Summary
Les techniques de micro-injection sont essentielles pour introduire des gènes exogènes dans les génomes des moustiques. Ce protocole explique une méthode utilisée par le laboratoire James pour microinjecter des constructions d’ADN dans des embryons d’Anophèles gambiens afin de générer des moustiques transformés.
Abstract
Les techniques de micro-injection embryonnaire sont essentielles pour de nombreuses études moléculaires et génétiques d’espèces d’insectes. Ils fournissent un moyen d’introduire des fragments d’ADN exogènes codant pour des gènes d’intérêt ainsi que des traits favorables dans la lignée germinale de l’insecte de manière stable et héréditaire. Les souches transgéniques résultantes peuvent être étudiées pour les changements phénotypiques résultant de l’expression de l’ADN intégré pour répondre à des questions de base ou utilisées dans des applications pratiques. Bien que la technologie soit simple, elle exige de l’enquêteur de la patience et de la pratique pour atteindre un niveau de compétence qui maximise l’efficacité. On voit ici une méthode de micro-injection d’embryons du moustique africain du paludisme, Anopheles gambiae. L’objectif est de délivrer par microinjection de l’ADN exogène à l’embryon afin qu’il puisse être absorbé dans les cellules germinales (pôles) en développement. L’expression à partir de l’ADN injecté de transposases, d’intégrases, de recombinases ou d’autres nucléases (par exemple les protéines associées à CRISPR, Cas) peut déclencher des événements qui conduisent à son insertion covalente dans les chromosomes. L’An. gambiae transgénique généré à partir de ces technologies a été utilisé pour des études de base des composants du système immunitaire, des gènes impliqués dans l’alimentation sanguine et des éléments du système olfactif. En outre, ces techniques ont été utilisées pour produire des souches d’An. gambiae avec des caractéristiques qui peuvent aider à contrôler la transmission des parasites du paludisme.
Introduction
Les techniques de micro-injection sont utilisées pour manipuler expérimentalement des organismes depuis le début des années 19001. La microinjection a été utilisée pour étudier à la fois les fonctions biologiques de base et / ou introduire des changements importants dans la biologie d’un organisme désiré. La technique de micro-injection a été d’un intérêt particulier pour les biologistes vecteurs et a été largement utilisée pour manipuler les génomes vectoriels2-11. Les expériences de transgénèse chez les vecteurs arthropodes visent souvent à rendre les vecteurs moins efficaces pour transmettre les agents pathogènes en adoptant des changements qui diminuent la capacité physique d’un vecteur ou augmentent la réfractaireté des agents pathogènes qu’ils transmettent. Les moustiques transmettent une variété d’agents pathogènes humains et ont un impact significatif sur la morbidité et la mortalité dans le monde entier. Le genre de moustiques Anopheles transmet les agents pathogènes parasites du paludisme humain, Plasmodium spp. Les expériences de génie génétique avec les anophèles ont visé à mieux comprendre la biologie et à réduire la capacité vectorielle de ces moustiques dans le but de développer de nouvelles stratégies d’élimination du paludisme.
Les moustiques vecteurs qui contribuent le plus au nombre d’infections palustres dans le monde se trouvent dans le complexe d’espèces Anopheles gambiae. Cependant, la majorité des expériences de transgénèse réussies ont été réalisées sur le vecteur du paludisme du sous-continent indien, Anopheles stephensi. Bien qu’il existe de nombreuses souches d’Anopheles gambiae adaptées en laboratoire, le nombre de lignées transgéniques d’Anopheles gambiae spp. rapportées dans la littérature ne se compare pas à celui d’Anopheles stephensi. On pense que l’embryon d’Anophèle gambie est plus difficile à injecter et à réussir la transgénèse que Anopheles stephensi,bien que les raisons de ces différences soient inconnues. Ce protocole décrit une méthode qui s’est avérée toujours efficace pour réaliser la transgénèse des embryons d’Anophèles gambiae par micro-injection. Le protocole est basé sur une méthode précédemment développée par Hervé Bossin et Mark Benedict12 avec quelques détails et modifications supplémentaires qui ont été trouvés pour augmenter l’efficacité de la transgénèse.
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Protocol
1. Préparation des moustiques à la micro-injection
- Ensemencez une cage13 (~5000 cm3)avec ~100 moustiques mâles et 200-300 femelles adultes de 1-2 jours après l’éclosion et laissez-les s’accoupler pendant 2 jours.
