Summary
טכניקות מיקרו-ג'ק-קציה חיוניות כדי להכניס גנים אקסוגניים לגנומים של יתושים. פרוטוקול זה מסביר שיטה המשמשת את מעבדת ג'יימס למיקרו-המצאת מבני DNA לעוברי אנופלס גמביה כדי ליצור יתושים שעברו טרנספורמציה.
Abstract
טכניקות מיקרו-הנדסה עובריות חיוניות למחקרים מולקולריים וגנטיים רבים של מיני חרקים. הם מספקים אמצעי להכניס שברי DNA אקסוגניים קידוד גנים של עניין, כמו גם תכונות חיוביות לתוך נבט חרקים בצורה יציבה תורשתית. זנים מהונדסים וכתוצאה מכך ניתן ללמוד עבור שינויים פנוטיפיים הנובעים הביטוי של ה- DNA המשולב כדי לענות על שאלות בסיסיות או בשימוש ביישומים מעשיים. למרות שהטכנולוגיה פשוטה, היא דורשת מהחוקר סבלנות ותרגול כדי להשיג רמה של מיומנות שממקסמת את היעילות. מוצג כאן שיטה למיקרו-ג'ק-קציה של עוברים של יתוש המלריה האפריקאי, אנופלס גמביה. המטרה היא לספק על ידי DNA אקסוגניים מיקרו-אינטג'ק לעובר, כך שניתן יהיה לקחת אותו בתאי הנבט המתפתחים (מוט). ביטוי מהדנ"א המוזרק של טרנספוזות, integrases, רקומבינות או גרעינים אחרים (לדוגמה חלבונים הקשורים CRISPR, Cas) יכול לעורר אירועים שמובילים להכנסה קוולנטית שלה לכרומוזומים. גמביה מהונדסת שנוצרה מטכנולוגיות אלה שימשה למחקרים בסיסיים של רכיבי מערכת החיסון, גנים המעורבים בהאכלת דם ואלמנטים של מערכת הריח. בנוסף, טכניקות אלה שימשו לייצור זני An. gambiae עם תכונות שעשויות לעזור לשלוט בהעברת טפילים מלריה.
Introduction
טכניקות מיקרו-ג'ק-קציה שימשו לתפעול ניסיוני של אורגניזמים מאז תחילת המאהה-20 . Microinjection שימש כדי ללמוד הן פונקציות ביולוגיות בסיסיות ו /או להציג שינויים חשובים בביולוגיה של אורגניזם הרצוי. טכניקת המיקרו-שיתוף הייתה מעניינת במיוחד ביולוגים וקטורים, והיא נמצאת בשימוש נרחב לתפעול גנומים וקטוריים2-11. ניסויי Transgenesis בווקטורים פרוקי רגליים לעתים קרובות שואפים להפוך וקטורים פחות יעילים בהעברת פתוגנים על ידי חקיקת שינויים שמקטינים את הכושר של וקטור או מגבירים את השחלה לפתוגנים שהם משדרים. יתושים מעבירים מגוון פתוגנים אנושיים ויש להם השפעה משמעותית על התחלואה והתמותה ברחבי העולם. סוג אנופלס של יתושים מעביר את הפתוגנים טפילים מלריה האנושית, פלסמודיום spp. ניסויים בהנדסה גנטית עם אנופלים נועדו להבין טוב יותר את הביולוגיה ולהפחית את היכולת הווקטורית של יתושים אלה במאמצים לפתח אסטרטגיות לחיסול מלריה חדשניות.
