Summary
Mikroinjektionstechniken sind unerlässlich, um exogene Gene in die Genome von Moskitos einzuführen. Dieses Protokoll erklärt eine Methode, die vom James-Labor verwendet wird, um DNA-Konstrukte in Anopheles gambiae-Embryonen zu mikroinjizieren, um transformierte Moskitos zu erzeugen.
Abstract
Embryo-Mikroinjektionstechniken sind für viele molekulare und genetische Studien von Insektenarten unerlässlich. Sie bieten ein Mittel, um exogene DNA-Fragmente, die für interessante Gene sowie günstige Merkmale kodieren, stabil und vererbbar in die Keimbahn des Insekts einzuführen. Die resultierenden transgenen Stämme können auf phänotypische Veränderungen untersucht werden, die sich aus der Expression der integrierten DNA ergeben, um grundlegende Fragen zu beantworten oder in praktischen Anwendungen verwendet zu werden. Obwohl die Technologie unkompliziert ist, erfordert sie vom Ermittler Geduld und Übung, um ein Maß an Fähigkeiten zu erreichen, das die Effizienz maximiert. Hier ist eine Methode zur Mikroinjektion von Embryonen der afrikanischen Malariamücke, Anopheles gambiae, gezeigt. Ziel ist es, durch Mikroinjektion exogene DNA an den Embryo abzugeben, so dass sie in den sich entwickelnden Keimbahnzellen (Polzellen) aufgenommen werden kann. Die Expression von Transposasen, Integrasen, Rekombinasen oder anderen Nukleasen (z. B. CRISPR-assoziierte Proteine, Cas) aus der injizierten DNA kann Ereignisse auslösen, die zu ihrer kovalenten Insertion in Chromosomen führen. Transgene An. gambiae, die aus diesen Technologien erzeugt werden, wurden für grundlegende Studien von Komponenten des Immunsystems, Genen, die an der Bluternährung beteiligt sind, und Elementen des olfaktorischen Systems verwendet. Darüber hinaus wurden diese Techniken verwendet, um An. gambiae-Stämme mit Merkmalen herzustellen, die dazu beitragen können, die Übertragung von Malariaparasiten zu kontrollieren.
Introduction
Mikroinjektionstechniken werden seit den frühen 1900er Jahren verwendet, um Organismen experimentell zu manipulieren1. Die Mikroinjektion wurde verwendet, um sowohl grundlegende biologische Funktionen zu untersuchen als auch / oder wichtige Veränderungen in der Biologie eines gewünschten Organismus einzuführen. Die Mikroinjektionstechnik war für Vektorbiologen von besonderem Interesse und wurde häufig zur Manipulation von Vektorgenomen2-11eingesetzt. Transgenese-Experimente an Arthropodenvektoren zielen oft darauf ab, Vektoren bei der Übertragung von Krankheitserregern weniger effizient zu machen, indem sie entweder Änderungen vornehmen, die die Fitness eines Vektors verringern, oder die Refraktivität gegenüber den von ihnen übertragenen Krankheitserregern erhöhen. Mücken übertragen eine Vielzahl von menschlichen Krankheitserregern und haben weltweit einen erheblichen Einfluss auf Morbidität und Mortalität. Die Anopheles-Mückengattung überträgt die parasitären Erreger Plasmodium spp. Gentechnische Experimente mit Anopheles zielten darauf ab, die Biologie besser zu verstehen und die vektorielle Kapazität dieser Moskitos zu reduzieren, um neuartige Strategien zur Eliminierung von Malaria zu entwickeln.
Die Mückenvektoren, die weltweit die meisten Malariainfektionen verursachen, befinden sich im Anopheles gambiae-Artenkomplex. Die meisten erfolgreichen Transgenese-Experimente wurden jedoch am Malaria-Vektor des indischen Subkontinents, Anopheles stephensi,durchgeführt. Während es viele laborangepasste Anopheles gambiae-Stämme gibt, ist die Anzahl der transgenen Anopheles gambiae spp.-Linien, die in der Literatur berichtet werden, nicht mit der von Anopheles stephensivergleichbar. Es wird angenommen, dass der Embryo von Anopheles gambiae schwieriger zu injizieren und eine erfolgreiche Transgenese zu erreichen ist als Anopheles stephensi, obwohl die Gründe für diese Unterschiede unbekannt sind. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die sich bei der Transgenese von Anopheles gambiae-Embryonen durch Mikroinjektion als durchgängig erfolgreich erwiesen hat. Das Protokoll basiert auf einer Methode, die zuvor von Hervé Bossin und Mark Benedict12 entwickelt wurde, wobei einige zusätzliche Details und Änderungen hinzugefügt wurden, die die Effizienz der Transgenese erhöhen.
