Summary
蚊のゲノムに外因性遺伝子を導入するには、マイクロインジェクション技術が不可欠です。このプロトコルは、変換された蚊を生成するために アノフェレスガンビア 胚にDNA構築物をマイクロ注入するためにジェームズ研究所によって使用される方法を説明します。
Abstract
胚マイクロインジェクション技術は、昆虫種の多くの分子遺伝学的研究に不可欠です。彼らは、目的の遺伝子をコードする外因性DNA断片と、安定かつ遺伝性の方法で昆虫生殖細胞系列に有利な形質を導入する手段を提供する。得られたトランスジェニック株は、基本的な質問に答えたり、実用化に使用したりするために、統合DNAの発現に起因する表現型変化について研究することができる。この技術は簡単ですが、効率を最大化するレベルのスキルを達成するには、調査官の忍耐と実践が必要です。ここに示されているアフリカマラリア蚊の胚のマイクロインジェクションのための方法です, アノフェレスガンビア .目的は、開発中の生殖細胞(極)細胞で取り上げることができるように、胚に外因性DNAをマイクロインジェクションで送達することです。トランスポザース、インテグラーゼ、リコンビナーセ、または他のヌクレアーゼ(CRISPR関連タンパク質、Casなど)の注入されたDNAからの発現は、染色体への共有結合挿入につながる事象を引き起こす可能性があります。これらの技術から生成されたトランスジェニック An.ガンビア は、免疫系成分、摂食に関与する遺伝子、および嗅覚系の要素の基礎研究に使用されてきた。さらに、これらの技術は、マラリア原虫の伝染を制御するのに役立つ形質を有する An.ガンビア 株を産生するために使用されてきた。
Introduction
マイクロインジェクション技術は、1900年代初期から生物を実験的に操作するために使用されてきました。マイクロインジェクションは、基本的な生物学的機能の両方を研究し、望ましい生物の生物学における重要な変化を導入するために使用されてきました。マイクロインジェクション技術は、ベクター生物学者に特に興味深く、ベクターゲノム2-11を操作するために広く使用されてきた。節足動物ベクターのトランスジェネシス実験は、ベクターの適性を低下させるか、またはそれらが媒介する病原体への屈折性を高める変化を制定することによって、病原体を伝染させるベクターを効率よくなくすることを目的とすることが多い。蚊は様々なヒト病原体を媒介し、世界中の罹患率と死亡率に大きな影響を与えます。蚊のアノフェレス属は、ヒトマラリア寄生虫病原体であるプラスモジウム属を媒介する。アノフェレスの遺伝子工学実験は、生物学をよりよく理解し、新しいマラリア排除戦略を開発する取り組みにおいて、これらの蚊のベクター能力を低下させることを目的としています。
世界中で最もマラリア感染に寄与する蚊のベクターは、 アノフェレスガンビア 種複合体にあります。しかし、成功した遺伝子導入実験の大半は、インド亜大陸のマラリアベクター、 アノフェレス・ステポルシに対して行われている。実験室適応 アノフェレスガンビア株 の多くが存在するが、トランスジェニック アノフェールガンビアspp. 文献で報告されたラインは 、アノフェレスステナシのそれと比較しない。 アノフェレス・ガンビア胚 は、これらの違いの理由は不明であるが、 アノフェレス・ステナシよりも注射し、成功したトランスジェネシスを達成することはより困難であると考えられている。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介して アノフェレスガンビア 胚のトランスジェネシスを達成することに一貫して成功することが証明されている方法を記述する。このプロトコルは、エルヴェ・ボッシンとマーク・ベネディクト12 によって以前に開発された方法に基づいており、トランスジェネシスの効率を高めるために発見されたいくつかの追加の詳細と変更が加えられた。
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Protocol
1. マイクロインジェクション用の蚊の準備
- ケージ13(約5000cm3)を、オス100匹、雌1~2日の雌1-2日の成人後の蚊を播種し、2日間交尾できるようにします。
- 交配期間の後、蚊に人工授乳装置を用いた血液の2mLまたは昆虫の慣行に応じて生きた麻酔動物を使用して血液食事を提供する。翌日、蚊に2回目の血液食事を提供し、すべての交尾したメスが餌を与える機会を得て、部分的に餌を与えられた蚊が完全に飲み込まれたことを確認します。
- 2回目の血液ミールの2~4日後に、蚊を胚コレクションに活用します。
