Summary
Le tecniche di microiniezione sono essenziali per introdurre geni esogeni nei genomi delle zanzare. Questo protocollo spiega un metodo utilizzato dal laboratorio James per microiniettare costrutti di DNA in embrioni di Anopheles gambiae per generare zanzare trasformate.
Abstract
Le tecniche di microiniezione degli embrioni sono essenziali per molti studi molecolari e genetici sulle specie di insetti. Forniscono un mezzo per introdurre frammenti di DNA esogeni che codificano geni di interesse e tratti favorevoli nella linea germinale degli insetti in modo stabile ed ereditabile. I ceppi transgenici risultanti possono essere studiati per i cambiamenti fenotipici derivanti dall'espressione del DNA integrato per rispondere a domande di base o utilizzati in applicazioni pratiche. Sebbene la tecnologia sia semplice, richiede all'investigatore pazienza e pratica per raggiungere un livello di abilità che massimizzi l'efficienza. Mostrato qui è un metodo per la microiniezione di embrioni della zanzara africana della malaria, Anopheles gambiae. L'obiettivo è quello di fornire per microiniezione DNA esogeno all'embrione in modo che possa essere assorbito nelle cellule germinali (polo) in via di sviluppo. L'espressione dal DNA iniettato di trasposasi, integrasi, ricombinasi o altre nucleasi (ad esempio proteine associate a CRISPR, Cas) può innescare eventi che portano al suo inserimento covalente nei cromosomi. Transgenic An. gambiae generato da queste tecnologie sono stati utilizzati per studi di base di componenti del sistema immunitario, geni coinvolti nell'alimentazione del sangue ed elementi del sistema olfattivo. Inoltre, queste tecniche sono state utilizzate per produrre ceppi di An. gambiae con tratti che possono aiutare a controllare la trasmissione dei parassiti della malaria.
Introduction
Le tecniche di microiniezione sono state utilizzate per manipolare sperimentalmente gli organismi fin dai primi anni del 19001. La microiniezione è stata utilizzata per studiare sia le funzioni biologiche di base che per introdurre importanti cambiamenti nella biologia di un organismo desiderato. La tecnica di microiniezione è stata di particolare interesse per i biologi vettori ed è stata ampiamente utilizzata per manipolare i genomi vettoriali2-11. Gli esperimenti di transgenesi nei vettori di artropodi spesso mirano a rendere i vettori meno efficienti nella trasmissione di agenti patogeni attuando cambiamenti che diminuiscono l'idoneità di un vettore o aumentano la refrattarietà ai patogeni che trasmettono. Le zanzare trasmettono una varietà di agenti patogeni umani e hanno un impatto significativo sulla morbilità e sulla mortalità in tutto il mondo. Il genere Anopheles di zanzare trasmette i patogeni parassiti della malaria umana, Plasmodium spp. Gli esperimenti di ingegneria genetica con Anopheles hanno mirato a comprendere meglio la biologia e ridurre la capacità vettoriale di queste zanzare negli sforzi per sviluppare nuove strategie di eliminazione della malaria.
I vettori di zanzare che contribuiscono alla maggior parte delle infezioni da malaria in tutto il mondo si trovano nel complesso delle specie Anopheles gambiae. Tuttavia, la maggior parte degli esperimenti di transgenesi di successo sono stati eseguiti sul vettore della malaria del subcontinente indiano, Anopheles stephensi. Mentre esistono molti ceppi di Anopheles gambiae adattati in laboratorio, il numero di linee transgeniche di Anopheles gambiae spp. riportate in letteratura non è paragonabile a quello di Anopheles stephensi. Si pensa che l'embrione di Anopheles gambiae sia più difficile da iniettare e ottenere una transgenesi di successo rispetto ad Anopheles stephensi, sebbene le ragioni di queste differenze siano sconosciute. Questo protocollo descrive un metodo che ha dimostrato di avere costantemente successo nel raggiungere la transgenesi degli embrioni di Anopheles gambiae tramite microiniezione. Il protocollo si basa su un metodo precedentemente sviluppato da Hervé Bossin e Mark Benedict12 con alcuni dettagli aggiuntivi e modifiche aggiunte che sono state trovate per aumentare l'efficienza della transgenesi.
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Protocol
1. Preparare le zanzare per la microiniezione
- Semina una gabbia13 (~ 5000 cm3) con ~ 100 maschi e 200-300 femmine 1-2 giorni zanzare adulte post-eclosion e lascia loro accoppiare per 2 giorni.