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Protocol
1. Moskitos für die Mikroinjektion vorbereiten
- Säen Sie einenKäfig 13 (~ 5000 cm3)mit ~ 100 männlichen und 200-300 weiblichen 1-2 Tage erwachsenen Mücken nach der Eklosion und lassen Sie sie sich für 2 Tage paaren.
- Nach der Paarungszeit stellen Sie den Moskitos eine Blutmahlzeit mit entweder 2 ml Blut mit einem künstlichen Fütterungsgerät oder lebenden betäubten Tieren zur Verfügung, abhängig von den Insektationspraktiken14. Am nächsten Tag stellen Sie moskitos eine zweite Blutmahlzeit zur Verfügung, um sicherzustellen, dass alle verpaarten Weibchen die Möglichkeit hatten, sich zu ernähren und dass teilweise gefütterte Moskitos vollständig verstopft sind.
- Verwenden Sie die Moskitos für die Embryonenentnahme 2-4 Tage nach der zweiten Blutmahlzeit.
HINWEIS: Die Larvenernährung ist wichtig für die Robustheit und reproduktive Fitness von Erwachsenen. Siehe Benedict et al. (2020) für Informationen darüber, wie man gesunde Insekten aufzieht14. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Eiablage beobachtet, wenn Moskitos mit einem künstlichen Futter gefüttert werden oder lebende anästhesierte Tiere leben. Verwenden Sie die Methode, die routinemäßig für Anopheles gambiae im Insektarium verwendet wird.
2. Embryonalisierung
- Verwenden Sie einen Sauger, um 20-30 Weibchen in ein transparentes konisches 50-ml-Rohr zu legen, das (mit einer Bandsäge) geschnitten wurde, um an beiden Enden offen zu sein, und an einem Ende mit Latex-Dentalfolie und am anderen Ende mit Nylongewebe und Filterpapier bedeckt ist (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Moskitos deponieren ihre Eier auf dem Filterpapier und das Nylonnetz hält das Filterpapier sicher an Ort und Stelle. Mückeneier haben eine zylindrische Form, sind ~ 500 μm lang, an ihrer breitesten Stelle einen Durchmesser von ~ 200 μm und verjüngen sich an den vorderen und hinteren Enden (Abbildung 2). - Legen Sie das mit Mücken gefüllte Röhrchen in eine kleine (60 mm x 15 mm) Petrischale, die mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2 O)gefüllt ist. Das Röhrchen und die Schale 45 min lang bei 28 °C in einen Inkubator geben (Abbildung 3).
- Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Inkubator und führen Sie das Röhrchen in einen leeren Käfig ein. Klopfen Sie vorsichtig auf die Röhre, damit moskitos herausfliegen können, und entfernen Sie die Röhre aus dem Käfig, sobald alle Moskitos herausgeflogen sind.
- Wenn das Röhrchen frei von Moskitos ist, schrauben Sie den unteren Ring ab, entfernen Sie das Nylon und entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Filterpapier mit den Eiern aus dem Röhrchen. Legen Sie das Filterpapier in eine Kunststoff-Petrischale (100 mm x 15 mm), die eine mit ddH2O angefeuchtete Schicht Filterpapier enthält.
- Beobachten Sie die Eier. Eier, die bis zu dem Punkt gealtert sind, an dem sie hellgrau gefärbt sind (Abbildung 4), sind bereit für die Ausrichtung.
- Wenn die Eier noch weiß sind, bringen Sie sie in den Inkubator zurück und überprüfen Sie die Farbe alle 5 Minuten. Weiße Eier sind zerbrechlich, brechen leicht und überleben nach dem Injektionsprozess nicht gut, was zu einem geringen Schlüpfen führt.
- Eier, die dunkelgrau oder schwarz sind, sind zu stark gealtert. Verwenden Sie sie nicht.
3. Ausrichtung des Embryos
- Schneiden Sie ein Stück Nylon-Löschmembran (2 cm x 1 cm) mit einer Rasierklinge ab und achten Sie darauf, dass der Rand ordentlich beschnitten ist.