- Après la période d’accouplement, fournir aux moustiques un repas de sang en utilisant soit 2 mL de sang avec un dispositif d’alimentation artificielle, soit des animaux anesthésiés vivants selon les pratiques insectaires14. Le lendemain, fournissez aux moustiques un deuxième repas de sang pour s’assurer que toutes les femelles accouplées ont eu l’occasion de se nourrir et que les moustiques partiellement nourris sont devenus complètement engorgés.
- Utilisez les moustiques pour les collectes d’embryons 2 à 4 jours après le deuxième repas de sang.
REMARQUE: La nutrition larvaire est importante pour la robustesse et la capacité de reproduction de l’adulte. Voir Benedict et al. (2020) pour plus d’informations sur la façon d’élever des insectes en bonne santé14. Aucune différence significative dans la ponte n’a été observée lorsque les moustiques sont nourris sur une mangeoire artificielle ou des animaux anesthésiés vivants. Utilisez la méthode couramment utilisée pour Anopheles gambiae dans l’insectaire.
2. Préparation de l’embryon
- Utilisez un aspirateur pour placer 20 à 30 femelles dans un tube conique transparent de 50 mL qui a été coupé (avec une scie à ruban) pour être ouvert aux deux extrémités et recouvert d’un film dentaire en latex à une extrémité et d’un maillage en nylon et de papier filtre à l’autre(Figure 1).
REMARQUE: Les moustiques déposeront leurs œufs sur le papier filtre et le maillage en nylon maintiendra le papier filtre en place en toute sécurité. Les œufs de moustiques ont une forme cylindrique, une longueur d’environ 500 μm, un diamètre d’environ 200 μm à leur point le plus large et s’effilent aux extrémités antérieure et postérieure(figure 2). - Placez le tube rempli de moustiques dans une petite boîte de Petri (60 mm x 15 mm) remplie d’eau double distillée (ddH2O). Placer le tube et la parabole dans un incubateur à 28 °C pendant 45 min(Figure 3).
- Retirez le tube de l’incubateur et insérez-le dans une cage vide. Tapotez doucement le tube pour permettre aux moustiques de s’envoler et retirez le tube de la cage une fois que tous les moustiques se sont envolés.
- Lorsque le tube est exempt de moustiques, dévissez l’anneau inférieur, retirez le nylon et utilisez une pince pour retirer soigneusement le papier filtre avec les œufs du tube. Placez le papier filtre dans une boîte de Petri en plastique (100 mm x 15 mm) contenant une couche de papier filtre humidifiée avec du ddH2O.
- Observez les œufs. Les œufs qui ont vieilli au point d’être de couleur gris clair(Figure 4)sont prêts pour l’alignement.
- Si les œufs sont encore blancs, retournez-les à l’incubateur et vérifiez la couleur toutes les 5 minutes. Les œufs blancs sont fragiles, se rompent facilement et ne survivent pas bien après le processus d’injection, ce qui entraîne une faible éclosion.
- Les œufs gris foncé ou noirs ont trop vieilli. Ne les utilisez pas.
3. Alignement des embryons
- Coupez un morceau de membrane de buvard en nylon (2 cm x 1 cm) avec une lame de rasoir, en vous assurant que le bord est bien coupé.
REMARQUE: Si le bord n’est pas droit, les œufs ne resteront pas correctement fixés à la membrane pendant le processus d’injection. - Placez une membrane sur une lame de verre et recouvrez la membrane d’un morceau de papier filtre (2 cm x 2 cm), en laissant environ 1 mm du filtre à membrane découvert (Figure 5).
REMARQUE: Assurez-vous que les lames de microscope sont propres avant utilisation et utilisez des pinces propres pour manipuler le filtre à membrane. - Mouillez le papier filtre avec du H2O désionisé, car les œufs mourront s’ils sont desséchés pendant de longues périodes.
REMARQUE: Ne mettez pas trop d’eau sur le papier car les embryons se déplaceront pendant le processus d’injection, mais assurez-vous qu’il y en a assez pour empêcher l’embryon de sécher (Figure 6A, B). L’excès d’eau peut être éliminé en l’absorbant avec un morceau de papierfiltre. - Transférez doucement 30 à 50 embryons sur le bord de la membrane avec un pinceau (taille #0). Utilisez la brosse pour aligner les œufs verticalement le long de la membrane en les roulant doucement sur la glissière afin que la face ventrale (convexe) soit tournée vers le haut.