- Dopo il periodo dell'accoppiamento, fornire alle zanzare un pasto di sangue utilizzando 2 ml di sangue con un dispositivo di alimentazione artificiale o animali vivi anestetizzati a seconda delle pratiche insetticide14. Il giorno seguente fornisci alle zanzare un secondo pasto di sangue per garantire che tutte le femmine accoppiate abbiano avuto l'opportunità di nutrirsi e che le zanzare parzialmente nutrite siano diventate completamente ingorgate.
- Utilizzare le zanzare per la raccolta di embrioni 2-4 giorni dopo il secondo pasto di sangue.
NOTA: La nutrizione larvale è importante per la robustezza degli adulti e l'idoneità riproduttiva. Vedi Benedict et al. (2020) per informazioni su come allevare insetti sani14. Non sono state osservate differenze significative nella deposizione delle uova quando le zanzare vengono alimentate con un alimentatore artificiale o animali vivi anestetizzati. Utilizzare qualsiasi metodo venga utilizzato abitualmente per Anopheles gambiae nell'insetto.
2. Preparazione degli embrioni
- Utilizzare un aspiratore per posizionare 20-30 femmine in un tubo conico trasparente da 50 ml che è stato tagliato (con una sega a nastro) per essere aperto ad entrambe le estremità ed è coperto con pellicola dentale in lattice a un'estremità e rete di nylon e carta da filtro all'altra (Figura 1).
NOTA: Le zanzare depositeranno le loro uova sulla carta da filtro e la rete di nylon manterrà la carta da filtro saldamente in posizione. Le uova di zanzara sono di forma cilindrica, ~ 500 μm di lunghezza, ~ 200 μm di diametro nel loro punto più largo e affusolate alle estremità anteriore e posteriore (Figura 2). - Posizionare il tubo pieno di zanzare in una piccola capsula di Petri (60 mm x 15 mm) riempita con acqua a doppio distillato (ddH2O). Posizionare il tubo e il piatto in un'incubatrice a 28 °C per 45 minuti (Figura 3).
- Rimuovere il tubo dall'incubatore e inserire il tubo in una gabbia vuota. Picchiettare delicatamente il tubo per consentire alle zanzare di volare fuori e rimuovere il tubo dalla gabbia una volta che tutte le zanzare sono volate fuori.
- Quando il tubo è privo di zanzare, svitare l'anello inferiore, rimuovere il nylon e utilizzare una pinza per rimuovere con cura la carta da filtro con le uova dal tubo. Posizionare la carta da filtro in una capsula di Petri di plastica (100 mm x 15 mm) contenente uno strato di carta da filtro inumidita con ddH2O.
- Osserva le uova. Le uova che sono invecchiate fino al punto in cui sono di colore grigio chiaro (Figura 4) sono pronte per l'allineamento.
- Se le uova sono ancora bianche, restituiscile all'incubatrice e controlla il colore ogni 5 minuti. Le uova bianche sono fragili, si rompono facilmente e non sopravvivono bene dopo il processo di iniezione con conseguente bassa schiusa.
- Le uova che sono grigio scuro o nero sono invecchiate troppo. Non usarli.
3. Allineamento degli embrioni
- Tagliare un pezzo di membrana di nylon (2 cm x 1 cm) con una lama di rasoio, assicurandosi che il bordo sia ben tagliato.
NOTA: Se il bordo non è dritto, le uova non rimarranno fissate correttamente alla membrana durante il processo di iniezione. - Mettere una membrana su un vetrino e coprire la membrana con un pezzo di carta da filtro (2 cm x 2 cm), lasciando scoperto ~1 mm del filtro a membrana (Figura 5).
NOTA: assicurarsi che i vetrini del microscopio siano puliti prima dell'uso e utilizzare pinze pulite per manipolare il filtro a membrana. - Bagnare la carta da filtro con H2O deionizzato poiché le uova moriranno se essiccate per periodi di tempo prolungati.
NOTA: Non mettere troppa acqua sulla carta perché gli embrioni si muoveranno durante il processo di iniezione, ma assicurarsi che ce ne sia abbastanza per evitare che l'embrione si secchi (Figura 6A, B). L'acqua in eccesso può essere rimossa assorbendola con un pezzo di carta dafiltro. - Trasferire delicatamente 30-50 embrioni sul bordo della membrana con un pennello (taglia #0). Utilizzare il pennello per allineare le uova verticalmente lungo la membrana facendole rotolare delicatamente sul vetrino in modo che il lato ventrale (convesso) sia rivolto verso l'alto.