HINWEIS: Wenn der Rand nicht gerade ist, bleiben die Eier während des Injektionsprozesses nicht richtig an der Membran befestigt. - Legen Sie eine Membran auf einen Glasobjektträger und bedecken Sie die Membran mit einem Stück Filterpapier (2 cm x 2 cm), wobei ~ 1 mm des Membranfilters unbedeckt bleiben (Abbildung 5).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Objektträger vor dem Gebrauch sauber sind, und verwenden Sie eine saubere Pinzette, um den Membranfilter zu manipulieren. - Befeuchten Sie das Filterpapier mit entionisiertemH2O,da Eier bei längerem Austrocknen absterben.
HINWEIS: Geben Sie nicht zu viel Wasser auf das Papier, da sich die Embryonen während des Injektionsprozesses bewegen, aber stellen Sie sicher, dass genügend vorhanden ist, um das Austrocknen des Embryos zu verhindern (Abbildung 6A, B). Überschüssiges Wasser kann entfernt werden, indem es mit einem Stück Filterpapier absorbiertwird. - Übertragen Sie vorsichtig 30-50 Embryonen mit einem Pinsel (Größe #0) an den Rand der Membran. Verwenden Sie die Bürste, um die Eier vertikal entlang der Membran auszurichten, indem Sie sie vorsichtig auf dem Objektträger überrollen, so dass die ventrale Seite (konvex) nach oben zeigt.
- Richten Sie alle Eier in die gleiche Richtung aus, so dass bei der Beobachtung der Eier unter dem Mikroinjektionsmikroskop das hintere Ende (spitzer, Abbildung 6A, B) in einer abwärts gerichteten Position ist und mit der Nadel einen Winkel von ~15° bildet ( Abbildung6C). Den gesamten Rand der Membran mit Eiern (30-50) auskleiden und den Objektträger zur Injektion unter das Mikroskop legen.
HINWEIS: Wählen Sie die Eier sorgfältig aus. Verwerfen Sie diejenigen, die weiß (zu jung oder unentwickelt) oder dunkelgrau (zu alt und brechen die Nadel) sind, und die abnormalen (Abbildung 7). Achten Sie darauf, dass das Filterpapier immer feuchtbleibt.
4. DNA-Präparation
- Reinigen Sie Plasmid-DNAs zur Injektion mindestens mit einem endotoxinfreien DNA-Plasmid-Maxiprep-Kit gemäß den Protokollen des Herstellers.
- Resuspendieren Sie die DNA in PCR-Wasser und zentrifugieren Sie bei 17.100 x g in einer gekühlten Zentrifuge für 30 min bei 4 °C. Übertragen Sie dann den Überstand auf ein neues, sauberes 1,5 ml konisches Rohr. Vorsichtig Mikropipette, um unerwünschte Partikel aus der Säule zu vermeiden.
- Führen Sie eine zweite Fällung der DNA mit einem Zehntel Volumen von 3M Natriumacetat und einem zweifachen Volumen von 100% Ethanol durch.
- Resuspendieren Sie die DNA in 300-500 μL PCR-Wasser für eine endgültige Plasmidkonzentration von 1000 ng / μL. Mischen Sie den Plasmidcocktail im Injektionspuffer für eine endgültige Plasmidkonzentration von 300-400 ng / μL und machen Sie 10-20 μL Aliquots.
HINWEIS: DNA kann bei -20 °C gespeichert werden. DNA-Mikroinjektions-Aliquots können bei -20 °C oder bei -80 °C gespeichert werden, wenn RNA-Komponenten verwendet werden. Überschreiten Sie nicht 800 ng / μL DNA in der Injektionsmischung, da die Viskosität dazu führt, dass die Nadeln verstopfen.
5. Nadelvorbereitung
- Machen Sie die Nadeln, indem Sie 10 cm Quarzkapillaren mit einem programmierbaren Mikropipettenabzieher ziehen.
- Untersuchen Sie die Nadel unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Spitze gut geformt ist. Stellen Sie sicher, dass die Nadeleinstellung am programmierbaren Abzieher eine Spitze ergibt, die sich ~0,5 mm vom Klemmenende entfernt zu verjüngen beginnt und in einem feinen Punkt endet (siehe Abbildung 6). Nadeln, die leicht brechen, haben normalerweise eine zu lange Verjüngung.