- Orienter tous les œufs dans la même direction de sorte que lorsque les œufs sont observés au microscope à micro-injection, l’extrémité postérieure (plus pointue, Figure 6A, B) est en position basse et forme un angle d’environ 15° avec l’aiguille ( Figure6C). Tapisser tout le bord de la membrane avec des œufs (30-50) et placer la lame sous le microscope pour injection.
REMARQUE: Choisissez les œufs avec soin. Jetez ceux qui sont blancs (trop jeunes ou peu développés) ou gris foncé (trop vieux et qui casseront l’aiguille), et les anormaux(Figure 7). Assurez-vous que le papier filtre reste humide en touttemps.
4. Préparation de l’ADN
- Purifier les ADN plasmidiques pour injection, au minimum, avec un kit maxiprep de plasmide plasmidique sans endotoxine en suivant les protocoles du fabricant.
- Remettre l’ADN dans de l’eau de qualité PCR et centrifuger à 17 100 x g dans une centrifugeuse réfrigérée pendant 30 min à 4 °C. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube conique propre de 1,5 mL. Micro-pipette soigneusement pour éviter de transférer des particules indésirables de la colonne.
- Effectuer une deuxième précipitation d’ADN en utilisant un dixième de volume d’acétate de sodium 3M et un volume deux fois plus important d’éthanol à 100%.
- Remettre l’ADN en suspension dans 300-500 μL d’eau de qualité PCR pour une concentration finale en plasmides de 1000 ng/μL. Mélanger le cocktail de plasmides dans le tampon d’injection pour obtenir une concentration finale de plasmide de 300-400 ng/μL et faire des aliquotes de 10-20 μL.
REMARQUE: L’ADN peut être stocké à -20 ° C. Les aliquotes de microinjection d’ADN peuvent être stockées à -20 ° C ou à -80 ° C si vous utilisez des composants d’ARN. Ne pas dépasser 800 ng/μL d’ADN dans le mélange d’injection, car la viscosité entraînera le colmatage des aiguilles.
5. Préparation de l’aiguille
- Fabriquez les aiguilles en tirant des capillaires de quartz de 10 cm à l’aide d’un extracteur de micropipette programmable.
- Examinez l’aiguille au microscope pour vous assurer que la pointe est bien formée. Assurez-vous que le réglage de l’aiguille sur l’extracteur programmable donne une pointe qui commence à se rétrécir à environ 0,5 mm de l’extrémité terminale et se termine en un point fin (voir Figure 6). Les aiguilles qui se cassent facilement ont généralement une conicité trop longue.
REMARQUE: Les conditions peuvent différer en fonction de l’extracteur d’aiguilles (les auteurs mettront à disposition sur demande les paramètres de l’extracteur programmable qu’ils utilisent. Les restrictions de journal nous empêchent de citer une marque spécifique). Les aiguilles peuvent être tirées à la main, mais cela nécessite un ensemble de compétences qui ne sont pas disponibles dans la plupart des laboratoires.
6. Microinjection d’embryons
- Utilisez une pointe de micro-chargeur pour remplir les aiguilles avec 2 μL de mélange d’ADN. Insérez l’aiguille dans le porte-aiguille et connectez le tube de pompe à pression automatisé (Figure 8).
- Important : Alignez l’aiguille de manière à ce qu’elle fasse un angle de 15° avec le plan de la diapositive (Figure 8).
- Ouvrez la pointe de l’aiguille en touchant soigneusement le premier œuf et injectez-la en insérant la pointe de l’aiguille ≤ 10 μm dans le pôle postérieur. Une injection réussie entraînera un petit mouvement du cytoplasme dans l’œuf.
- Utilisez les commandes de l’étape coaxiale du microscope pour passer à l’œuf suivant afin de poursuivre l’injection.
- Pour vous assurer que la pointe de l’aiguille reste ouverte et ne s’est pas bouchée, appuyez sur le bouton Injecter avant d’entrer dans un autre embryon et visualisez la petite gouttelette à l’ouverture de l’aiguille.
- Si l’aiguille est bouchée, appuyez sur le bouton Effacer pour effacer l’aiguille et répétez le test de visualisation des gouttelettes. Ajustez la pression au besoin si l’ouverture de la pointe de l’aiguille devient légèrement plus grande pour vous assurer que la taille de la gouttelette reste petite.
- Injecter environ 40 à 50 œufs avec une aiguille.
REMARQUE: Assurez-vous que le papier filtre reste humide en tout temps. Maintenez une contre-pression suffisante sur l’aiguille pour la garder dégagée. Une aiguille qui ne peut pas être débouchée doit être remplacée par une nouvelle aiguille. Le placement de l’embryon, l’insertion de l’aiguille et l’injection sont facilités par des microscopes dotés de contrôles coaxiaux pour le mouvement horizontal de la scène (Figure 9).