注:ラーバル栄養は、大人の堅牢性と生殖フィットネスのために重要です。健康な昆虫14を飼育する方法については、ベネディクトら(2020)を参照してください。蚊が人工フィーダーや生きた麻酔動物に餌を与えられると、産卵に有意な差は認められていない。昆虫の アノフェレスガンビア に日常的に使用される方法を使用してください。
2. 胚の準備
- アスピレーターを使用して、両端に切り取られた透明な50〜30 mL円錐形チューブに20〜30人の女性を配置し、一方の端にラテックス歯科フィルム、もう一方の端にナイロンメッシュとフィルターペーパーで覆われています(図1)。
注:蚊は卵をろ過用紙に堆積させ、ナイロンメッシュはフィルターペーパーを安全に保ちます。蚊の卵は円筒形で、長さは〜500μm、直径は最も広い点で〜200μm、前部および後端で先細りである(図2)。 - 蚊で満たされたチューブを、二重蒸留水(ddH2O)で満たされた小さな(60 mm x 15 mm)のペトリ皿に入れます。チューブと皿を28°Cのインキュベーターに45分間置きます(図3)。
- チューブをインキュベーターから取り出し、チューブを空のケージに挿入します。チューブを軽くタップして蚊が飛び出し、すべての蚊が飛び出したらケージからチューブを取り除きます。
- チューブに蚊が含まれず、下のリングを緩め、ナイロンを取り外し、鉗子を使用して卵をチューブから慎重に取り除きます。ろ紙を、ddH2Oで湿らせた濾紙の層を含むプラスチックペトリ皿(100mm x 15mm)に入れます。
- 卵を観察してください。卵は薄い灰色の色の状態まで熟成した状態で、整列の準備が整っています。
- 卵がまだ白い場合は、インキュベーターに戻し、5分ごとに色を確認してください。白い卵は壊れやすく、破裂しやすく、注射プロセスの後にうまく生き残らず、低い孵化を引き起こします。
- 濃い灰色または黒の卵は熟成しすぎている。使用しないでください。
3. 胚のアライメント
- かみそりの刃でナイロンブロッティング膜(2cm x 1 cm)を切り取り、エッジがきれいにトリミングされていることを確認します。
注:エッジがまっすぐでない場合、卵は注入プロセス中に適切に膜に貼り付けられたままになります。 - ガラススライドに膜を置き、膜をフィルター用紙(2cm x 2 cm)で覆い、膜フィルターの約1mmを覆い残す(図5)。
注:顕微鏡のスライドが使用前に清潔であることを確認し、膜フィルターを操作するためにきれいな鉗子を使用してください。 - 長期間乾燥すると卵が死ぬので、脱イオン化されたH2Oで濾紙を濡らす。
メモ:注入プロセス中に胚が動くので、紙にあまり水を入れ過ぎないようにしてください。しかし、胚が乾燥するのを防ぐのに十分であることを確認してください(図6A、B)。余分な水は、濾紙の一部でそれを吸収することによって除去することができます。 - 30~50個の胚を、絵筆で膜の端までそっと移します(サイズ#0)。ブラシを使用して、卵をスライド上でそっと転がして卵を膜に沿って垂直に整列させ、腹側(凸面)が上向きになるようにします。
- 卵がマイクロインジェクション顕微鏡下で観察されるとき、後端(より尖った、図6A、B)が下方位置にあり、針で〜15°の角度を形成するように、すべての卵を同じ方向に向ける(図6C)。卵(30-50)で膜の縁全体を並べ、注入のために顕微鏡の下にスライドを置きます。
注:卵は慎重に選択してください。白(若すぎる、または未開発)または濃い灰色(古すぎて針を壊す)、異常なもの(図7)を捨てます。フィルター用紙が常に湿っていることを確認してください。
4. DNAの調製
- 注入用のプラスミドDNAを、少なくとも、メーカーのプロトコルに従って内毒素を含まないDNAプラスミドマキシプレップキットで精製します。
- 4°Cで30分間冷蔵遠心分離機で17,100 x g でPCRグレードの水と遠心分離機中のDNAを再懸濁します。 その後、上清を新しい、クリーンな1.5 mL円錐管に移します。慎重にマイクロピペットは、カラムから望ましくない粒子状物質を転送することを避けるために。
- 3M酢酸ナトリウムの10分の1の体積と100%エタノールの2倍の容量を使用してDNAの第2の沈殿を行います。
- 最終的なプラスミド濃度1000 ng/μLのPCRグレード水でDNAを再懸濁し、最終的なプラスミド濃度300-400 ng/μLの最終プラスミド濃度を注入バッファーに混ぜ、10-20 μLのアリコートを作ります。
注:DNAは-20°Cで保存することができ、DNAマイクロインジェクションアリコートは-20°Cで保存することができ、RNA成分を使用する場合は-80°Cで保存することができます。粘性が針詰まりを引き起こすので、注射ミックス中のDNAの800 ng /μLを超えないでください。
5. 針の準備