וקטורים יתושים התורמים ביותר זיהומים מלריה ברחבי העולם הם במתחם מינים אנופלס גמביה. עם זאת, רוב הניסויים הטרנסגנזה המוצלחים בוצעו על וקטור המלריה של תת היבשת ההודית, אנופלס סטיבנסי. בעוד שפע של זני אנופלס גמביה מותאמי מעבדה קיימים, מספר הקווים המהותניים של אנופלס גמביה spp. שדווחו בספרות אינו משתווה לזה של אנופלס סטיבנסי. הוא חשב כי אנופלס גמביה עובר קשה יותר להזריק ולהשיג טרנסגנזה מוצלחת מאשר אנופלס stephensi, אם כי הסיבות להבדלים אלה אינם ידועים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוכח כי היא מצליחה בעקביות בהשגת טרנסגנזה של עוברים אנופלס גמביה באמצעות מיקרו-ינון. הפרוטוקול מבוסס על שיטה שפותחה בעבר על ידי הרה בוסין ומארק בנדיקט12 עם כמה פרטים נוספים ושינויים שנוספו שנמצאו כמגבירים את היעילות של transgenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת יתושים למיקרו-ינון
- זרע כלוב13 (~ 5000 ס"מ3) עם ~ 100 זכר ו 200-300 נקבה 1-2 יום מבוגר יתושים לאחר אקסלציה ולאפשר להם להזדווג במשך 2 ימים.
- לאחר תקופת ההזדווגות, לספק יתושים ארוחת דם באמצעות 2 מ"ל של דם עם מכשיר האכלה מלאכותי או בעלי חיים חיים מרדים בהתאם לשיטות חרקים14. למחרת לספק יתושים ארוחת דם שנייה כדי להבטיח כי כל הנקבות המזדויפות היו הזדמנות להאכיל וכי יתושים האכלה חלקית הפכו שקועים לחלוטין.
- השתמש יתושים עבור אוספי עוברים 2-4 ימים לאחר ארוחת הדם השנייה.
הערה: תזונה זחלית חשובה לחוסן למבוגרים וכושר הרבייה. ראה בנדיקט ואח ' (2020) לקבלת מידע על איך לגדל חרקים בריאים14. לא נצפו הבדלים משמעותיים בהטלת ביצים כאשר יתושים ניזונים ממאכיל מלאכותי או מאכילים חיים של חיות מרדים. השתמש בשיטה שבה נעשה שימוש שגרתי עבור אנופלס גמביה בחרקים.
2. הכנת עוברים
- השתמש בשאיפה למקם 20-30 נקבות בצינור חרוט שקוף 50 מ"ל שנחתך (עם מסור להקה) כדי להיות פתוח בשני קצות ומכוסה בסרט שיניים לטקס בקצה אחד ורשת ניילון ונייר סינון בקצה השני(איור 1).
הערה: היתושים יפקידו את ביציהם על נייר המסנן ורשת הניילון תשמור על נייר המסנן במקומו. ביצי יתושים הן גליליות בצורתן, באורך של כ-500 מיקרומטר, בקוטר של כ-200 מיקרומטר בנקודה הרחבה ביותר שלהן, ומתחדדות בקצוות הקדמיים והאחוריים(איור 2). - מניחים את הצינור מלא יתושים בצלחת פטרי קטנה (60 מ"מ x 15 מ"מ) מלאה במים מזוקקים כפולים (ddH2O). מניחים את הצינור ואת המנה באינקובטור ב 28 °C (איור3).
- הסר את הצינור מן האינקובטור ולהכניס את הצינור לתוך כלוב ריק. הקש בעדינות על הצינור כדי לאפשר ליתושים לעוף החוצה ולהסיר את הצינור מהכלוב ברגע שכל היתושים עפו החוצה.
- כאשר הצינור הוא ללא יתושים, לפתוח את הטבעת התחתונה, להסיר את הניילון, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את נייר המסנן עם הביצים מן הצינור. מניחים את נייר הסינון בצלחת פטרי מפלסטיק (100 מ"מ x 15 מ"מ) המכילה שכבה של נייר סינון לח עם ddH2O.
- שים לב לביצים. ביצים שהזדקנו עד לנקודה שבה הן בצבע אפור בהיר(איור 4)מוכנות ליישור.
- אם הביצים עדיין לבנות, החזירו אותן לאינקובטור ובדקו את הצבע כל 5 דקות. ביצים לבנות שבירות, נקרעות בקלות, ואינן שורדות היטב לאחר תהליך ההזרקה וכתוצאה מכך בקיעה נמוכה.
- ביצים אפורות או שחורות כהות הזדקנו יותר מדי. אל תשתמש בהם.
3. יישור עובר
- חותכים חתיכת קרום ניילון (2 ס"מ על 1 ס"מ) עם סכין גילוח, מוודאים שהקצה נחתך בצורה מסודרת.
