Summary
Micro-injectietechnieken zijn essentieel om exogene genen in het genoom van muggen te introduceren. Dit protocol verklaart een methode die door het James-laboratorium wordt gebruikt om DNA-constructies in Anopheles gambiae-embryo's te micro-injecteren om getransformeerde muggen te genereren.
Abstract
Embryo micro-injectie technieken zijn essentieel voor vele moleculaire en genetische studies van insectensoorten. Ze bieden een middel om exogene DNA-fragmenten die coderen voor genen van belang en gunstige eigenschappen op een stabiele en erfelijke manier in de kiembaan van insecten te introduceren. De resulterende transgene stammen kunnen worden bestudeerd voor fenotypische veranderingen als gevolg van de expressie van het geïntegreerde DNA om basisvragen te beantwoorden of worden gebruikt in praktische toepassingen. Hoewel de technologie eenvoudig is, vereist het van de onderzoeker geduld en oefening om een vaardigheidsniveau te bereiken dat de efficiëntie maximaliseert. Hier afgebeeld is een methode voor micro-injectie van embryo's van de Afrikaanse malariamug, Anopheles gambiae. Het doel is om door middel van micro-injectie exogene DNA aan het embryo af te leveren, zodat het kan worden opgenomen in de zich ontwikkelende kiembaan (pool) cellen. Expressie uit het geïnjecteerde DNA van transposasen, integrasen, recombinases of andere nucleasen (bijvoorbeeld CRISPR-geassocieerde eiwitten, Cas) kan gebeurtenissen veroorzaken die leiden tot de covalente insertie in chromosomen. Transgene An. gambiae gegenereerd uit deze technologieën zijn gebruikt voor basisstudies van componenten van het immuunsysteem, genen die betrokken zijn bij bloedvoeding en elementen van het reuksysteem. Bovendien zijn deze technieken gebruikt om An. gambiae-stammen te produceren met eigenschappen die kunnen helpen de overdracht van malariaparasieten onder controle te houden.
Introduction
Micro-injectietechnieken worden sinds de vroege jaren 1900 gebruikt om organismen experimenteel te manipuleren1. Micro-injectie is gebruikt om zowel biologische basisfuncties te bestuderen als /of belangrijke veranderingen in de biologie van een gewenst organisme aan te brengen. De micro-injectietechniek is van bijzonder belang geweest voor vectorbiologen en is veel gebruikt om vectorgenomen2-11te manipuleren. Transgenese-experimenten in geleedpotige vectoren zijn vaak bedoeld om vectoren minder efficiënt te maken in het overbrengen van pathogenen door veranderingen door te voeren die de fitheid van een vector verminderen of de refractie verhogen voor de pathogenen die ze overbrengen. Muggen brengen een verscheidenheid aan menselijke ziekteverwekkers over en hebben een aanzienlijke impact op de morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Het geslacht Van muggen anopheles brengt de menselijke malariaparasitaire pathogenen, Plasmodium spp, over. Genetische manipulatie-experimenten met Anopheles hebben tot doel de biologie beter te begrijpen en de vectoriële capaciteit van deze muggen te verminderen in pogingen om nieuwe malaria-eliminatiestrategieën te ontwikkelen.
De muggenvectoren die wereldwijd de meeste malaria-infecties veroorzaken, bevinden zich in het Anopheles gambiae-soortencomplex. De meeste succesvolle transgenese-experimenten zijn echter uitgevoerd op de malariavector van het Indiase subcontinent, Anopheles stephensi. Hoewel er veel laboratorium-aangepaste Anopheles gambiae stammen bestaan, is het aantal transgene Anopheles gambiae spp. lijnen gerapporteerd in de literatuur niet te vergelijken met dat van Anopheles stephensi. Er wordt gedacht dat het Anopheles gambiae embryo moeilijker te injecteren is en succesvolle transgenese bereikt dan Anopheles stephensi, hoewel de redenen voor deze verschillen onbekend zijn. Dit protocol beschrijft een methode waarvan bewezen is dat deze consistent succesvol is in het bereiken van transgenese van Anopheles gambiae embryo's via micro-injectie. Het protocol is gebaseerd op een methode die eerder is ontwikkeld door Hervé Bossin en Mark Benedict12 met enkele aanvullende details en wijzigingen die zijn toegevoegd die de efficiëntie van transgenese blijken te verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Muggen voorbereiden op micro-injectie
- Zaai een kooi13 (~ 5000 cm3) met ~ 100 mannelijke en 200-300 vrouwelijke 1-2 dagen volwassen post-eclosie muggen en laat ze 2 dagen paren.
