Summary
Mikroinjeksjonsteknikker er avgjørende for å introdusere eksogene gener i myggens genomer. Denne protokollen forklarer en metode som brukes av James-laboratoriet til å mikroinjekt DNA-konstruksjoner til Anopheles gambiae embryoer for å generere transformerte mygg.
Abstract
Embryomikroinjeksjonsteknikker er avgjørende for mange molekylære og genetiske studier av insektarter. De gir et middel til å introdusere eksogene DNA-fragmenter som koder gener av interesse, samt gunstige egenskaper i insektets bakterie på en stabil og arvelig måte. De resulterende transgene stammene kan studeres for fenotypiske endringer som følge av uttrykket av det integrerte DNA-et for å svare på grunnleggende spørsmål eller brukes i praktiske applikasjoner. Selv om teknologien er grei, krever den undersøkerens tålmodighet og praksis for å oppnå et ferdighetsnivå som maksimerer effektiviteten. Vist her er en metode for mikroinjeksjon av embryoer av den afrikanske malaria mygg, Anopheles gambiae. Målet er å levere med mikroinjeksjon eksogent DNA til embryoet slik at det kan tas opp i de utviklende bakteriecellene (pole). Uttrykk fra injisert DNA av transposaser, integraser, rekombinasjoner eller andre nukleaser (for eksempel CRISPR-assosierte proteiner, Cas) kan utløse hendelser som fører til kovalent innsetting i kromosomer. Transgen an. gambiae generert fra disse teknologiene har blitt brukt til grunnleggende studier av immunsystemkomponenter, gener involvert i blodfôring og elementer i det olfaktoriske systemet. I tillegg har disse teknikkene blitt brukt til å produsere An. gambiae stammer med egenskaper som kan bidra til å kontrollere overføringen av malariaparasitter.
Introduction
Mikroinjeksjonsteknikker har blitt brukt til å eksperimentelt manipulere organismer siden tidlig på 1900-tallet1. Mikroinjeksjon har blitt brukt til å studere både grunnleggende biologiske funksjoner og/eller innføre viktige endringer i biologien til en ønsket organisme. Mikroinjeksjonsteknikken har vært av spesiell interesse for vektorbiologer og har blitt mye brukt til å manipulere vektorgenomer2-11. Transgenese eksperimenter i leddyr vektorer ofte tar sikte på å gjøre vektorer mindre effektive til å overføre patogener ved enten å vedta endringer som reduserer en vektors kondisjon eller øke ildfasthet til patogener de overfører. Mygg overfører en rekke menneskelige patogener og har en betydelig innvirkning på sykelighet og dødelighet over hele verden. Anopheles-slekten av mygg overfører de menneskelige malaria parasittiske patogener, Plasmodium spp. Genteknologiske eksperimenter med Anopheles har som mål å bedre forstå biologien og redusere vektorkapasiteten til disse myggene i arbeidet med å utvikle nye malaria elimineringsstrategier.
Myggvektorene som bidrar med de mest malariainfeksjoner over hele verden er i Anopheles gambiae artskomplekset. Imidlertid har flertallet av vellykkede transgeneseforsøk blitt utført på malariavektoren til det indiske subkontinentet, Anopheles stephensi. Mens mange laboratorietilpassede Anopheles gambiae stammer eksisterer, antall transgene Anopheles gambiae spp. linjer rapportert i litteraturen ikke sammenlignet med anopheles stephensi. Det antas at Anopheles gambiae embryo er vanskeligere å injisere og oppnå vellykket transgenese enn Anopheles stephensi, selv om årsakene til disse forskjellene er ukjente. Denne protokollen beskriver en metode som har vist seg å være konsekvent vellykket for å oppnå transgenese av Anopheles gambiae embryoer via mikroinjeksjon. Protokollen er basert på en metode tidligere utviklet av Hervé Bossin og Benedict12 med noen ytterligere detaljer og endringer lagt til som har vist seg å øke effektiviteten av transgenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbereder mygg for mikroinjeksjon
- Frø et bur13 (~ 5000 cm3) med ~ 100 mannlige og 200-300 kvinnelige 1-2 dagers voksne post-eclosion mygg og la dem parre seg i 2 dager.