- Une fois les injections terminées, rincer les œufs dans un récipient en verre tapissé de papier filtre et rempli de 50 mL de H2Odésionisé(figure 10).
REMARQUE: Les embryons commenceront à éclore 2 jours après l’injection et peuvent prendre jusqu’à 3-5 jours. Les larves du premier stade éclos doivent être transférées immédiatement (vérifier 2 fois par jour) dans un récipient propre avec de l’eau et de la nourriture.
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Representative Results
Un exemple représentatif de l’application du protocole de microinjection décrit peut être trouvé dans Carballar-Lejarazú et al5. L’intention ici était d’insérer un système de forçage génétique autonome dans la lignée germinale d’une souche de laboratoire, G3, d’An. gambiae. Le système a été conçu pour cibler le locus orthologue cardinal (Agcd)sur le troisième chromosome de cette espèce, qui code une peroxydase hémique qui catalyse la conversion de la 3-hydroxykynurénine en xanthommatine, dernière étape de la biosynthèse ommochrome (Figure 11). Les moustiques homozygotes contenant le forçage génétique sont des mutants cardinaux en perte de fonction avec des larves, des nymphes et des adultes nouvellement émergés ayant un phénotype des yeux rouges. Un plasmide, pCO37, contenant le système d’entraînement exprime l’endonucléase Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) sous le contrôle des éléments régulateurs de l’orthologue du gène An. gambiae nanos, un ARN guide de 23 nucléotides (aRNg) sous le contrôle d’un promoteur du gène An. gambiae U6 et une cassette de marqueur dominant 3XP3-CFP exprimant la protéine fluorescente cyan pour identifier la progéniture transgénique. Agcd Les fragments d’ADN homologues aux régions génomiques flanquant le site de coupe cible de l’ARNg permettent une intégration médiée par la réparation dirigée par l’homologie (HDR).
Sept cent quatre-vingts embryons d’An. gambiae de type sauvage ont été injectés avec le plasmide pCO37 ainsi que la protéine SpCas9. Cent quarante-six embryons injectés (18,7 %; G0) ont survécu jusqu’au stade adulte et ont été croisés par la suite à des membres de type sauvage du sexe opposé. Le dépistage au microscope fluorescent de la descendance de la prochaine génération (G1)a permis d’identifier trois des 3 428 (0,09 %) qui étaient positifs pour le gène marqueur de la CFP, dont seulement deux, un homme et une femme, ont survécu. Les approches moléculaires (amplification génique, séquençage de l’ADN) ont permis de vérifier l’insertion précise d’environ 10 kb d’ADN et la souche résultante a été désignée AgNosCd-1. Des analyses de suivi approfondies ont montré que l’AgNosCd-1 était très efficace à l’entraînement, créait peu d’allèles résistants et n’avait pas de charge génétique majeure (coûts de remise en forme) en raison de l’intégration et de l’expression du système de forçagegénétique 5. Le plasmide pCO37 sert d’épine dorsale au développement de souches de modification de la population d’An. gambiae pour prévenir la transmission du parasite du paludisme.