- Geef muggen na de paarperiode een bloedmaaltijd met behulp van 2 ml bloed met een kunstmatig voedingsapparaat of levende verdoofde dieren, afhankelijk van insectenpraktijken14. Geef muggen de volgende dag een tweede bloedmaaltijd om ervoor te zorgen dat alle gepaarde vrouwtjes de gelegenheid hebben gehad om zich te voeden en dat gedeeltelijk gevoede muggen volledig zijn opgezwollen.
- Gebruik de muggen voor embryoverzamelingen 2-4 dagen na de tweede bloedmaaltijd.
OPMERKING: Larvale voeding is belangrijk voor de robuustheid van volwassenen en reproductieve fitheid. Zie Benedictus et al. (2020) voor informatie over het fokken van gezonde insecten14. Er zijn geen significante verschillen in het leggen van eieren waargenomen wanneer muggen worden gevoed met een kunstmatige feeder of levende verdoofde dieren. Gebruik de methode die routinematig wordt gebruikt voor Anopheles gambiae in het insectarium.
2. Embryopreparatie
- Gebruik een aspirator om 20-30 vrouwtjes in een transparante conische buis van 50 ml te plaatsen die is gesneden (met een lintzaag) om aan beide uiteinden open te zijn en aan het ene uiteinde bedekt is met latex tandfolie en aan het andere uiteinde nylon gaas en filtreerpapier(figuur 1).
OPMERKING: De muggen zullen hun eieren op het filterpapier deponeren en het nylon gaas zal het filterpapier stevig op zijn plaats houden. Muggeneieren zijn cilindrisch van vorm, ~ 500 μm lang, ~ 200 μm in diameter op hun breedste punt en taps toelopend aan de voorste en achterste uiteinden(figuur 2). - Plaats de met muggen gevulde buis in een kleine (60 mm x 15 mm) petrischaal gevuld met dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Plaats de tube en schaal in een couveuse bij 28 °C gedurende 45 minuten(figuur 3).
- Haal de buis uit de couveuse en steek de buis in een lege kooi. Tik voorzichtig op de buis om muggen naar buiten te laten vliegen en verwijder de buis uit de kooi zodra alle muggen zijn uitgevlogen.
- Wanneer de buis vrij is van muggen, schroeft u de onderste ring los, verwijdert u het nylon en gebruikt u een tang om het filterpapier met de eieren voorzichtig uit de buis te verwijderen. Plaats het filtreerpapier in een plastic petrischaaltje (100 mm x 15 mm) met daarin een laag filterpapier bevochtigd met ddH2O.
- Observeer de eieren. Eieren die zo oud zijn dat ze lichtgrijs van kleur zijn(figuur 4)zijn klaar voor uitlijning.
- Als de eieren nog wit zijn, breng ze dan terug naar de broedmachine en controleer de kleur elke 5 minuten. Witte eieren zijn kwetsbaar, scheuren gemakkelijk en overleven niet goed na het injectieproces, wat resulteert in een laag uitkomen.
- Eieren die donkergrijs of zwart zijn, zijn te veel verouderd. Gebruik ze niet.
3. Embryo-uitlijning
- Knip met een scheermesje een stuk nylon vloeimembraan (2 cm x 1 cm) af en zorg ervoor dat de rand netjes is bijgesneden.