הערה: אם הקצה אינו ישר, הביצים לא יישארו מודבקות על הממברנה כראוי במהלך תהליך ההזרקה. - שים קרום על שקופית זכוכית לכסות את הממברנה עם פיסת נייר מסנן (2 ס"מ x 2 ס"מ), משאיר ~ 1 מ"מ של מסנן הממברנה חשוף (איור 5).
הערה: ודאו כי שקופיות מיקרוסקופ נקיות לפני השימוש והשתמשו במלקחיים נקיים כדי לתפעל את מסנן הממברנה. - הרטיבו את נייר המסנן עם H2O דה-או דה-יונים, שכן הביצים ימותו אם יתייבשו לפרקי זמן ממושכים.
הערה: אל תשימו יותר מדי מים על הנייר מכיוון שהעוברים יזוזו במהלך תהליך ההזרקה, אך ודאו שיש מספיק כדי למנוע מהעובר להתייבש (איור 6A, B). מים עודפים ניתן להסיר על ידי ספיגת אותו עם פיסת נייר מסנן. - מעבירים בעדינות 30-50 עוברים לקצה הממברנה בעזרת מברשת צבע (מידה מס' 0). השתמש במברשת כדי ליישר את הביצים אנכית לאורך הממברנה על ידי גלגול עדין עליהם על השקופית, כך שהצד הגחוני (קמור) פונה כלפי מעלה.
- כוון את כל הביצים באותו כיוון כך שכאשר הביצים נצפות תחת מיקרוסקופ microinjection, הקצה האחורי (מחודד יותר, איור 6A, B) נמצא במצב למטה ויוצר זווית של ~ 15° עם המחט ( איור6C). מרפדים את כל הקצה של הממברנה בביצים (30-50) ומניחים את השקופית מתחת למיקרוסקופ להזרקה.
הערה: בחר את הביצים בקפידה. השליכו את הלבנים (צעירים מדי או לא מפותחים) או אפור כהה (זקנים מדי וישברו את המחט), ואת האבנורמלים(איור 7). ודא שנייר הסינון נשאר לח בכל עת.
4. הכנת DNA
- טהרו DNAs פלסמיד להזרקה, לכל הפחות, עם ערכת MAXIprep DNA נטולת אנדוטוקסין בעקבות פרוטוקולי היצרן.
- resuspend ה- DNA במים באיכות PCR וצנטריפוגה ב 17,100 x גרם בצנטריפוגה בקירור במשך 30 דקות ב 4 °C (7 °F). לאחר מכן, להעביר את supernatant חדש, נקי 1.5 mL צינור חרוט. בזהירות מיקרו-pipette כדי למנוע העברת חומר חלקיקי לא רצוי מהעמודה.
- בצע משקעים שניים של DNA באמצעות נפח עשירית של 3M נתרן אצטט ונפח כפול של 100% אתנול.
- Resuspend ה- DNA ב 300-500 μL של מים כיתה PCR לריכוז פלסמיד סופי של 1000 ng / μL. לערבב את קוקטייל plasmid במאגר ההזרקה לריכוז פלסמיד סופי של 300-400 ng / μL ולעשות 10-20 עליקות μL.
הערה: DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 °C. aliquots מיקרו-ערך DNA ניתן לאחסן ב -20 °C (50 °F), או ב -80 °C (80 °F) אם משתמשים ברכיבי RNA. אין לחרוג מ- 800 ננוגרם/ μL של DNA בתערובת ההזרקה מכיוון שצמיגות תגרום למחטים לסתום.
5. הכנת מחט
- הפוך את המחטים על ידי משיכת נימי קוורץ 10 ס"מ באמצעות משיכת מיקרופיט לתכנות.
- בדוק את המחט מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי הקצה נוצר היטב. ודאו שהגדרת המחט במשיכה הניתנת לתכנות מניבה קצה שמתחיל להתחדד ~ 0.5 מ"מ מקצה המסוף ומסתיים בנקודה עדינה (ראו איור 6). מחטים שנשברות בקלות בדרך כלל יש יותר מדי זמן של מתחדד.