HINWEIS: Die Bedingungen können je nach Nadelzieher unterschiedlich sein (Die Autoren stellen auf Anfrage die Einstellungen für den von ihnen verwendeten programmierbaren Abzieher zur Verfügung. Zeitschriftenbeschränkungen hindern uns daran, eine bestimmte Marke zu zitieren). Nadeln können von Hand gezogen werden, aber dies erfordert Fähigkeiten, die in den meisten Labors nicht verfügbar sind.
6. Embryo-Mikroinjektion
- Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um die Nadeln mit 2 μL DNA-Mischung zu füllen. Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein, und schließen Sie den Schlauch der automatischen Druckpumpe an (Abbildung 8).
- Wichtig: Richten Sie die Nadel so aus, dass sie einen Winkel von 15° mit der Ebene des Objektträgers bildet (Abbildung 8).
- Öffnen Sie die Nadelspitze, indem Sie das erste Ei vorsichtig berühren, und injizieren Sie es, indem Sie die Nadelspitze ≤ 10 μm in die hintere Stange einführen. Eine erfolgreiche Injektion führt zu einer kleinen Bewegung des Zytoplasmas innerhalb des Eies.
- Verwenden Sie die koaxialen Stufensteuerungen des Mikroskops, um zum nächsten Ei zu gelangen, um die Injektion fortzusetzen.
- Um sicherzustellen, dass die Nadelspitze offen bleibt und nicht verstopft ist, drücken Sie die Injektionstaste, bevor Sie in einen anderen Embryo eintreten, und visualisieren Sie den kleinen Tröpfchen an der Öffnung der Nadel.
- Wenn die Nadel verstopft ist, drücken Sie die Clear-Taste, um die Nadel zu löschen und den Tröpfchenvisualisierungstest zu wiederholen. Stellen Sie den Druck nach Bedarf ein, wenn die Nadelspitzenöffnung etwas größer wird, um sicherzustellen, dass die Größe des Tröpfchens klein bleibt.
- Injizieren Sie ~ 40-50 Eier mit einer Nadel.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier immer feucht bleibt. Halten Sie ausreichend Gegendruck auf die Nadel, um sie frei zu halten. Eine Nadel, die nicht verstopft werden kann, muss durch eine neue Nadel ersetzt werden. Die Platzierung des Embryos, das Einführen der Nadel und die Injektion werden durch Mikroskope erleichtert, die über koaxiale Kontrollen für die horizontale Bewegung des Stadiums verfügen (Abbildung 9).
- Nachdem die Injektionen abgeschlossen sind, spülen Sie die Eier in einen mit Filterpapier ausgekleideten Und mit 50 ml entionisiertemH2Ogefüllten Glasbehälter ab (Abbildung 10).
HINWEIS: Embryonen beginnen 2 Tage nach der Injektion zu schlüpfen und können bis zu 3-5 Tage dauern. Geschlüpfte Larven im ersten Stadium müssen sofort (2-mal täglich) in einen sauberen Behälter mit Wasser und Futter überführt werden.
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Representative Results
Ein repräsentatives Beispiel für die Anwendung des beschriebenen Mikroinjektionsprotokolls findet sich in Carballar-Lejarazú et al5. Die Absicht dabei war, ein autonomes Gene-Drive-System in die Keimbahn eines Laborstamms, G3, von An. gambiaeeinzufügen. Das System wurde entwickelt, um den Kardinalortholog locus (Agcd) auf dem dritten Chromosom dieser Spezies anzusprechen, der für eine Hämperoxidase kodiert, die die Umwandlung von 3-Hydroxykynurenin in Xanthommatin katalysiert, den letzten Schritt in der Ommochrom-Biosynthese ( Abbildung11). Homozygote Gene Drive-haltige Moskitos sind funktionsschwache Kardinalmutanten mit Larven, Puppen und neu aufgetauchten Erwachsenen mit einem Rote-Augen-Phänotyp. Ein Plasmid, pCO37, das das Antriebssystem enthält, exprimiert Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) Endonuklease unter Kontrolle der regulatorischen Elemente des An. gambiae nanos Genorthologs, eine 23-Nukleotid-Leit-RNA (gRNA) unter der Kontrolle eines An. gambiae U6-Genpromotors und einer 3XP3-CFP-dominanten Markerkassette, die das cyan fluoreszierende Protein zur Identifizierung transgener Nachkommen exprimiert. Agcd DNA-Fragmente, die homolog zu genomischen Regionen sind und die gRNA-Zielschnittstelle flankieren, ermöglichen eine homologiegesteuerte Reparatur (HDR) vermittelte Integration.