OPMERKING: Als de rand niet recht is, blijven de eieren tijdens het injectieproces niet goed op het membraan bevestigd. - Plaats een membraan op een glasplaat en bedek het membraan met een stuk filterpapier (2 cm x 2 cm), waardoor ~ 1 mm van het membraanfilter onbedekt blijft(figuur 5).
OPMERKING: Zorg ervoor dat microscoopglaasjes schoon zijn voor gebruik en gebruik een schone tang om het membraanfilter te manipuleren. - Maak het filtreerpapier nat met gedeïoniseerd H2O, omdat eieren zullen sterven als ze gedurende langere tijd worden uitgedroogd.
OPMERKING: Doe niet te veel water op het papier omdat de embryo's tijdens het injectieproces zullen bewegen, maar zorg ervoor dat er voldoende is om te voorkomen dat het embryo droogt(Figuur 6A,B). Overtollig water kan worden verwijderd door het te absorberen met een stukfilterpapier. - Breng voorzichtig 30-50 embryo's over naar de rand van het membraan met een penseel (maat # 0). Gebruik de borstel om de eieren verticaal langs het membraan uit te lijnen door ze voorzichtig over de glijbaan te rollen, zodat de ventrale kant (bol) naar boven is gericht.
- Oriënteer alle eieren in dezelfde richting, zodat wanneer de eieren onder de micro-injectiemicroscoop worden waargenomen, het achterste uiteinde (meer puntig, figuur 6A, B) zich in een neerwaartse positie bevindt en een hoek van ~ 15 ° vormt met de naald ( figuur6C). Bekleed de hele rand van het membraan met eieren (30-50) en plaats de dia onder de microscoop voor injectie.
OPMERKING: Kies de eieren zorgvuldig. Gooi de witte (te jong of onontwikkeld) of donkergrijs (te oud en zal de naald breken) en de abnormale(figuur 7)weg. Zorg ervoor dat het filtreerpapier te allen tijde vochtigblijft.
4. DNA-bereiding
- Zuiver plasmide DNA's voor injectie, op zijn minst, met een endotoxinevrije DNA-plasmide maxiprep-kit volgens de protocollen van de fabrikant.
- Resuspend het DNA in water van PCR-kwaliteit en centrifugeer bij 17.100 x g in een gekoelde centrifuge gedurende 30 minuten bij 4 °C. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe, schone conische buis van 1,5 ml. Voorzichtig micropipet om te voorkomen dat ongewenste deeltjes uit de kolom worden overgebracht.
- Voer een tweede precipitatie van DNA uit met behulp van een tiende volume 3M natriumacetaat en een tweevoudig volume van 100% ethanol.
- Resuspend het DNA in 300-500 μL PCR-water voor een uiteindelijke plasmideconcentratie van 1000 ng/μL. Meng de plasmidecocktail in de injectiebuffer voor een uiteindelijke plasmideconcentratie van 300-400 ng/μL en maak 10-20 μL aliquots.
OPMERKING: DNA kan worden opgeslagen bij -20 °C. DNA-micro-injectie aliquots kunnen worden opgeslagen bij -20 °C, of bij -80 °C bij gebruik van RNA-componenten. Overschrijd niet meer dan 800 ng/μL DNA in het injectiemengsel, omdat de viscositeit ervoor zorgt dat de naalden verstoppen.
5. Naaldvoorbereiding
- Maak de naalden door 10 cm kwartscapillairen te trekken met behulp van een programmeerbare micropipettetrekker.
- Onderzoek de naald onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de punt goed is gevormd. Zorg ervoor dat de naaldinstelling op de programmeerbare trekker een punt oplevert die ~0,5 mm van het uiteinde van de terminal begint taps toe te lopen en eindigt in een fijn punt (zie figuur 6). Naalden die gemakkelijk breken, hebben meestal een te lange taps toelopende.
