，然后将试管插入空笼中。轻轻敲击管子，让蚊子飞出，一旦所有蚊子飞出，就将管子从笼子里取出。
- 当管子没有蚊子时，拧下底圈，取下尼龙，然后用镊子小心地从管子中取出带有鸡蛋的滤纸。将滤纸放入塑料培养皿（100 mm x 15 mm）中，该培养皿中含有一层用ddH2O润湿的滤纸。
- 观察鸡蛋。已经老化到浅灰色的蛋（图4）就可以对齐了。
- 如果鸡蛋仍然是白色的，请将它们放回孵化器并每5分钟检查一次颜色。白色的蛋很脆弱，容易破裂，注射过程后不能很好地存活，导致孵化率低。
- 深灰色或黑色的鸡蛋陈酿太多。不要使用它们。
3. 胚胎排列
- 用剃须刀片切开一块尼龙印迹膜（2 cm x 1 cm），确保边缘修剪整齐。
注意：如果边缘不直，则在注射过程中，鸡蛋将无法正确固定在膜上。 - 将膜放在载玻片上，并用一张滤纸（2 cm x 2 cm）覆盖膜，留下约1 mm的膜过滤器（图5）。
注：使用前确保显微镜载玻片清洁，并使用干净的镊子操作膜过滤器。 - 用去离子的H2O润湿滤纸，因为如果长时间干燥，鸡蛋会死亡。
注意：不要在纸上放太多水，因为胚胎在注射过程中会移动，但要确保有足够的水来防止胚胎干燥（图6A，B）。多余的水可以通过用一张滤纸吸收来去除。 - 用画笔（尺寸#0）轻轻地将30-50个胚胎转移到膜的边缘。使用刷子将卵子沿着膜垂直对齐，方法是在载玻片上轻轻滚动卵子，使腹侧（凸面）朝上。
- 将所有卵子朝向同一方向，以便在显微注射显微镜下观察卵子时，后端（更尖，图6A，B）处于向下位置，并与针头形成〜15°的角度（图6C）。用卵子（30-50）排列膜的整个边缘，并将载玻片置于显微镜下进行注射。
注意：仔细选择鸡蛋。丢弃白色（太年轻或未发育）或深灰色（太老会断针）和异常的（图7）。确保滤纸始终保持湿润。
4. 基因制备
- 按照制造商的协议，至少使用无内毒素的DNA质粒最大准备试剂盒纯化用于注射的质粒DNA。
- 将DNA重悬于PCR级水中，并在4°C下以17，100×g的冷藏离心机离心30分钟。 然后，将上清液转移到新的，干净的1.5mL锥形管中。小心地使用微量移液器，以避免从色谱柱中转移不需要的颗粒物。
- 使用十分之一体积的3M乙酸钠和两倍体积的100%乙醇进行DNA的第二次沉淀。
- 将DNA重悬于300-500μLPCR级水中，最终质粒浓度为1000 ng / μL。将质粒混合物在注射缓冲液中混合，最终质粒浓度为300-400 ng / μL，并制成10-20μL等分试样。
注意：DNA可以储存在-20°C，DNA显微注射等分试样可以储存在-20°C，如果使用RNA组分，可以储存在-80°C。注射液中不要超过800 ng / μL的DNA，因为粘度会导致针头堵塞。
5. 针头准备
- 通过使用可编程的微量移液器拉动10厘米的石英毛细管来制作针头。
- 在显微镜下检查针头，以确保尖端形成良好。确保可编程拉拔器上的针头设置产生一个尖端，该尖端开始从端子端逐渐变细约0.5 mm，并以细点结束（见 图6）。容易断裂的针通常具有太长的锥度。
注意：条件可能因拔针器而异（作者将根据要求提供他们使用的可编程拉拔器的设置。期刊限制禁止我们引用特定品牌）。针头可以手工拉动，但这需要大多数实验室无法提供的技能组合。
6. 胚胎显微注射
- 使用微量加载器尖端用2μL DNA混合物填充针头。将针插入针座并连接自动压力泵管（图8）。
- 重要提示：对齐指针，使其与滑块的平面成15°的角度（图8）。
- 通过小心地触摸第一个卵子打开针尖，并通过将针尖插入后极≤10μm来注射。成功的注射将导致卵子内细胞质的小运动。
- 使用显微镜同轴载物台对照移动到下一个卵子继续注射。
- 为了确保针尖保持打开并且没有堵塞，请在进入另一个胚胎之前按下注射按钮，并可视化针头开口处的小液滴。
- 如果针头堵塞，请按"清除"按钮清除针头并重复液滴可视化测试。如果针尖开口稍大，根据需要调整压力，以确保液滴的大小保持较小。
- 用一根针头注射约40-50个卵。
注意：确保滤纸始终保持湿润。在针头上保持足够的背压以保持其清洁。无法疏通堵塞的针头必须更换为新针头。胚胎放置，针头插入和注射使显微镜更容易，这些显微镜具有用于载物台水平移动的同轴控制（图9）。
- 注射完成后，将鸡蛋冲洗到衬有滤纸并装满50mL去离子H2O的玻璃容器中（图10）。
注意：胚胎将在注射后2天开始孵化，可能需要长达3-5天的时间。孵化的首龄幼虫必须立即转移到装有水和食物的干净容器中（每天检查2次）。