- Orientare tutte le uova nella stessa direzione in modo che quando le uova vengono osservate al microscopio a microiniezione, l'estremità posteriore (più appuntita, Figura 6A,B)sia in posizione verso il basso e formi un angolo di ~ 15 ° con l'ago (Figura 6C). Rivestire l'intero bordo della membrana con uova (30-50) e posizionare il vetrino sotto il microscopio per l'iniezione.
NOTA: Scegli le uova con attenzione. Scartare quelli bianchi (troppo giovani o non sviluppati) o grigio scuro (troppo vecchi e romperanno l'ago) e quelli anormali (Figura 7). Assicurati che la carta da filtro rimanga sempreumida.
4. Preparazione del DNA
- Purificare i DNA plasmidici per iniezione, come minimo, con un kit maxiprep plasmide a DNA privo di endotossine seguendo i protocolli del produttore.
- Sospendere il DNA in acqua di grado PCR e centrifugare a 17.100 x g in una centrifuga refrigerata per 30 minuti a 4 °C. Quindi, trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico pulito da 1,5 ml. Micro-pipetta con attenzione per evitare di trasferire particolato indesiderato dalla colonna.
- Eseguire una seconda precipitazione del DNA utilizzando un decimo di volume di acetato di sodio 3M e un volume doppio di etanolo al 100%.
- Sospendere il DNA in 300-500 μL di acqua di grado PCR per una concentrazione finale di plasmide di 1000 ng/μL. Mescolare il cocktail di plasmidi nel tampone di iniezione per una concentrazione finale di plasmide di 300-400 ng/μL e produrre aliquote da 10-20 μL.
NOTA: il DNA può essere conservato a -20 °C. Le aliquote di microiniezione del DNA possono essere conservate a -20 °C o a -80 °C se si utilizzano componenti di RNA. Non superare 800 ng/μL di DNA nella miscela di iniezione perché la viscosità causerà l'intasamento degli aghi.
5. Preparazione dell'ago
- Realizzare gli aghi tirando capillari di quarzo da 10 cm utilizzando un estrattore di micropipette programmabile.
- Esaminare l'ago al microscopio per assicurarsi che la punta sia formata bene. Assicurarsi che l'impostazione dell'ago sull'estrattore programmabile produca una punta che inizia a rastremare a circa 0,5 mm dall'estremità terminale e termina in un punto fine (vedere Figura 6). Gli aghi che si rompono facilmente di solito hanno un cono troppo lungo.
NOTA: Le condizioni possono variare a seconda dell'estrattore dell'ago (gli autori metteranno a disposizione su richiesta le impostazioni per l'estrattore programmabile che utilizzano. Le restrizioni del diario ci impediscono di citare un marchio specifico). Gli aghi possono essere tirati a mano, ma ciò richiede un set di abilità non disponibile nella maggior parte dei laboratori.
6. Microiniezione di embrioni
- Utilizzare una punta micro-caricatore per riempire gli aghi con 2 μL di miscela di DNA. Inserire l'ago nel supporto dell'ago e collegare il tubo automatico della pompa a pressione (Figura 8).
- Importante: allineare l'ago in modo che faccia un angolo di 15° con il piano del vetrino (Figura 8).
- Aprire la punta dell'ago toccando con attenzione il primo uovo e iniettarlo inserendo la punta dell'ago ≤ 10 μm nel polo posteriore. Un'iniezione di successo porterà a un piccolo movimento del citoplasma all'interno dell'uovo.
- Utilizzare i controlli dello stadio coassiale del microscopio per passare all'uovo successivo per continuare l'iniezione.
- Per assicurarsi che la punta dell'ago rimanga aperta e non si sia intasata, premere il pulsante Inietta prima di inserire un altro embrione e visualizzare la piccola goccia all'apertura dell'ago.
- Se l'ago si intasa, premere il pulsante Cancella per liberare l'ago e ripetere il test di visualizzazione delle goccioline. Regolare la pressione secondo necessità se l'apertura della punta dell'ago diventa leggermente più grande per garantire che la dimensione della goccia rimanga piccola.
- Iniettare ~ 40-50 uova con un ago.
NOTA: Assicurarsi che la carta da filtro rimanga sempre umida. Mantenere una contropressione sufficiente sull'ago per mantenerlo pulito. Un ago che non può essere sganciato deve essere sostituito con un nuovo ago. Il posizionamento dell'embrione, l'inserimento dell'ago e l'iniezione sono resi più facili con microscopi che hanno controlli coassiali per il movimento orizzontale dello stadio (Figura 9).