OPMERKING: De omstandigheden kunnen verschillen afhankelijk van de naaldtrekker (de auteurs zullen op verzoek de instellingen beschikbaar stellen voor de programmeerbare trekker die ze gebruiken. Tijdschriftbeperkingen voorkomen dat we een specifiek merk citeren). Naalden kunnen met de hand worden getrokken, maar dit vereist een vaardighedenset die in de meeste laboratoria niet beschikbaar is.
6. Micro-injectie van embryo's
- Gebruik een microladerpunt om de naalden te vullen met 2 μL DNA-mengsel. Steek de naald in de naaldhouder en sluit de automatische drukpompbuis aan(figuur 8).
- Belangrijk: Lijn de naald zo uit dat deze een hoek van 15° maakt met het vlak van de dia(figuur 8).
- Open de punt van de naald door het eerste ei voorzichtig aan te raken en injecteer het door de punt van de naald ≤ 10 μm in de achterste paal te steken. Een succesvolle injectie zal leiden tot een kleine beweging van het cytoplasma in het ei.
- Gebruik de coaxiale faseregelaars van de microscoop om naar het volgende ei te gaan om de injectie voort te zetten.
- Om ervoor te zorgen dat de naaldpunt open blijft en niet verstopt is, drukt u op de injecteerknop voordat u een ander embryo binnengaat en visualiseert u het kleine druppeltje bij de opening van de naald.
- Als de naald verstopt raakt, drukt u op de knop Wissen om de naald te wissen en herhaalt u de druppelvisualisatietest. Pas de druk indien nodig aan als de opening van de naaldpunt iets groter wordt om ervoor te zorgen dat de grootte van de druppel klein blijft.
- Injecteer ~ 40-50 eieren met één naald.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het filtreerpapier te allen tijde vochtig blijft. Houd voldoende tegendruk op de naald om deze vrij te houden. Een naald die niet kan worden ontstopt, moet worden vervangen door een nieuwe naald. Het plaatsen van embryo's, het inbrengen van naalden en injectie worden vergemakkelijkt met microscopen met coaxiale controles voor horizontale beweging van het stadium(figuur 9).
- Nadat de injecties zijn voltooid, spoelt u de eieren af in een glazen container bekleed met filtreerpapier en gevuld met 50 ml gedeïoniseerd H2O(figuur 10).
OPMERKING: Embryo's beginnen 2 dagen na de injectie uit te komen en kunnen 3-5 dagen duren. Uitgekomen eerste instarlarven moeten onmiddellijk worden overgebracht (controleer 2 keer per dag) naar een schone container met water en voedsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een representatief voorbeeld van de toepassing van het beschreven micro-injectieprotocol is te vinden in Carballar-Lejarazú et al5. De bedoeling hier was om een autonoom gene-drive systeem in te brengen in de kiembaan van een laboratoriumstam, G3, van An. gambiae. Het systeem is ontworpen om zich te richten op de kardinaal ortholog locus (Agcd) op het derde chromosoom in deze soort, dat codeert voor een heemperoxidase dat de omzetting van 3-hydroxykynurenine naar xanthomaline katalyseert, de laatste stap in ommochrome biosynthese (Figuur 11). Homozygote gene drive-bevattende muggen zijn functieverlies kardinaalmutanten met larven, poppen en nieuw ontstane volwassenen met een roodoogfenotype. Een plasmide, pCO37, met het aandrijfsysteem drukt Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) endonuclease uit onder controle van de regulerende elementen van het An. gambiae nanos gen ortholoog, een 23-nucleotide gids RNA (gRNA) onder controle van een An. gambiae U6 gen promotor en een 3XP3-CFP dominante marker cassette die het cyaan fluorescerende eiwit tot expressie brengt voor het identificeren van transgene nakomelingen. AGCD DNA-fragmenten homoloog aan genomische gebieden die de gRNA-doelsnijplaats flankeren, maken homologiegerichte reparatie (HDR) gemedieerde integratie mogelijk.