הערה: התנאים עשויים להשתנות בהתאם למשיכת המחט (המחברים יהיו זמינים על פי בקשה את ההגדרות עבור מושך לתכנות הם משתמשים. הגבלות יומן מונעות מאיתנו לצטט מותג מסוים). מחטים ניתן למשוך ביד, אבל זה דורש מיומנות להגדיר לא זמין ברוב המעבדות.
6. מיקרו-נסיגה עוברית
- השתמש קצה מיקרו-מטעין כדי למלא את המחטים עם 2 μL של תערובת DNA. הכנס את המחט למחזיק המחט וחבר את צינורות משאבת הלחץ האוטומטיים(איור 8).
- חשוב: יישר את המחט כך שהיא תגיע לזווית של 15° עם מישור השקופית (איור 8).
- פתח את קצה המחט על ידי נגיעה בזהירות בביצה הראשונה והזריק אותה על ידי החדרת קצה המחט ≤ 10 מיקרומטר בקוטב האחורי. זריקה מוצלחת תוביל לתנועה קטנה של הציטופלסמה בתוך הביצה.
- השתמש בפקדי השלב הקואקסיאלי של המיקרוסקופ כדי לעבור לביצה הבאה כדי להמשיך בהזרקה.
- כדי להבטיח כי קצה המחט נשאר פתוח ולא סתום, לחץ על כפתור הזרק לפני הכניסה לעובר אחר לדמיין את טיפה קטנה בפתח המחט.
- אם המחט נסתמת, לחץ על כפתור נקה כדי לנקות את המחט ולחזור על בדיקת ההדמיה טיפה. התאם את הלחץ לפי הצורך אם פתח קצה המחט גדל מעט כדי להבטיח שגודל הטיפה יישאר קטן.
- להזריק ~ 40-50 ביצים עם מחט אחת.
הערה: ודאו שנייר הסינון נשאר לח בכל עת. שמור מספיק לחץ גב על המחט כדי לשמור אותו פינה. מחט שלא ניתן לפתוח חייבת להיות מוחלפת במחט חדשה. מיקום העובר, החדרת המחט והזרקה נעשים קלים יותר עם מיקרוסקופים בעלי פקדים קואקסיאליים לתנועה אופקית של השלב (איור 9).
- לאחר השלמת הזריקות, יש לשטוף את הביצים במיכל זכוכית מרופד בנייר פילטר ומלא ב-50 מ"ל של H2O(איור 10).
הערה: עוברים יתחילו לבקוע יומיים לאחר ההזרקה ועשויים להימשך עד 3-5 ימים. יש להעביר זחלי instar הראשונים בקעה מיד (בדוק 2 פעמים ביום) למיכל נקי עם מים ומזון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמה מייצגת ליישום פרוטוקול המיקרו-בייג'ן המתואר ניתן למצוא ב Carballar-Lejarazú et al5. הכוונה כאן הייתה להכניס מערכת הנעת גנים אוטונומית לתוך הנבט של זן מעבדה, G3, של An. gambiae. המערכת תוכננה למקד את הלוקוס האורתולוגי הקרדינל (Agcd)על הכרומוזום השלישי במין זה, המקודד heme peroxidase המזרז את ההמרה של 3-הידרוקסיקינורנין לקסנתוממטין, השלב האחרון בביוסינתזה של אומוכרום(איור 11). יתושים המכילים כונן גנים הומוזיגוס הם מוטנטים קרדינל אובדן תפקוד עם זחלים, גלמים ומבוגרים שזה עתה הופיעו שיש להם פנוטיפ עיניים אדומות. פלסמיד, pCO37, המכיל את מערכת הכונן מבטא סטרפטוקוקוס pyogenes Cas9 (SpCas9) אנדונקולאז תחת שליטה של האלמנטים הרגולטוריים של אורתולוגית גן ננו-גמביה, RNA מדריך נוקלאוטידים 23-נוקלאוטיד (gRNA) תחת שליטתו של מקדם גנים A. gambiae U6 וקלטה דומיננטית 3XP3-CFP המבטאת את חלבון הציאן פלואורסצנטי לזיהוי צאצאים מהונדסים. Agcd שברי דנ"א הומולוגיים לאזורים גנומיים המאגפים את אתר חיתוך היעד של gRNA מאפשרים תיקון מונחה הומולוגיה- (HDR) אינטגרציה בתיווך.