- プログラム可能なマイクロピペットの引き手を使用して10 cmの石英の毛細血管を引っ張って針を作ります。
- 針を顕微鏡で調べて、先端がうまく形成されていることを確認します。プログラム可能なプーラーの針の設定が、端末の端から約 0.5 mm の先細しを開始し、細かい点で終わる先端を得ることを確認します( 図 6を参照)。簡単に壊れる針は、通常、テーパーの長すぎる。
注:条件は、ニードルプーラーによって異なる場合があります(著者は、彼らが使用するプログラマブルプーラーの設定を要求に応じて利用可能になります。ジャーナルの制限により、特定のブランドを引用できない。針は手で引っ張ることができますが、これはほとんどの実験室では利用できないスキルセットを必要とします。
6. 胚マイクロインジェクション
- マイクロローダーチップを使用して、2 μLのDNA混合物で針を充填します。針を針ホルダーに挿入し、自動圧力ポンプチューブを接続します(図8)。
- 重要:針をスライドの平面に合わせて15°の角度になるように、針を合わせます(図8)。
- 最初の卵に注意して触れて針先を開き、針の先端を10μm後極に挿入して注入≤。注射が成功すると、卵の中の細胞質の小さな動きにつながります。
- 顕微鏡同軸ステージコントロールを使用して、次の卵に移動して注入を継続します。
- 針先が開いたままで詰まっていないようにするには、別の胚に入る前に[注射]ボタンを押して、針の開口部にある小さな液滴を視覚化します。
- 針が詰まったら、[クリア]ボタンを押して針をクリアし、液滴の可視化テストを繰り返します。針先の開口部が少し大きくなる場合は、必要に応じて圧力を調整して、液滴のサイズが小さく保たれるようにします。
- 1針で~40~50個の卵を注入します。
メモ:フィルター用紙は常に湿っていることを確認してください。針に十分な背圧を保ち、クリア状態に保ちます。詰まらない針は新しい針に交換する必要があります。胚の配置、針の挿入および注入は、ステージの水平移動のための同軸制御を有する顕微鏡で容易になる(図9)。
- 注射が完了したら、フィルターペーパーが並ぶガラス容器に卵をすすい、50 mLの脱イオン化H2Oで満たします(図10)。
注意:胚は注射後2日で孵化を開始し、3〜5日かかることがあります。孵化した最初のインスター幼虫は、水と食料を含むきれいな容器に直ちに移す必要があります(毎日2回チェックしてください)。
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Representative Results
記載されたマイクロインジェクションプロトコルの適用の代表例は、カルバラル・レハラスら5.ここでの目的は、An. gambiaeの実験室株 G3 の生殖細胞系列に自律型遺伝子駆動システムを挿入することであった。このシステムは、この種の第3染色体上の基底正角(Agcd)を標的とするように設計されており、オンモクロム生合成の最後のステップである3-ヒドロキシキヌレニンからキサントマチンへの変換を触媒するヘムペルオキシダーゼをコードする(図 11)。ホモ接合遺伝子の駆動を含む蚊は、幼虫、子犬および赤目表現型を有する新たに出現した成人を有する機能喪失型の枢機卿突然変異体である。ドライブ系を含むプラスミドpCO37は、アンガンビアナノス遺伝子オルソログの調節要素の制御下にあるストレプトコッカス・ピデンシスCas9(SpCas9)エンドノクリースを発現し、アンガンビアU6遺伝子プロモーターおよび3XP3-CFPマーカーの支配的なカセットを発現するアグドgRNA標的カット部位に隣接するゲノム領域に相同なDNA断片は、相同性指向修復(HDR)仲介統合を可能にする。
780個の野生型 アンガンビア胚 にSpCas9タンパク質と共にpCO37プラスミドを注射した。146の注入胚(18.7%;G0)は成人期まで生き残り、その後、異性の野生型メンバーに渡った。次世代(G1)の蛍光顕微鏡スクリーニングは、CFPマーカー遺伝子に陽性である3,428(0.09%)のうち3つを同定し、そのうち男性と女性の2つだけが生存した。分子アプローチ(遺伝子増幅、DNAシーケンシング)は、DNAの10kb〜10kbの正確な挿入を検証し、得られた株をAgNosCd-1と指定した。広範なフォローアップ分析は、AgNosCd-1が駆動において非常に効率的であり、抵抗性の対立遺伝子をほとんど作成し、遺伝子駆動システム5の統合および発現の結果として大きな遺伝的負荷(フィットネスコスト)を持たなかったことを示した。pCO37プラスミドは、マラリア原虫感染を防ぐために ガンビア の集団改質株を開発するためのバックボーンとして機能します。