Zevenhonderdtachtig wild-type An. gambiae embryo's werden geïnjecteerd met het pCO37 plasmide samen met SpCas9 eiwit. Honderdzesenveertig geïnjecteerde embryo's (18,7%; G0) overleefde tot het volwassen stadium en werden vervolgens gekruist met wild-type leden van het andere geslacht. Fluorescerende microscoopscreening van de volgende generatie (G1)nakomelingen identificeerde drie van de 3.428 (0,09%) die positief waren voor het CFP-markergen, waarvan er slechts twee, een man en een vrouw, overleefden. Moleculaire benaderingen (gen-amplificatie, DNA-sequencing) verifieerden de nauwkeurige insertie van ~ 10 kb DNA en de resulterende stam werd aangeduid als AgNosCd-1. Uitgebreide follow-up analyses toonden aan dat AgNosCd-1 zeer efficiënt was bij het aandrijven, weinig resistente allelen creëerde en geen grote genetische belasting (fitnesskosten) had als gevolg van de integratie en expressie van het gene-drive systeem5. Het pCO37 plasmide dient als ruggengraat voor het ontwikkelen van populatiemodificatiestammen van An. gambiae om overdracht van malariaparasieten te voorkomen.
Figuur 1: Apparaat voor het verzamelen van eieren. Het eierverzamelapparaat bestaat uit filterpapier, nylon gaas, tandfolie en een achteraf gemonteerde conische buis van 50 ml. Met het apparaat kunnen muggen door een aspirator veilig in de container worden afgezet via de spleet in tandfolie. Het filterpapier en nylon gaas laten water absorberen, wat zorgt voor een vochtig, maar niet overstroomd oppervlak, voor ovipositie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Anopheles gambiae embryo's. A) Een partij embryo's in verschillende stadia van rijping. B) De pijlen geven de achterpool aan, de locatie in het embryo dat kiembaancellen bevat, die de beoogde doelen zijn voor transformatie. De schaalbalk vertegenwoordigt ~1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Eierverzameling. Zodra de muggen in het eierverzamelapparaat zijn geplaatst, wordt het verplaatst naar een petrischaal met een laag filterpapier bevochtigd met ddH2O. Pas het watervolume aan zodat het waterniveau stijgt tot ~ 1/4 van de hoogte van de dop. Het eierverzamelapparaat en de petrischaal worden vervolgens in een verduisterde couveuse geplaatst en muggen mogen in totaal 45 minuten ovponeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Embryo-ontwikkeling. De embryo's zijn alleen geschikt voor injectie gedurende een korte periode. Eieren die vroegtijdig in de ontwikkeling worden geïnjecteerd, zijn te delicaat en zullen schade oplopen en niet uitkomen. Eieren die later in hun ontwikkeling worden geïnjecteerd, worden verhard en kunnen de naald breken waardoor er te veel genetisch materiaal in het ei wordt geïnjecteerd. Bovendien is het minder waarschijnlijk dat injecties later in de ontwikkeling permanente veranderingen in de kiembaan veroorzaken, omdat poolcellen snel verdere replicatie en differentiatie ondergaan. Foto's werden elke 10 min gemaakt na ovipositietijd van 45 min. De sterretjes (*) geven eieren aan die geschikt zijn voor injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Assemblage van membraanglijbanen. De eieren zijn uitgelijnd langs het nylon membraan, dat een ondersteunende structuur biedt zodat de eieren niet bewegen tijdens het injectieproces. Het filtreerpapier dient als een reservoir voor water om ervoor te zorgen dat de eieren vochtig blijven tijdens de injectie. Plaats het filtreerpapier en het nylon membraan dicht bij de rand van de glasplaat en laat ruimte voor zowel eieren als het water dat ze onderdompelt. Als het membraan en het filterpapier zich te ver van de rand van de dia bevinden, zal het moeilijk zijn om de juiste hoek tussen embryo's en naald te bereiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Embryooriëntatie voor micro-injectie. A) Embryo's zijn uitgelijnd met de achterste polen lager dan de voorste en lopen langs het membraan. B) De embryo's worden ondergedompeld in water; pas de breedte van de waterlijn boven het ei aan op ongeveer een achtste tot een kwart van de breedte van een gemiddeld embryo. C) Close-up van de naaldhoek met embryo's. De schaalbalk vertegenwoordigt ~1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Abnormale embryo's. Embryo's die abnormaal lijken in kleur of textuur zullen niet uitkomen; injecteer ze niet. Embryo's die geel van kleur zijn, zullen niet goed melaniseren. Verminderd uitkomen is ook waargenomen bij gladde embryo's die geen normaal lijkende eierschalen (nagelriemen) hebben. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Positie van de naald tijdens de micro-injecties. A) Groothoekaanzicht van de injectiefase. B,C) Plaats de naald zo dat de uitgelijnde embryo's een hoek van 15° vormen met de injectienaald. Til de arm van het micro-injectie-instrument dat de naald aanzienlijk hoger houdt dan het microscoopstadium niet op om te zorgen voor een goede hengel tussen de naald en het glaasje met de embryo's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Coaxiale bedieningselementen en naaldhouder. A)De co-axiale bedieningselementen (pijl) maken een 3-dimensionale beweging van de naald mogelijk om een nauwkeurige plaatsing van de naald voor elke injectie te garanderen. Het is belangrijk om co-axiale bedieningselementen te gebruiken om de naald verticaal op te tillen bij het wisselen van dia's, zodat de naald niet botst met de nieuwe dia wanneer deze op zijn plaats op het podium wordt geplaatst. Laterale co-axiale controles zorgen voor een nauwkeurige penetratie van de naald in de achterste pool. B) Afbeelding van de naaldhouder met de hoek voor injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Kamer voor het uitkomen van eieren. A,B)Was de geïnjecteerde embryo's zorgvuldig in een cilindrische container die tot een kwart diepte is gevuld met dubbel gedestilleerd water en bekleed met filtreerpapier. C,D) Beweging van de container zorgt ervoor dat de eieren zich op natuurlijke wijze hechten aan het filterpapier. Voordat u de container verlaat om uit te komen, moet u ervoor zorgen dat alle eieren die hoger op het filterpapier zijn blijven zitten, voorzichtig worden teruggespoeld tot waterniveau. De blauwe ovaal markeert een aantal afgezette eieren om de relatieve grootte weer te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11. Anopheles gambiae cardinal (Agcd) gen ortholoog, pCO37 gene drive construct en resulterende fenotypes. Boven) Agcd-gen: kastanjebruine blokken, exonen (E1-4); lege blokken, 3'- en 5-onvertaalde gebieden (UTR); dikke zwarte lijn, introns en intergeen DNA. Midden) pCO37 plasmide: homologie armen van Agcd gen: kastanjebruine blokken, blauwe blokken, dominante marker gencomponenten (3XP3 en CFP); tan-blokken, aandrijfcomponenten(nanospromotor en SpCas9-eiwitcoderingssequenties); groene blokken, geleide RNA-componenten (U6-promotor en gRNA-sequentie). Genen en kenmerken van pCO37 zijn niet op schaal. Recombinatie (kastanjebruine pijlen) als gevolg van homology directed repair (HDR) geïnitieerd op de SpCaS9/ gRNA-gemedieerde snijplaats (groene pijlpunt) resulteert in integratie van de gene drive construct. Onder) resulterende zichtbare fenotypes van gene drive integratie: (links) CFP+ (wit/blauwe pijl) en homozygote Agcd-mutant (rode pijl) fenotypes in larven en Agcd-mutant (rode pijl) fenotypes in poppen. (rechts) Homozygoot Agcd mutant fenotype "rode ogen" bij volwassenen. Aangepast van Carballar-Lejarazú et al. (2020) en gebruikt met toestemming5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de toegenomen beschikbaarheid van nauwkeurige en flexibele genetische manipulatietechnologieën zoals CRISPR/Cas9 kunnen transgene organismen op een eenvoudigere en stabielere manier worden ontwikkeld dan voorheen mogelijk was. Deze tools hebben onderzoekers in staat gesteld om transgene stammen van muggenvectoren te creëren die zeer dicht bij het bereiken van de gewenste eigenschappen van refractie voor pathogenen (populatiemodificatie) of erfelijke steriliteit (populatieonderdrukking) liggen. Om echter de meest veilige en stabiele genetisch gemodificeerde muggen mogelijk te ontwikkelen, moeten extra transgene lijnen worden gecreëerd en geëvalueerd, zodat optimale lijnen worden geselecteerd voor veldstudies. Het beschreven protocol kan de efficiëntie van het genereren van Anopheles gambiae transgenics verhogen, zodat extra kandidaten kunnen worden ontwikkeld voor populatiemodificatie en onderdrukkingsstrategieën.