780 עוברים מסוג בר An. gambiae הוזרקו עם pCO37 plasmid יחד עם חלבון SpCas9. מאה ארבעים ושישה עוברים מוזרקים (18.7%; ז0) שרדו עד שלב המבוגרים והורדו לאחר מכן לבני המין השני. הקרנת מיקרוסקופ פלואורסצנטית של הדור הבא (G1)זיהתה שלושה מתוך 3,428 (0.09%) שהיו חיוביים לגן סמן CFP, שרק שניים מהם, זכר ונקבה, שרדו. גישות מולקולריות (הגברת גנים, ריצוף DNA) אימתו את ההחדרה המדויקת של ~ 10 kb של DNA ואת הזן שנוצר הוגדר AgNosCd-1. ניתוחי מעקב מקיפים הראו כי AgNosCd-1 היה יעיל מאוד בכונן, יצר אללים עמידים מעטים ולא היה לו עומס גנטי גדול (עלויות כושר) כתוצאה מהשילוב והביטוי של מערכת הנעת הגנים5. pCO37 plasmid משמש עמוד השדרה לפיתוח זנים שינוי האוכלוסייה של An. gambiae כדי למנוע העברת טפיל מלריה.
איור 1: מכשיר איסוף ביצים. מכשיר איסוף הביצים מורכב מנייר סינון, רשת ניילון, סרט שיניים וצינור חרוט 50 מ"ל משופץ. המכשיר מאפשר ליתושים להיות מופקדים על ידי השאיפה בבטחה לתוך המיכל באמצעות החריץ בסרט שיניים. נייר הסינון ורשת הניילון מאפשרים להיספג במים, המספקים משטח לח, אך לא מוצף, לשיטת מים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עוברים של אנופלס גמביה. A) אצווה של עוברים בשלבים שונים של התבגרות. ב) החצים מציינים את הקוטב האחורי, המיקום בתוך העובר המכיל תאי נבט, שהם המטרות המיועדות לשינוי. סרגל קנה המידה מייצג ~ 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אוסף ביצים. לאחר היתושים ממוקמים בתוך מכשיר איסוף הביצים, הוא מועבר לצלחת פטרי המכילה שכבה של נייר סינון לח עם ddH2O. להתאים את נפח המים כך מפלס המים עולה ~ 1/4 את הגובה של המכסה. מכשיר איסוף הביצים וצלחת הפטרי ממוקמים לאחר מכן באינקובטור כהה ויתושים מורשים oviposit בסך הכל 45 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: התפתחות העובר. העוברים מתאימים להזרקה רק במהלך חלון זמן קצר. ביצים מוזרקות בטרם עת בהתפתחות הן עדינות מדי ויסבלו מנזק ולא יבקעו. ביצים מוזרקות מאוחר יותר בהתפתחותם להיות מוקשח יכול לשבור את המחט גורם יותר מדי חומר גנטי להיות מוזרק בביצה. בנוסף, זריקות מאוחר יותר בפיתוח נוטים פחות לגרום לשינויים קבועים בקו הנבט כמו תאי מוט במהירות לעבור שכפול נוסף ובידול. התמונות צולמו כל 10 דקות לאחר זמן oviposition של 45 דקות. כוכביות (*) מצביעות על ביצים המתאימות להזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הרכבת שקופיות ממברנה. הביצים מיושרות לאורך קרום הניילון, המספק מבנה תמיכה, כך הביצים לא זזות במהלך תהליך ההזרקה. נייר המסנן משמש כמאגר מים כדי להבטיח כי הביצים להישאר לח לאורך כל ההזרקה. מניחים את נייר הסינון ואת קרום הניילון קרוב לקצה מגלשת הזכוכית ומאפשרים מקום הן לביצים והן למים השקועים בהן. אם הממברנה ונייר הסינון רחוקים מדי מקצה השקופית, השגת הזווית הנכונה בין עוברים למחט תהיה קשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: אוריינטציה עוברית למיקרו-ינון. א)עוברים מיושרים עם הקטבים האחוריים הנמוכים יותר מהקנטר, רצים במורד הממברנה. ב) העוברים שקועים במים; להתאים את רוחב קו המים מעל הביצה להיות כשמיני עד רבע רוחב של עובר ממוצע. C) תמונת תקריב של זווית מחט עם עוברים. סרגל קנה המידה מייצג ~ 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: עוברים חריגים. עוברים שנראים חריגים