図1:卵の収集装置。 卵の収集装置はフィルターペーパー、ナイロンメッシュ、歯科フィルムおよび改装された50 mL円錐形の管から成っている。装置は蚊が歯科フィルムのスリットによって容器にしっかり入れられるのを可能にする。フィルターペーパーとナイロンメッシュは、水を吸収することを可能にし、浸入のために湿ったが、浸水した表面を提供しない。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:アノフェレス・ガンビア胚A)成熟の様々な段階での胚のバッチ。B)矢印は、生殖細胞を含む胚内の位置である後極を示し、これは変換の意図された標的である。スケールバーは約1mmを表します。
図3:卵のコレクション 蚊が採卵装置の中に入ると、ddH2Oで湿らせたろん紙の層を含むペトリ皿に移動し、水位がキャップの高さが〜1/4に上昇するように水量を調整します。その後、採卵器とペトリ皿を暗くしたインキュベーターに入れ、蚊は合計45分間オビポジットを許します 。
図4: 胚発生 胚は短い時間枠の間に注入のためにだけ適している。開発中に早期に注入された卵はあまりにも繊細であり、損傷を受け、孵化しません。その開発の後半で注入された卵は硬化し、卵に注入されるあまりにも多くの遺伝物質を引き起こす原因針を壊すことができます。さらに、開発の後半で注射は、極細胞が急速にさらなる複製および分化を受けるにつれて生殖細胞に永久的な変化を引き起こす可能性が低い。写真は45分の排卵時間後10分ごとに撮影した。アスタリスク(*)は、注射に適した卵を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:膜スライド組み立て 卵はナイロン膜に沿って整列し、注入プロセス中に卵が動かないように支持構造を提供する。フィルターペーパーは、卵が注入を通して湿った状態を保つために水の貯蔵所として機能します。ガラススライドの端にフィルターペーパーとナイロン膜を置き、卵とそれらを水没させる水の両方のためのスペースを与えます。膜と濾紙がスライドの端から離れすぎると、胚と針の間の正しい角度を達成することは困難になります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マイクロインジェクションの胚向きA)胚は、前部よりも低い後極と整列し、膜を下る。B)胚は水に浸漬される。卵の上の水線の幅を平均胚の幅の約8分の1から4分の1に調整する。C)胚との針角のクローズアップ画像。スケールバーは約1mmを表します。
図7: 異常胚 着色やテクスチャで異常に見える胚は孵化しません。それらを注入しないでください。黄色の胚は、適切にメラ化されません。減らされた孵化はまた正常に現れる卵の貝(キューティックル)を持たない滑らかな胚で観察された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:マイクロインジェクション中の針の位置)射出段階の広角図。B、C)整列した胚が注射針と15°の角度を形成するように針を置く。マイクロインジェクション器具の腕を顕微鏡ステージよりも大幅に高く持って、胚を含む針とスライドの間の適切な釣り合いを確実にしないでください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:共軸制御と針ホルダーA)同軸制御(矢印)は、注射ごとに針の正確な配置を確実にするために針の3次元の動きを可能にする。スライドを切り替える際に針を垂直に上げるには、同軸コントロールを使用して、ステージ上に置いたときに針が新しいスライドと衝突しないようにすることが重要です。側面の同軸制御は後部棒に針の正確な浸透を可能にする。 B)注射用角度を示す針ホルダーの画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10:卵孵化用チャンバーA,B)注入した胚を二重蒸留水で4分の1の深さまで満たし、ろ過紙で裏打ちされた円筒形の容器に慎重に洗浄する。C,D)容器の動きは、卵が自然に濾紙に付着する原因となる。孵化のための容器を残す前に、濾紙より高く付着した卵が水位まで穏やかに洗い流されることを確認してください。青い楕円形は、相対的なサイズを示すために堆積卵の数をマークします。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 11.アノフェレスガンビアカーディナル(Agcd)遺伝子オルソログ、pCO37遺伝子駆動構築物及び得られた形質型。上)Agcd遺伝子:マルーンブロック、エキソン(E1-4);空のブロック、3'と5未翻訳領域(UTR)。濃い黒線、イントロン、および遺伝子間DNA。