Figure 1: Dispositif de collecte des œufs. Le dispositif de collecte des œufs est composé de papier filtre, d’un maillage en nylon, d’un film dentaire et d’un tube conique de 50 mL modernisé. L’appareil permet aux moustiques d’être déposés par aspirateur en toute sécurité dans le récipient via la fente dans le film dentaire. Le papier filtre et la maille en nylon permettent d’absorber l’eau, ce qui fournit une surface humide, mais non inondée, pour la ponte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Embryons d’anophèles gambiens. A) Lot d’embryons à différents stades de maturation. B)Les flèches indiquent le pôle postérieur, l’emplacement dans l’embryon qui contient des cellules germinales, qui sont les cibles prévues pour la transformation. La barre d’échelle représente ~1 mm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Collecte d’œufs. Une fois que les moustiques sont placés à l’intérieur du dispositif de collecte d’œufs, il est déplacé vers une boîte de Petri contenant une couche de papier filtre humidifiée avec ddH2O. Ajustez le volume d’eau de sorte que le niveau d’eau monte à ~ 1/4 de la hauteur du bouchon. Le dispositif de collecte des œufs et la boîte de Petri sont ensuite placés dans un incubateur sombre et les moustiques sont autorisés à ovipositer pendant un total de 45 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Développement embryonnaire. Les embryons ne peuvent être injectés que pendant une courte période. Les œufs injectés prématurément dans le développement sont trop délicats et subiront des dommages et n’éclosent pas. Les œufs qui sont injectés plus tard dans leur développement deviennent durcis et peuvent casser l’aiguille, ce qui provoque l’injection de trop de matériel génétique dans l’œuf. De plus, les injections plus tard dans le développement sont moins susceptibles de provoquer des changements permanents dans la lignée germinale, car les cellules polaires subissent rapidement une réplication et une différenciation supplémentaires. Des photos ont été prises toutes les 10 minutes après un temps de ponte de 45 min. Les astérisques (*) indiquent les ovules qui conviennent à l’injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Assemblage de la glissière de membrane. Les œufs sont alignés le long de la membrane en nylon, ce qui fournit une structure de soutien afin que les œufs ne bougent pas pendant le processus d’injection. Le papier filtre sert de réservoir d’eau pour s’assurer que les œufs restent humides tout au long de l’injection. Placez le papier filtre et la membrane en nylon près du bord de la lame de verre en laissant de la place pour les œufs et l’eau qui les submerge. Si la membrane et le papier filtre sont trop éloignés du bord de la lame, il sera difficile d’obtenir le bon angle entre les embryons et l’aiguille. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Orientation de l’embryon pour la microinjection. A)Les embryons sont alignés avec les pôles postérieurs plus bas que l’antérieur, coulant le long de la membrane. B)Les embryons sont immergés dans l’eau; ajuster la largeur de la ligne d’eau au-dessus de l’œuf pour qu’elle soit d’environ un huitième à un quart de la largeur d’un embryon moyen. C) Image en gros plan de l’angle de l’aiguille avec des embryons. La barre d’échelle représente ~1 mm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 7: Embryons anormaux. Les embryons qui semblent anormaux dans la coloration ou la texture n’éclosent pas; ne les injectez pas. Les embryons de couleur jaune ne se mélanisseront pas correctement. Une réduction de l’éclosion a également été observée chez les embryons lisses qui n’ont pas de coquilles d’œufs d’apparence normale (cuticules). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8: Position de l’aiguille pendant les micro-injections. A) Vue grand angle de l’étage d’injection. B,C) Positionnez l’aiguille de manière à ce que les embryons alignés forment un angle de 15° avec l’aiguille d’injection. N’élevez pas le bras de l’instrument de micro-injection qui maintient l’aiguille beaucoup plus haut que l’étage du microscope pour assurer une bonne inclinaison entre l’aiguille et la lame contenant les embryons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9: Commandes coaxiales et porte-aiguille. A) Les commandes coaxiales (flèche) permettent un mouvement en 3 dimensions de l’aiguille pour assurer un placement précis de l’aiguille pour chaque injection. Il est important d’utiliser des commandes coaxiales pour soulever l’aiguille verticalement lors de la commutation des glissières afin que l’aiguille n’entre pas en collision avec la nouvelle glissière lors de sa mise en place sur la scène. Les contrôles coaxiaux latéraux permettent une pénétration précise de l’aiguille dans le pôle postérieur. B) Image du porte-aiguille montrant l’angle d’injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10: Chambre pour l’éclosion des œufs. A,B) Laver soigneusement les embryons injectés dans un récipient cylindrique rempli à un quart de profondeur avec de l’eau double distillée et tapissé de papier filtre. C,D) Le mouvement du récipient fait que les œufs adhèrent naturellement au papier filtre. Avant de quitter le récipient pour l’éclosion, assurez-vous que tous les œufs qui ont adhéré plus haut dans le papier filtre sont doucement lavés jusqu’au niveau de l’eau. L’ovale bleu marque un certain nombre d’œufs déposés pour montrer la taille relative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 11. Ortholog