- Al termine delle iniezioni, sciacquare le uova in un contenitore di vetro rivestito con carta da filtro e riempito con 50 ml di H2O deionizzato (Figura 10).
NOTA: gli embrioni inizieranno a schiudersi 2 giorni dopo l'iniezione e potrebbero richiedere fino a 3-5 giorni. Le prime larve di instar schiuse devono essere trasferite immediatamente (controllare 2 volte al giorno) in un contenitore pulito con acqua e cibo.
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Representative Results
Un esempio rappresentativo dell'applicazione del protocollo di microiniezione descritto può essere trovato in Carballar-Lejarazú et al5. L'intento qui era quello di inserire un sistema autonomo di gene-drive nella linea germinale di un ceppo di laboratorio, G3, di An. gambiae. Il sistema è stato progettato per colpire il locus ortologo cardinale (Agcd) sul terzo cromosoma in questa specie, che codifica per un'eme perossidasi che catalizza la conversione della 3-idrossichinnurenina in xantommatina, l'ultimo passo nella biosintesi dell'ommocromo (Figura 11). Le zanzare omozigoti contenenti gene drive sono mutanti cardinali con perdita di funzione con larve, pupe e adulti appena emersi con un fenotipo occhi rossi. Un plasmide, pCO37, contenente il sistema di azionamento esprime l'endonucleasi dello Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) sotto controllo degli elementi regolatori dell'ortologo del gene An. gambiae nanos, un RNA guida a 23 nucleotidi (gRNA) sotto il controllo di un promotore del gene An. gambiae U6 e una cassetta marcatore dominante 3XP3-CFP che esprime la proteina fluorescente ciano per identificare la progenie transgenica. Agcd · Frammenti di DNA omologhi alle regioni genomiche che fiancheggiano il sito di taglio del bersaglio del gRNA rendono possibile l'integrazione mediata dalla riparazione diretta dall'omologia (HDR).
Settecentottanta embrioni di An. gambiae di tipo selvaggio sono stati iniettati con il plasmide pCO37 insieme alla proteina SpCas9. Centoquarantasei embrioni iniettati (18,7%; G0) sopravvissero allo stadio adulto e furono successivamente superati da membri selvatici del sesso opposto. Lo screening al microscopio fluorescente della progenie di prossima generazione (G1)ha identificato tre dei 3.428 (0,09%) che erano positivi per il gene marcatore CFP, solo due dei quali, un maschio e una femmina, sono sopravvissuti. Gli approcci molecolari (amplificazione genica, sequenziamento del DNA) hanno verificato l'inserimento accurato di ~ 10 kb di DNA e il ceppo risultante è stato designato AgNosCd-1. Ampie analisi di follow-up hanno mostrato che AgNosCd-1 era altamente efficiente nel guidare, creava pochi alleli resistenti e non aveva un carico genetico importante (costi di fitness) a seguito dell'integrazione e dell'espressione del sistema di gene-drive5. Il plasmide pCO37 funge da spina dorsale per lo sviluppo di ceppi di modifica della popolazione di An. gambiae per prevenire la trasmissione del parassita della malaria.