Siebenhundertachtzig Wildtyp-An. gambiae-Embryonen wurden mit dem pCO37-Plasmid zusammen mit dem SpCas9-Protein injiziert. Einhundertsechsundvierzig injizierte Embryonen (18,7%; G0) überlebten bis ins Erwachsenenstadium und wurden anschließend wildtypischen Mitgliedern des anderen Geschlechts ausgekreuzt. Das Fluoreszenzmikroskop-Screening der Nachkommen der nächsten Generation (G1)identifizierte drei von 3.428 (0,09%), die positiv auf das CFP-Markergen waren, von denen nur zwei, ein Mann und eine Frau, überlebten. Molekulare Ansätze (Genamplifikation, DNA-Sequenzierung) bestätigten die genaue Insertion von ~ 10 kb DNA und der resultierende Stamm wurde als AgNosCd-1 bezeichnet. Umfangreiche Folgeanalysen zeigten, dass AgNosCd-1 durch die Integration und Expression des Gene-Drive-Systems hocheffizient im Antrieb war, nur wenige resistente Allele erzeugte und keine größere genetische Belastung (Fitnesskosten) aufwies5. Das pCO37-Plasmid dient als Rückgrat für die Entwicklung von Populationsmodifikationsstämmen von An. gambiae, um die Übertragung von Malariaparasiten zu verhindern.
Abbildung 1: Gerät zum Sammeln von Eiern. Das Eizellsammelgerät besteht aus Filterpapier, Nylongewebe, Dentalfolie und einem nachgerüsteten 50 ml konischen Rohr. Das Gerät ermöglicht es, Moskitos per Aspirator über den Schlitz in der Zahnfolie sicher in den Behälter zu legen. Das Filterpapier und das Nylongewebe ermöglichen die Aufnahme von Wasser, was eine feuchte, aber nicht überflutete Oberfläche für die Eiablage bietet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Anopheles gambiae Embryonen. A)Eine Charge von Embryonen in unterschiedlichen Stadien der Reifung. B) Die Pfeile zeigen den hinteren Pol an, die Position innerhalb des Embryos, die Keimbahnzellen enthält, die die beabsichtigten Ziele für die Transformation sind. Der Maßstabsbalken stellt ~1 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Eizellentnahme. Sobald die Moskitos in die Eiersammelvorrichtung gelegt wurden, wird sie in eine Petrischale gebracht, die eine Schicht Filterpapier enthält, die mit ddH2O angefeuchtet ist. Das Eizellentnahmegerät und die Petrischale werden dann in einen abgedunkelten Inkubator gelegt und moskitos dürfen insgesamt 45 minuten lang ovipositieren.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Embryonalentwicklung. Die Embryonen sind nur während eines kurzen Zeitfensters für die Injektion geeignet. Eier, die vorzeitig in die Entwicklung injiziert werden, sind zu empfindlich und erleiden Schäden und schlüpfen nicht. Eier, die später in ihrer Entwicklung injiziert werden, werden verhärtet und können die Nadel brechen, wodurch zu viel genetisches Material in das Ei injiziert wird. Darüber hinaus ist es weniger wahrscheinlich, dass Injektionen später in der Entwicklung dauerhafte Veränderungen der Keimbahn verursachen, da Die Polzellen schnell einer weiteren Replikation und Differenzierung unterzogen werden. Die Bilder wurden alle 10 Minuten nach der Eiablagezeit von 45 Minuten aufgenommen. Die Sternchen (*) zeigen Eier an, die zur Injektion geeignet sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Montage des Membranschlittens. Die Eier sind entlang der Nylonmembran ausgerichtet, die eine Stützstruktur bietet, so dass sich die Eier während des Injektionsprozesses nicht bewegen. Das Filterpapier dient als Wasserbehälter, um sicherzustellen, dass die Eier während der gesamten Injektion feucht bleiben. Legen Sie das Filterpapier und die Nylonmembran nahe an den Rand des Glasobjektträgers, um Platz für Eier und das Wasser zu schaffen, das sie eintaucht. Wenn die Membran und das Filterpapier zu weit vom Rand des Objektträgers entfernt sind, wird es schwierig sein, den richtigen Winkel zwischen Embryonen und Nadel zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Embryonenorientierung für die Mikroinjektion. A)Embryonen sind mit den hinteren Polen niedriger als die vorderen ausgerichtet und verlaufen die Membran hinunter. B)Die Embryonen werden in Wasser getaucht; Die Breite der Wasserlinie über dem Ei so einstellen, dass sie etwa ein Achtel bis ein Viertel der Breite eines durchschnittlichen Embryos beträgt. C) Nahaufnahme des Nadelwinkels mit Embryonen. Der Maßstabsbalken stellt ~1 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Abnormale