中) pCO37 プラスミド: Agcd遺伝子からの相同性の腕: マルーンブロック, 青いブロック, 優勢なマーカー遺伝子コンポーネント (3XP3 と CFP);タンブロック、駆動成分(ナノプロモーターおよびSpCas9タンパク質コード配列);緑色のブロック、ガイドRNA成分(U6プロモーターおよびgRNA配列)。pCO37の遺伝子と特徴は、スケールする必要はありません。SpCaS9/gRNA媒介切断部位(緑色の矢印)で開始された相同性指向修復(HDR)に起因する組換え(マルーン矢印)は、遺伝子駆動構築物の統合をもたらす。下)遺伝子駆動積分の結果として生じる可視の発現型:(左)CFP+(白/青矢印)およびホモ接合Agcd変異体(赤矢印)幼虫およびAgcd変異体(赤矢印)のフェノタイプ(右)ホモ接合Agcd変異型表現型「赤目」は成人において。カルバラール・レハラスらから適応(2020)と許可5で使用。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
CRISPR/Cas9のような精密で柔軟な遺伝子工学技術の利用可能性が高まるとともに、トランスジェニック生物は以前より簡単で安定した方法で開発することができます。これらのツールにより、研究者は、病原体への屈折性(集団改変)または遺伝性無菌(集団抑制)のいずれかの所望の特性を達成するのに非常に近い蚊ベクターのトランスジェニック株を作成することができました。しかし、可能な限り最も安全で安定した遺伝子組み換え蚊を開発するためには、フィールドスタディに最適なラインが選択されるように、追加のトランスジェニックラインを作成して評価する必要があります。記述されたプロトコルは、人口改変および抑制戦略のために追加の候補を開発できるように 、アノフェレスガンビア トランスジェニックを生成する効率を高めることができる。
記載のマイクロインジェクション手順は、蚊や他の節足動物ベクターのマイクロインジェクションを日常的に行う実験室で利用可能である可能性が高い機器および材料を利用する。プロトコル全体を通して細部への注意を維持することが重要です。品質による卵の選択や2番目のDNA沈殿などのステップのスキップなどのステップを急ぐことは、結果を損ない、孵化の減少と変換効率の低下を引き起こします。さらに、蚊の夫に注意を払わない場合、手順の多くの困難が発生する可能性があります。混雑した状態で飼育された蚊や栄養素の不足で飼育された蚊は、マイクロインジェクションワークフローのボトルネックを生み出し、注入された胚の所望の数に到達するために必要な時間を増加させる、より質の悪い14の卵を産む。
アノフェレスstephensi12のマイクロインジェクションに関して説明されている方法とは異なり、この方法は、胚の油の水没を必要とせず、より多くの胚を、油ベースの方法で必要とされる追加のステップなしでより短い時間で注入することができる。この方法と比較して、油性の方法と比較する制限は、マイクロインジェクションプロセス全体を通して見える視覚化が悪い。注射材料または胚細胞質が針に戻って流れていないことを確実にするためには、注射プロセスを通して常に針の背圧に注意を払う必要があります。
アフリカのマラリアベクターは、歴史的に他 のアノフェレスspp. と比較して遺伝的操作が困難であったが、それは世界中のマラリア症例に最大の貢献者である。マラリアの排除努力を補うために新しいツールが必要であり、蚊の個体数を改変または抑制するように設計されたトランスジェニック蚊は、排除を達成する上で重要な役割を果たすことができます。フィールドベースのマラリア排除研究のための最良のトランスジェニック候補を選択するには、いくつかのラインを評価して、最適な有効性と安全性15を比較して選択する必要があります。強化された屈折性または抑制を有するトランスジェニックラインを作成するために必要な遺伝的および分子的なビルディングブロックは、特徴付けられており、利用可能である。このプロトコルは、これらの屈折性または抑制的なラインを作成できる速度を上げるのに補佐し、検証努力が近い将来にフィールドトライアルの候補を選択し始める可能性があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、ドルシラ・スティリンジャー、キオナ・パーカー、パリッシュ・パウエル、マデリーン・トトリの蚊の夫に感謝しています。資金は、カリフォルニア大学アーバインマラリアイニシアチブによって提供されました。AAJはカリフォルニア大学アーバイン校のドナルド・ブレン教授です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
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