du gène anopheles gambiae cardinal (Agcd), construction du forçage génétique pCO37 et phénotypes résultants. Top) Gène Agcd: blocs marron, exons (E1-4); blocs vides, régions non traduites 3' et 5(UTR); ligne noire épaisse, introns et ADN intergénique. Plasmide pCO37 moyen : bras d’homologie du gène Agcd : blocs marrons, blocs bleus, composants du gène marqueur dominant (3XP3 et CFP) ; blocs de bronzage, composants d’entraînement (promoteurnanos et séquences codant pour la protéine SpCas9); blocs verts, composants d’ARN guides (promoteur U6 et séquence d’ARNg). Les gènes et les caractéristiques de pCO37 ne sont pas à l’échelle. La recombinaison (flèches marrons) résultant de la réparation dirigée par homologie (HDR) initiée au site de coupe médié par SpCaS9/gRNA (pointe de flèche verte) entraîne l’intégration de la construction du forçage génétique. En bas) les phénotypes visibles résultants de l’intégration du forçage génétique : (à gauche) CFP+ (flèche blanche/bleue) et phénotypes homozygotes Agcd-mutant(flèche rouge) chez les larves et phénotypes Agcd-mutants (flèche rouge) chez les pupes. (à droite) Phénotype mutant Agcd homozygote « œil rouge » chez l’adulte. Adapté de Carballar-Lejarazú et al. (2020) et utilisé avec la permission5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Grâce à la disponibilité accrue de technologies de génie génétique précises et flexibles telles que CRISPR/Cas9, les organismes transgéniques peuvent être développés de manière plus simple et plus stable qu’auparavant. Ces outils ont permis aux chercheurs de créer des souches transgéniques de moustiques vecteurs qui sont très proches d’atteindre les propriétés souhaitées de réfractaire aux agents pathogènes (modification de la population) ou de stérilité héréditaire (suppression de la population). Cependant, pour développer les moustiques génétiquement modifiés les plus sûrs et les plus stables possibles, des lignées transgéniques supplémentaires doivent être créées et évaluées afin que les lignées optimales soient sélectionnées pour les études sur le terrain. Le protocole décrit peut augmenter l’efficacité de la génération de transgéniques Anopheles gambiae afin que d’autres candidats puissent être développés pour les stratégies de modification et de suppression de la population.
La procédure de micro-injection décrite utilise de l’équipement et du matériel qui sont probablement disponibles dans un laboratoire qui effectue régulièrement des microinjections de moustiques ou d’autres vecteurs arthropodes. Il est important de maintenir l’attention aux détails tout au long du protocole. Se précipiter à travers des étapes telles que la sélection des œufs par qualité ou sauter des étapes telles que la deuxième précipitation de l’ADN nuira aux résultats et entraînera une réduction de l’éclosion et de l’efficacité de la transformation. En outre, de nombreuses difficultés avec la procédure peuvent survenir si des précautions ne sont pas prises dans l’élevage des moustiques. Les moustiques qui sont élevés dans des conditions de surpeuplement ou avec un manque de nutriments pondront moins d’œufs de moins bonne qualité14, ce qui crée des goulots d’étranglement dans le flux de travail de micro-injection et augmentera le temps nécessaire pour atteindre un nombre souhaité d’embryons injectés.
Contrairement aux méthodes décrites pour la microinjection d’Anopheles stephensi12, cetteméthode ne nécessite pas d’immersion dans l’huile des embryons et plus d’embryons peuvent être injectés en moins de temps sans les étapes supplémentaires requises par la méthode à base d’huile. Une limitation de cette méthode par rapport à la méthode à base d’huile est une visualisation plus médiocre tout au long du processus de micro-injection. Pour s’assurer que le matériel d’injection ou le cytoplasme embryonnaire ne retourne pas dans l’aiguille, il faut garder l’attention sur la contre-pression de l’aiguille en tout temps tout au long du processus d’injection.
Le vecteur africain du paludisme a été historiquement difficile à manipuler génétiquement par rapport à d’autres Anopheles spp., mais il est le plus grand contributeur aux cas de paludisme dans le monde. De nouveaux outils sont nécessaires pour aider les efforts d’élimination du paludisme et les moustiques transgéniques conçus pour modifier ou supprimer les populations de moustiques peuvent jouer un rôle important dans la réalisation de l’élimination. Afin de sélectionner les meilleurs candidats transgéniques pour les études d’élimination du paludisme sur le terrain, un certain nombre de lignées doivent être évaluées afin qu’elles puissent être comparées et sélectionnées pour une efficacité et une sécurité optimales15. Les blocs de construction génétiques et moléculaires nécessaires pour créer des lignées transgéniques avec une réfractaire ou une suppression accrue sont caractérisés et disponibles. Ce protocole aidera à augmenter la vitesse à laquelle ces lignes réfractaires ou suppressives peuvent être créées afin que les efforts de validation puissent commencer à sélectionner un candidat pour des essais sur le terrain dans un proche avenir.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell et Madeline Nottoli pour l’élevage des moustiques. Le financement a été fourni par l’Université de Californie, Irvine Malaria Initiative. AAJ est professeur Donald Bren à l’Université de Californie à Irvine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
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