De beschreven micro-injectieprocedure maakt gebruik van apparatuur en materialen die waarschijnlijk beschikbaar zijn in een laboratorium dat routinematig micro-injecties van muggen of andere geleedpotige vectoren uitvoert. Het is belangrijk om aandacht te besteden aan detail gedurende het hele protocol. Het overhaasten van stappen zoals het selecteren van eieren op kwaliteit of het overslaan van stappen zoals de tweede DNA-neerslag zal de resultaten aantasten en leiden tot minder uitkomen en verminderde transformatie-efficiëntie. Bovendien kunnen er veel problemen met de procedure ontstaan als er niet voorzichtig wordt omgesprongen in de muggenhouderij. Muggen die worden gekweekt in drukke omstandigheden of met een gebrek aan voedingsstoffen zullen minder eieren van slechtere kwaliteit leggen14, wat knelpunten creëert in de workflow voor micro-injecties en de tijd zal verlengen die nodig is om een gewenst aantal geïnjecteerde embryo's te bereiken.
In tegenstelling tot methoden die zijn beschreven voor de micro-injectie van Anopheles stephensi12, vereist deze methode geen olieonderdompeling van de embryo's en kunnen meer embryo's in een kortere tijd worden geïnjecteerd zonder de extra stappen die vereist zijn door de op olie gebaseerde methode. Een beperking van deze methode in vergelijking met de op olie gebaseerde methode is een slechtere visualisatie gedurende het micro-injectieproces. Om ervoor te zorgen dat injectiemateriaal of embryocytoplasma niet terugvloeit in de naald, moet tijdens het injectieproces te allen tijde aandacht worden besteed aan de tegendruk van de naald.
De Afrikaanse malariavector is historisch moeilijk genetisch te manipuleren in vergelijking met andere Anopheles spp., maar het is de grootste bijdrage aan malariagevallen wereldwijd. Nieuwe hulpmiddelen zijn nodig om malaria-eliminatie-inspanningen te ondersteunen en transgene muggen die zijn ontworpen om muggenpopulaties te wijzigen of te onderdrukken, kunnen een belangrijke rol spelen bij het bereiken van eliminatie. Om de beste transgene kandidaten voor veldgebaseerde malaria-eliminatiestudies te selecteren, moeten een aantal lijnen worden geëvalueerd, zodat ze kunnen worden vergeleken en geselecteerd op optimale werkzaamheid en veiligheid15. De genetische en moleculaire bouwstenen die nodig zijn om transgene lijnen met verbeterde refractiviteit of onderdrukking te creëren, worden gekarakteriseerd en zijn beschikbaar. Dit protocol zal helpen bij het verhogen van de snelheid waarmee deze refractaire of onderdrukkende lijnen kunnen worden gecreëerd, zodat validatie-inspanningen in de nabije toekomst kunnen beginnen met het selecteren van een kandidaat voor veldproeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell en Madeline Nottoli dankbaar voor de muggenhouderij. Financiering werd verstrekt door de Universiteit van Californië, Irvine Malaria Initiative. AAJ is een Donald Bren Professor aan de Universiteit van Californië, Irvine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