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Representative Results
所描述的显微注射方案应用的代表性例子可以在Carballar-Lejarazú等人5中找到。这里的目的是将自主基因驱动系统插入到An. gambiae的实验室菌株G3的种系中。该系统被设计为靶向该物种第三条染色体上的基本同源位点（Agcd），该位点编码血红素过氧化物酶，催化3-羟基炔基亚宁转化为黄原蛋白，这是嗜铬生物合成的最后一步（图11）。含纯合子基因驱动的蚊子是功能丧失的主要突变体，具有幼虫，蛹和新出现的具有红眼表型的成虫。含有驱动系统的质粒pCO37在冈比亚锥形虫纳米基因同源物的调节元件的控制下表达化脓性链球菌Cas9（SpCas9）内切酶，在冈比亚锥形U6基因启动子和3XP3-CFP显性标记盒的控制下表达用于鉴定转基因后代的23核苷酸引导RNA（gRNA）。Agcd与gRNA靶切位点两侧的基因组区域同源的DNA片段使得同源定向修复（HDR）介导的整合成为可能。
向780个野生型 冈比亚虫 胚胎注射了pCO37质粒和SpCas9蛋白。146个注射胚胎（18.7%;G0）存活到成年期，随后被异性杂交到异性的野生型成员。对下一代（G1）后代的荧光显微镜筛选确定了3，428个（0.09%）CFP标记基因阳性的三个，其中只有两个，一男一女，幸存下来。分子方法（基因扩增，DNA测序）验证了〜10 kb DNA的准确插入，并且所得菌株被命名为AgNosCd-1。广泛的随访分析表明，由于基因驱动系统的整合和表达，AgNosCd-1在驱动时效率很高，产生较少的抗性等位基因，并且没有主要的遗传负荷（适应性成本）5。pCO37质粒是开发 冈比亚羚 种群改性菌株的骨架，以防止疟疾寄生虫传播。
图1：卵子收集装置。 卵子收集装置由滤纸，尼龙网，牙科薄膜和加装的50 mL锥形管组成。该装置允许蚊子通过吸气器通过牙科薄膜中的缝隙牢固地沉积到容器中。滤纸和尼龙网允许水被吸收，从而为产卵提供潮湿但不被淹没的表面。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2： 冈比亚按蚊 胚胎。A）一批处于不同成熟阶段的胚胎。 B）箭头表示后极，即胚胎内包含生殖细胞的位置，这是转化的预期目标。比例尺代表 ~1 mm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图3：卵子收集。 一旦蚊子被放置在卵收集装置内，它就会被移动到一个培养皿中，其中含有一层用ddH2O润湿的滤纸。然后将卵收集装置和培养皿放入黑暗的培养箱中，让蚊子产卵总共45分钟 。
图4：胚胎发育。 胚胎只适合在短时间内注射。在发育过程中过早注射的卵太脆弱，会受到损害并且不会孵化。在发育后期注射的卵子会变硬，并且会破坏针头，导致过多的遗传物质被注射到卵子中。此外，发育后期的注射不太可能引起生殖系的永久性变化，因为极细胞迅速经历进一步的复制和分化。在产卵时间45分钟后每10分钟拍摄一次照片。星号（*）表示适合注射的卵子。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：膜载玻片组装。 卵子沿着尼龙膜对齐，尼龙膜提供支撑结构，使卵子在注射过程中不会移动。滤纸用作水的储水器，以确保鸡蛋在整个注射过程中保持湿润。将滤纸和尼龙膜靠近载玻片的边缘，为卵子和浸没它们的水留出空间。如果膜和滤纸离载玻片的边缘太远，则很难在胚胎和针之间实现正确的角度。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：用于显微注射的胚胎取向。 A）胚胎与低于前部的后极对齐，沿着膜向下延伸。 B）胚胎浸入水中;将卵子上方水线的宽度调整为大约平均胚胎宽度的八分之一到四分之一。 C）针头与胚胎角度的特写图像。比例尺代表 ~1 mm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图7：异常胚胎。 颜色或质地异常的胚胎不会孵化;不要注射它们。黄色的胚胎不会正常黑色化。在没有正常出现的蛋壳（角质层）的光滑胚胎中也观察到孵化减少。 请点击此处查看此图的放大版本。
图8：显微注射过程中的针头位置。A）注射阶段的广角视图。B，C）定位针头，使对齐的胚胎与注射针形成15°的角度。不要抬高显微注射器械的手臂，该仪器将针头保持在明显高于显微镜载物台的位置，以确保针头和含有胚胎的载玻片之间的正确倾斜。请点击此处查看此图的放大版本。