בצבע או במרקם לא יבקעו; אל תזריק להם. עוברים בצבע צהוב לא יתמזגו כראוי. בקיעה מופחתת נצפתה גם בעוברים חלקים שאין להם קליפות ביצים רגילות (עור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מיקום המחט במהלך המיקרו-טג'קציה. A) מבט רחב זווית של שלב ההזרקה. B,C) מקם את המחט כך העוברים מיושר ליצור זווית של 15° עם מחט הזרקה. אין להרים את זרועו של מכשיר microinjection שמחזיק את המחט גבוה באופן משמעותי מאשר שלב המיקרוסקופ כדי להבטיח angling כראוי בין המחט שקופית המכילה את העוברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: בקרות ציריות ומחזיק מחטים. A) פקדי צירי co (חץ) מאפשרים תנועה תלת ממדית של המחט כדי להבטיח מיקום מדויק של המחט עבור כל זריקה. חשוב להשתמש בפקדים ציריים משותפים כדי להרים את המחט אנכית בעת החלפת שקופיות, כך המחט לא מתנגשת עם השקופית החדשה בעת הצבת אותו במקום על הבמה. בקרות קו-ציריות לרוחב מאפשרות חדירה מדויקת של המחט לקוטב האחורי. B) תמונה של מחזיק מחט מראה זווית להזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: חדר לבקוע ביצים. A,B)שטפו בזהירות עוברים מוזרקים למיכל גלילי מלא בעומק רבע במים מזוקקים כפולים ומרופד בנייר סינון. C,D) התנועה של המיכל גורמת לביצים לדבוק באופן טבעי בנייר המסנן. לפני היציאה מהמכל לבקוע, ודאו שכל הביצים שדבקו גבוה יותר בנייר המסנן נשטפות בעדינות חזרה למפלס המים. הסגלגל הכחול מסמן מספר ביצים שהופקדו כדי להראות גודל יחסי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11. אנופלס גמביה קרדינל (Agcd)אורתולוגיה גנטית, מבנה כונן גנים pCO37 ופנוטיפים וכתוצאה מכך. למעלה) גן Agcd: בלוקים חומים, אקסונים (E1-4); בלוקים ריקים, אזורים 3'-- ו-5-לא-תימודים (UTR); קו שחור עבה, אינטרונים ודנ"א בין-גניקזי. אמצע) pCO37 plasmid: זרועות הומולוגיה מן הגן Agcd: בלוקים חומים, בלוקים כחולים, רכיבי גן סמן דומיננטי (3XP3 ו CFP); בלוקים שיזוף, רכיבי כונן (מקדם ננו ורצפי קידוד חלבון SpCas9); בלוקים ירוקים, רכיבי RNA מנחים (מקדם U6 ורצף gRNA). גנים ותכונות של pCO37 אינם בקנה מידה. רקומבינציה (חצים חומים) הנובעת מתיקון מכוון הומולוגי (HDR) שיזם באתר החיתוך בתיווך SpCaS9/gRNA (ראש חץ ירוק) גורמת לשילוב מבנה כונן הגנים. למטה) וכתוצאה מכך פנוטיפים גלויים של שילוב כונן גנים: (משמאל) CFP+ (חץ לבן / כחול) ו homozygous Agcd- פנוטיפים מוטנטי (חץ אדום) בזחלים ו Agcd- מוטציה (חץ אדום) פנוטיפים בגולם. (מימין) הומוזיגוס Agcd פנוטיפ מוטציה "עין אדומה" אצל מבוגרים. עיבוד מ קרבלאר-ליירזו ואח'. (2020) ומשמש באישור5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם הזמינות המוגברת של טכנולוגיות הנדסה גנטית מדויקות וגמישות כגון CRISPR/Cas9, ניתן לפתח אורגניזמים מהונדסים בצורה פשוטה ויציבה יותר ממה שאפשר בעבר. כלים אלה אפשרו לחוקרים ליצור זנים מהונדסים של וקטורים יתושים שקרובים מאוד להשגת התכונות הרצויות של השחלה לפתוגנים (שינוי אוכלוסין) או סטריליות תורשתית (דיכוי האוכלוסייה). עם זאת, כדי לפתח את היתושים הבטוחים והיציבים ביותר האפשריים, יש ליצור ולהעריך קווים מהונדסים נוספים כך שייבחרו קווים אופטימליים למחקרי שטח. הפרוטוקול המתואר יכול להגביר את היעילות של יצירת מהונדסים אנופלס גמביה, כך מועמדים נוספים ניתן לפתח עבור שינוי האוכלוסייה ואסטרטגיות דיכוי.