Embryonen. Embryonen, die in Färbung oder Textur abnormal erscheinen, schlüpfen nicht; Injizieren Sie sie nicht. Embryonen, die gelb gefärbt sind, werden nicht richtig melanisieren. Ein reduziertes Schlüpfen wurde auch bei glatten Embryonen beobachtet, die keine normal aussehenden Eierschalen (Kutikula) haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Nadelposition während der Mikroinjektionen. A) Weitwinkelansicht der Injektionsstufe. B,C) Positionieren Sie die Nadel so, dass die ausgerichteten Embryonen mit der Injektionsnadel einen Winkel von 15° bilden. Heben Sie den Arm des Mikroinjektionsinstruments, der die Nadel deutlich höher als das Mikroskopstadium hält, nicht an, um ein ordnungsgemäßes Angeln zwischen der Nadel und dem Objektträger mit den Embryonen zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Koaxiale Steuerungen und Nadelhalter. A) Die koaxialen Bedienelemente (Pfeil) ermöglichen eine 3-dimensionale Bewegung der Nadel, um eine präzise Platzierung der Nadel für jede Injektion zu gewährleisten. Es ist wichtig, koaxiale Bedienelemente zu verwenden, um die Nadel beim Wechseln der Dias vertikal anzuheben, damit die Nadel beim Einsetzen auf der Bühne nicht mit dem neuen Objektträger kollidiert. Laterale koaxiale Steuerungen ermöglichen ein genaues Eindringen der Nadel in den hinteren Pol. B) Bild des Nadelhalters mit Dem Winkel für die Injektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Kammer zum Ausbrüten von Eiern. A,B) Die injizierten Embryonen werden vorsichtig in einen zylindrischen Behälter gewaschen, der bis zu einer Vierteltiefe mit doppelt destilliertem Wasser gefüllt und mit Filterpapier ausgekleidet ist. C,D) Die Bewegung des Behälters bewirkt, dass die Eier auf natürliche Weise am Filterpapier haften. Bevor Sie den Behälter zum Schlüpfen verlassen, stellen Sie sicher, dass alle Eier, die weiter oben auf dem Filterpapier haften, vorsichtig wieder auf Wasserniveau gespült werden. Das blaue Oval markiert eine Anzahl von abgelegten Eiern, um die relative Größe anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 11. Anopheles gambiae cardinal (Agcd) Genortholog, pCO37 Gene Drive Konstrukt und daraus resultierende Phänotypen. Oben) Agcd-Gen: kastanienbraune Blöcke, Exons (E1-4); leere Blöcke, 3'- und 5-unübersetzte Bereiche (UTR); dicke schwarze Linie, Introns und intergene DNA. Mitte) pCO37-Plasmid: Homologiearme aus dem Agcd-Gen: kastanienbraune Blöcke, blaue Blöcke, dominante Markergenkomponenten (3XP3 und CFP); Tan-Blöcke, Antriebskomponenten(Nanospromotor und SpCas9-Protein-kodierende Sequenzen); grüne Blöcke, leiten RNA-Komponenten (U6-Promotor und gRNA-Sequenz). Gene und Eigenschaften von pCO37 sind nicht maßstabsgetreu. Die Rekombination (kastanienbraune Pfeile) infolge einer homologiegerichteten Reparatur (HDR), die an der SpCaS9/gRNA-vermittelten Schnittstelle (grüne Pfeilspitze) eingeleitet wurde, führt zur Integration des Gene-Drive-Konstrukts. Unten) resultierende sichtbare Phänotypen der Gene-Drive-Integration: (links) CFP+ (weißer/blauer Pfeil) und homozygote Agcd-mutanten(roter Pfeil) Phänotypen in Larven und Agcd-mutierte(roter Pfeil) Phänotypen in Puppen. (rechts) Homozygoter Agcd-mutierter Phänotyp "rotes Auge" bei Erwachsenen. Adaptiert von Carballar-Lejarazú et al. (2020) und mit Genehmigung5verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Mit der erhöhten Verfügbarkeit präziser und flexibler gentechnischer Technologien wie CRISPR/Cas9 können transgene Organismen einfacher und stabiler als bisher entwickelt werden. Diese Werkzeuge haben es den Forschern ermöglicht, transgene Stämme von Mückenvektoren zu erzeugen, die den gewünschten Eigenschaften der Refraktärität gegenüber Krankheitserregern (Populationsmodifikation) oder der vererbbaren Sterilität (Populationsunterdrückung) sehr nahe kommen. Um jedoch möglichst sichere und stabilste gentechnisch veränderte Mücken zu entwickeln, müssen zusätzliche transgene Linien erstellt und bewertet werden, damit optimale Linien für Feldstudien ausgewählt werden. Das beschriebene Protokoll kann die Effizienz der Erzeugung von Anopheles gambiae-Transgenen erhöhen, so dass zusätzliche Kandidaten für Populationsmodifikations- und Unterdrückungsstrategien entwickelt werden können.