图9：同轴控制装置和持针器。A）同轴控制（箭头）允许针的三维运动，以确保每次注射时针的精确位置。在切换载玻片时，使用同轴控制装置垂直抬起针非常重要，这样在将滑轨放在载物台上时，针头不会与新载玻片碰撞。横向同轴控制允许针头精确地插入后极。 B）显示注射角度的针座图像。请点击此处查看此图的放大版本。
图10：卵孵化室。A，B）小心地将注射的胚胎洗涤到一个圆柱形容器中，用双蒸馏水填充到四分之一深度，并衬有滤纸。C，D）容器的移动使鸡蛋自然地粘附在滤纸上。在离开容器进行孵化之前，请确保将任何粘附在滤纸较高位置的蛋轻轻地洗回水位。蓝色椭圆形标记了许多沉积的卵，以显示相对大小。请点击此处查看此图的放大版本。
图 11.冈比亚按蚊（Agcd）基因同源物、pCO37基因驱动构建体和由此产生的表型。顶部）Agcd基因：栗色块，外显子（E1-4）;空块，3'-和5-未翻译区域（UTR）;粗黑线，内含子和基因间DNA。中）pCO37质粒：来自Agcd基因的同源臂：栗色块，蓝色块，显性标记基因组分（3XP3和CFP）;棕褐色块，驱动组分（纳米启动子和SpCas9蛋白质编码序列）;绿色块，引导RNA组分（U6启动子和gRNA序列）。pCO37的基因和特征无法扩展。在SpCaS9 / gRNA介导的切割位点（绿色箭头）启动的同源定向修复（HDR）产生的重组（栗色箭头）导致基因驱动构建体的整合。底部）得到的可见表型的基因驱动整合：（左）CFP+（白色/蓝色箭头）和纯合Agcd突变（红色箭头）表型在幼虫和Agcdd突变（红色箭头）表型在蛹中。（右）成人纯合Agcd突变表型"红眼"。改编自Carballar-Lejarazú等人。（2020） 并经许可使用5.请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
随着CRISPR/Cas9等精确和灵活的基因工程技术的可用性增加，转基因生物体可以比以前更直接、更稳定地开发。这些工具使研究人员能够创造出蚊子媒介的转基因菌株，这些菌株非常接近于实现对病原体的难耐性（种群改变）或可遗传不育（种群抑制）的理想特性。然而，为了开发最安全、最稳定的转基因蚊子，需要创建和评估更多的转基因系，以便为实地研究选择最佳品系。所描述的方案可以提高产生 冈比亚按蚊 转基因的效率，以便可以开发额外的候选者用于种群修饰和抑制策略。
所描述的显微注射程序利用了实验室中可能提供的设备和材料，这些设备和材料通常对蚊子或其他节肢动物媒介进行显微注射。在整个协议中保持对细节的关注非常重要。匆忙完成诸如按质量选择种蛋或跳过步骤（例如第二次DNA沉淀）将损害结果并导致孵化减少和转化效率降低。此外，如果在蚊子饲养中不小心，可能会出现许多困难。在拥挤的条件下饲养或缺乏营养的蚊子会产下质量较差的卵14，这在显微注射工作流程中造成了瓶颈，并将增加达到所需数量的注射胚胎所需的时间。
与斯蒂芬 西按蚊12的显微注射方法不同，这种方法不需要胚胎浸没油，并且可以在更短的时间内注射更多的胚胎，而无需油基方法所需的额外步骤。与基于油的方法相比，该方法的局限性是在整个显微注射过程中的可视化效果较差。为了确保注射材料或胚胎细胞质不会流回针头，在整个注射过程中必须始终注意针头的背压。
与其他按蚊属植物相比，非洲疟疾病媒历来难以进行基因操纵 ， 但它是全球疟疾病例的最大贡献者。需要新的工具来帮助消除疟疾的努力，旨在改变或抑制蚊子种群的转基因蚊子可以在实现消除方面发挥重要作用。为了为基于现场的疟疾消除研究选择最佳转基因候选药物，应评估一些品系，以便进行比较和选择，以获得最佳疗效和安全性15.表征和提供创建具有增强耐火性或抑制性的转基因系所需的遗传和分子构建块。该协议将有助于提高创建这些难治性或抑制性线的速度，以便在不久的将来开始选择候选药物进行现场试验。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Drusilla Stillinger，Kiona Parker，Parrish Powell和Madeline Nottoli的蚊子饲养。资金由加州大学欧文分校疟疾倡议提供。AAJ是加州大学欧文分校的Donald Bren教授。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
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