הליך המיקרו-יז'ק המתואר משתמש בציוד ובחומרים שסביר להניח שהם זמינים במעבדה המבצעת באופן שגרתי מיקרו-נג'קציה של יתושים או וקטורים אחרים של פרוקי רגליים. חשוב לשמור על תשומת לב לפרטים לאורך הפרוטוקול. מירוץ בשלבים כגון בחירת ביצים לפי איכות או דילוג על שלבים כגון משקעים DNA השני יפגע בתוצאות ולגרום בקיעה מופחתת ויעילות טרנספורמציה מופחתת. בנוסף, קשיים רבים עם ההליך יכול להתעורר אם הטיפול לא נלקח בצמחיות יתושים. יתושים שגדלים בתנאים צפופים או עם מחסור בחומרים מזינים יטילו פחות ביצים באיכות ירודה14, אשר יוצר צווארי בקבוק בזרימת המיקרו-אכילציה ויגדיל את הזמן הדרוש כדי להגיע למספר הרצוי של עוברים מוזרקים.
שלא כמו שיטות המתוארות עבור microinjection של Anopheles stephensi12, שיטה זו אינה דורשת טביעת שמן של העוברים ועוברים נוספים ניתן להזריק בזמן קצר יותר ללא הצעדים הנוספים הנדרשים על ידי השיטה המבוססת על שמן. מגבלה לשיטה זו בהשוואה לשיטה המבוססת על שמן היא הדמיה גרועה יותר לאורך כל תהליך המיקרו-הזדקנות. כדי להבטיח כי חומר הזרקה או cytoplasm העובר אינו זורם בחזרה לתוך המחט, יש לשמור את תשומת הלב ללחץ האחורי של המחט בכל עת לאורך כל תהליך ההזרקה.
וקטור המלריה האפריקאי היה קשה מבחינה היסטורית לתפעל גנטית בהשוואה ל- Anopheles spp., אך הוא התורם הגדול ביותר למקרי מלריה ברחבי העולם. כלים חדשניים נדרשים כדי עוזר מאמצי חיסול מלריה יתושים מהונדסים שנועדו לשנות או לדכא אוכלוסיות יתושים יכול לשחק תפקיד חשוב בהשגת חיסול. כדי לבחור את המועמדים הטרנסגניים הטובים ביותר למחקרי חיסול מלריה מבוססי שדה, יש להעריך מספר קווים כך שניתן יהיה להשוות אותם ולבחור עבור יעילות ובטיחות אופטימלית15. אבני הבניין הגנטיות והמולקולריות הדרושות ליצירת קווים מהונדסים עם ש refractoriness משופר או דיכוי מאופיינים וזמינים. פרוטוקול זה יעזור בהגברת המהירות שבה ניתן ליצור קווים עקשן או מדכאים אלה, כך שמאמצי האימות עשויים להתחיל לבחור מועמד לניסויי שדה בעתיד הקרוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לדרוסילה סטילינג'ר, קיונה פרקר, פאריש פאוול ומדלין נוטולי על גידול יתושים. המימון ניתן על ידי אוניברסיטת קליפורניה, יוזמת מלריה אירוויין. AAJ הוא פרופסור דונלד ברן באוניברסיטת קליפורניה, אירווין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