Figura 1: Dispositivo di raccolta delle uova. Il dispositivo di raccolta delle uova è composto da carta da filtro, rete di nylon, pellicola dentale e un tubo conico retrofittato da 50 ml. Il dispositivo consente alle zanzare di essere depositate con l'aspiratore in modo sicuro nel contenitore tramite la fessura nel film dentale. La carta da filtro e la rete di nylon consentono l'assorbimento dell'acqua, che fornisce una superficie umida, ma non allagata, per l'ovodeposizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Embrioni di Anopheles gambiae. A)Un lotto di embrioni a vari stadi di maturazione. B)Le frecce indicano il polo posteriore, la posizione all'interno dell'embrione che contiene cellule germinali, che sono gli obiettivi previsti per la trasformazione. La barra della scala rappresenta ~1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Raccolta delle uova. Una volta che le zanzare vengono posizionate all'interno del dispositivo di raccolta delle uova, vengono spostate in una capsula di Petri contenente uno strato di carta da filtro inumidito con ddH2O. Regolare il volume d'acqua in modo che il livello dell'acqua salga a ~ 1/4 dell'altezza del cappuccio. Il dispositivo di raccolta delle uova e la capsula di Petri vengono quindi collocati in un'incubatrice oscurata e le zanzare possono ovopositare per un totale di 45 minuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sviluppo embrionale. Gli embrioni sono adatti per l'iniezione solo durante una breve finestra temporale. Le uova che vengono iniettate prematuramente nello sviluppo sono troppo delicate e subiranno danni e non si schiuderanno. Le uova che vengono iniettate più tardi nel loro sviluppo si induriscono e possono rompere l'ago causando troppo materiale genetico da iniettare nell'uovo. Inoltre, le iniezioni più avanti nello sviluppo hanno meno probabilità di causare cambiamenti permanenti alla linea germinale poiché le cellule polari subiscono rapidamente un'ulteriore replicazione e differenziazione. Le foto sono state scattate ogni 10 minuti dopo il tempo di ovodeposizione di 45 minuti. Gli asterischi (*) indicano le uova adatte all'iniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Assemblaggio di diapositive a membrana. Le uova sono allineate lungo la membrana di nylon, che fornisce una struttura di supporto in modo che le uova non si muovano durante il processo di iniezione. La carta da filtro funge da serbatoio per l'acqua per garantire che le uova rimangano umide durante l'iniezione. Posizionare la carta da filtro e la membrana di nylon vicino al bordo del vetrino lasciando spazio sia alle uova che all'acqua che le immerge. Se la membrana e la carta da filtro sono troppo lontane dal bordo del vetrino, sarà difficile ottenere l'angolo corretto tra embrioni e ago. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Orientamento dell'embrione per la microiniezione. A)Gli embrioni sono allineati con i poli posteriori più bassi di quelli anteriori, correndo lungo la membrana. B)Gli embrioni sono immersi in acqua; regolare la larghezza della linea d'acqua sopra l'uovo in modo che sia approssimativamente da un ottavo a un quarto della larghezza di un embrione medio. C)Immagine ravvicinata dell'angolo dell'ago con gli embrioni. La barra della scala rappresenta ~1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Embrioni anormali. Gli embrioni che appaiono anormali nella colorazione o nella consistenza non si schiudono; non iniettarli. Gli embrioni di colore giallo non si melanizzeranno correttamente. Una ridotta schiusa è stata osservata anche in embrioni lisci che non hanno gusci d'uovo (cuticole) dall'aspetto normale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Posizione dell'ago durante le microiniezioni. A)Vista grandangolare dello stadio di iniezione. B,C) Posizionare l'ago in modo che gli embrioni allineati formino un angolo di 15 ° con l'ago per iniezione. Non sollevare il braccio dello strumento di microiniezione che tiene l'ago significativamente più in alto rispetto allo stadio del microscopio per garantire una corretta angolazione tra l'ago e il vetrino contenente gli embrioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Comandi coassiali e portaaghi. R)I comandi coassiali (freccia) consentono il movimento tridimensionale dell'ago per garantire un posizionamento preciso dell'ago per ogni iniezione. È importante utilizzare controlli coassiali per sollevare l'ago verticalmente quando si commutano i vetrini in modo che l'ago non si scontri con il nuovo vetrino quando lo si posiziona sul palco. I controlli coassiali laterali consentono un'accurata penetrazione dell'ago nel polo posteriore. B)Immagine del portaago che mostra l'angolo per l'iniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Camera per la schiusa delle uova. A,B)Lavare accuratamente gli embrioni iniettati in un contenitore cilindrico riempito a un quarto di profondità con acqua a doppio distillato e rivestito con carta da filtro. C,D) Il movimento del contenitore fa sì che le uova aderiscano naturalmente alla carta da filtro. Prima di lasciare il contenitore per la schiusa, assicurarsi che tutte le uova che hanno aderito più in alto sulla carta da filtro vengano delicatamente lavate fino al livello dell'acqua. L'ovale blu segna un numero di uova depositate per mostrare le dimensioni relative. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11. Anopheles gambiae cardinal (Agcd) gene ortholog, pCO37 gene drive construct e fenotipi risultanti. In alto) Gene Agcd: blocchi marrone, esoni (E1-4); blocchi vuoti, regioni 3' e 5 non tradotte (UTR); linea nera spessa, introni e DNA intergenico. Middle) plasmide pCO37: bracci di omologia dal gene Agcd: blocchi marrone, blocchi blu, componenti genetiche marcatori dominanti (3XP3 e CFP); tan block, componenti di azionamento(promotore nanos e sequenze di codifica proteica SpCas9); blocchi verdi, componenti di RNA guida (promotore U6 e sequenza di gRNA). I geni e le caratteristiche di pCO37 non devono scalare. La ricombinazione (frecce marrone) risultante dalla riparazione diretta dall'omologia (HDR) avviata nel sito di taglio mediato da SpCaS9 / gRNA (punta di freccia verde) porta all'integrazione del costrutto di gene drive. In basso) fenotipi visibili risultanti dell'integrazione del gene drive: (a sinistra) CFP+ (freccia bianca/blu) e fenotipi omozigoti Agcd-mutanti(freccia rossa) nelle larve e fenotipi Agcd-mutanti(freccia rossa) nelle pupe. (a destra) Fenotipo mutante omozigote Agcd "occhio rosso" negli adulti. Adattato da Carballar-Lejarazú et al. (2020) e utilizzato con il permesso5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Con la maggiore disponibilità di tecnologie di ingegneria genetica precise e flessibili come CRISPR / Cas9, gli organismi transgenici possono essere sviluppati in modo più semplice e stabile di quanto fosse possibile in precedenza. Questi strumenti hanno permesso ai ricercatori di creare ceppi transgenici di vettori di zanzare che sono molto vicini a raggiungere le proprietà desiderate di refrattarietà ai patogeni (modifica della popolazione) o sterilità ereditaria (soppressione della popolazione). Tuttavia, per sviluppare le zanzare geneticamente modificate più sicure e stabili possibili, è necessario creare e valutare ulteriori linee transgeniche in modo che le linee ottimali siano selezionate per gli studi sul campo. Il protocollo descritto può aumentare l'efficienza della generazione di transgenici Anopheles gambiae in modo che possano essere sviluppati ulteriori candidati per la modifica della popolazione e le strategie di soppressione.
La procedura di microiniezione descritta utilizza attrezzature e materiali che sono probabilmente disponibili in un laboratorio che esegue abitualmente microiniezioni di zanzare o altri vettori di artropodi. Mantenere l'attenzione ai dettagli in tutto il protocollo è importante. Correre attraverso passaggi come la selezione delle uova in base alla qualità o saltare passaggi come la seconda precipitazione del DNA comprometterà i risultati e causerà una ridotta schiusa e una ridotta efficienza di trasformazione. Inoltre, molte difficoltà con la procedura possono sorgere se non si presta attenzione all'allevamento delle zanzare. Le zanzare allevate in condizioni affollate o con una mancanza di nutrienti deporranno meno uova di qualità inferiore14, il che crea colli di bottiglia nel flusso di lavoro di microiniezione e aumenterà il tempo necessario per raggiungere il numero desiderato di embrioni iniettati.
A differenza dei metodi descritti per la microiniezione di Anopheles stephensi12, questo metodo non richiede l'immersione in olio degli embrioni e più embrioni possono essere iniettati in un tempo più breve senza i passaggi aggiuntivi richiesti dal metodo a base di olio. Una limitazione a questo metodo rispetto al metodo a base di olio è una visualizzazione più scarsa durante tutto il processo di microiniezione. Per garantire che il materiale di iniezione o il citoplasma embrionale non scorra nell'ago, è necessario prestare attenzione alla contropressione dell'ago in ogni momento durante tutto il processo di iniezione.
Il vettore della malaria africana è stato storicamente difficile da manipolare geneticamente rispetto ad altri Anopheles spp., eppure è il più grande contributore ai casi di malaria in tutto il mondo. Sono necessari nuovi strumenti per aiutare gli sforzi di eliminazione della malaria e le zanzare transgeniche progettate per modificare o sopprimere le popolazioni di zanzare possono svolgere un ruolo importante nel raggiungimento dell'eliminazione. Per selezionare i migliori candidati transgenici per gli studi di eliminazione della malaria sul campo, è necessario valutare un certo numero di linee in modo che possano essere confrontate e selezionate per un'efficacia e una sicurezza ottimali15. Gli elementi costitutivi genetici e molecolari necessari per creare linee transgeniche con una maggiore refrattarietà o soppressione sono caratterizzati e disponibili. Questo protocollo aiuterà ad aumentare la velocità con cui queste linee refrattarie o soppressive possono essere create in modo che gli sforzi di convalida possano iniziare a selezionare un candidato per le prove sul campo nel prossimo futuro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell e Madeline Nottoli per l'allevamento delle zanzare. Il finanziamento è stato fornito dall'Università della California, Irvine Malaria Initiative. AAJ è donald bren professor presso l'Università della California, Irvine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
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