Das beschriebene Mikroinjektionsverfahren verwendet Geräte und Materialien, die wahrscheinlich in einem Labor verfügbar sind, das routinemäßig Mikroinjektionen von Moskitos oder anderen Arthropodenvektoren durchführt. Die Liebe zum Detail während des gesamten Protokolls ist wichtig. Das Überrennen von Schritten wie die Auswahl von Eiern nach Qualität oder das Überspringen von Schritten wie der zweiten DNA-Fällung beeinträchtigt die Ergebnisse und führt zu einem reduzierten Schlüpfen und einer verminderten Transformationseffizienz. Darüber hinaus können viele Schwierigkeiten mit dem Verfahren auftreten, wenn bei der Mückenhaltung keine Vorsicht geboten wird. Moskitos, die unter überfüllten Bedingungen oder mit einem Mangel an Nährstoffen aufgezogen werden, legen weniger Eier von schlechterer Qualität14, was zu Engpässen im Mikroinjektions-Workflow führt und die Zeit erhöht, die benötigt wird, um eine gewünschte Anzahl von injizierten Embryonen zu erreichen.
Im Gegensatz zu den für die Mikroinjektion von Anopheles stephensi12beschriebenen Methoden erfordert diese Methode kein Öluntertauchen der Embryonen und mehr Embryonen können in kürzerer Zeit ohne die zusätzlichen Schritte injiziert werden, die die ölbasierte Methode erfordert. Eine Einschränkung dieser Methode im Vergleich zur ölbasierten Methode ist eine schlechtere Visualisierung während des gesamten Mikroinjektionsprozesses. Um sicherzustellen, dass Injektionsmaterial oder embryonales Zytoplasma nicht in die Nadel zurückfließt, muss während des gesamten Injektionsprozesses stets auf den Gegendruck der Nadel geachtet werden.
Der afrikanische Malaria-Vektor war im Vergleich zu anderen Anopheles spp. historisch schwer genetisch zu manipulieren, ist jedoch der größte Beitrag zu Malariafällen weltweit. Neuartige Werkzeuge werden benötigt, um die Eliminierung von Malaria zu unterstützen, und transgene Moskitos, die dazu bestimmt sind, Mückenpopulationen entweder zu modifizieren oder zu unterdrücken, können eine wichtige Rolle bei der Eliminierung spielen. Um die besten transgenen Kandidaten für feldbasierte Malaria-Eliminationsstudien auszuwählen, sollte eine Reihe von Linien bewertet werden, damit sie verglichen und auf optimale Wirksamkeit und Sicherheit ausgewählt werden können15. Die genetischen und molekularen Bausteine, die benötigt werden, um transgene Linien mit erhöhter Refraktärität oder Unterdrückung zu erzeugen, sind charakterisiert und verfügbar. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, die Geschwindigkeit zu erhöhen, mit der diese feuerfesten oder unterdrückenden Linien erstellt werden können, so dass die Validierungsbemühungen in naher Zukunft beginnen können, um einen Kandidaten für Feldversuche auszuwählen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell und Madeline Nottoli für die Mückenhaltung. Die Finanzierung erfolgte durch die University of California, Irvine Malaria Initiative. AAJ ist Donald Bren Professor an der University of California, Irvine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