- Etter parringsperioden, gi mygg et blodmåltid ved hjelp av enten 2 ml blod med en kunstig fôringsenhet eller levende bedøvede dyr avhengig av insektpraksis14. Neste dag gir mygg et nytt blodmåltid for å sikre at alle parrede kvinner har hatt en mulighet til å mate og at delvis matede mygg har blitt fullt oppslukt.
- Bruk myggene til embryosamlinger 2-4 dager etter det andre blodmåltidet.
MERK: Larval ernæring er viktig for voksen robusthet og reproduktiv kondisjon. Se Benedict et al. (2020) for informasjon om hvordan du kan bake sunne insekter14. Ingen signifikante forskjeller i egglegging har blitt observert når mygg blir matet på en kunstig mater eller levende bedøvede dyr. Bruk hvilken metode som rutinemessig brukes for Anopheles gambiae i insektet.
2. Embryo forberedelse
- Bruk en aspirator til å plassere 20-30 kvinner i et gjennomsiktig konisk rør på 50 ml som er kuttet (med båndsag) for å være åpen i begge ender og er dekket med lateks tannfilm i den ene enden og nylonnett og filterpapir i den andre (Figur 1).
MERK: Mygga vil deponere eggene sine på filterpapiret, og nylonnettet vil holde filterpapiret sikkert på plass. Myggegg er sylindriske i form, ~ 500 μm i lengde, ~ 200 μm i diameter på sitt bredeste punkt, og avsmalnende i de fremre og bakre endene (Figur 2). - Legg det myggfylte røret i en liten (60 mm x 15 mm) Petri-tallerken fylt med dobbeltdestillert vann (ddH2O). Plasser røret og retten i en inkubator ved 28 °C i 45 minutter (Figur 3).
- Fjern røret fra inkubatoren og sett røret inn i et tomt bur. Trykk forsiktig på røret for å la mygg fly ut og fjerne røret fra buret når alle myggene har fløyet ut.
- Når røret er fritt for mygg, skru av bunnringen, fjern nylonet og bruk tang for å forsiktig fjerne filterpapiret med eggene fra røret. Legg filterpapiret i en Petri-tallerken av plast (100 mm x 15 mm) som inneholder et lag med filterpapir fuktet med ddH2O.
- Vær oppmerksom på eggene. Egg som har alderen til det punktet hvor de er lysegrå i farge (figur 4), er klare til justering.
- Hvis eggene fortsatt er hvite, returner dem til inkubatoren og kontroller fargen hver 5 min. Hvite egg er skjøre, brister lett, og overlever ikke godt etter injeksjonsprosessen, noe som resulterer i lav klekking.
- Egg som er mørkegrå eller svarte har alderen for mye. Ikke bruk dem.
3. Embryo justering
- Klipp et stykke nylon blotting membran (2 cm x 1 cm) med et barberblad, og sørg for at kanten er pent trimmet.
MERK: Hvis kanten ikke er rett, vil eggene ikke holde seg festet til membranen riktig under injeksjonsprosessen. - Sett en membran på en glasssklie og dekk membranen med et stykke filterpapir (2 cm x 2 cm), og la ~ 1 mm av membranfilteret bli avdekket (Figur 5).
MERK: Sørg for at mikroskoplysbildene er rene før bruk, og bruk rene tang for å manipulere membranfilteret. - Fukt filterpapiret med deionisert H2O som egg vil dø hvis det er tørket i lengre perioder.
MERK: Ikke legg for mye vann på papiret fordi embryoene vil bevege seg under injeksjonsprosessen, men sørg for at det er nok til å forhindre at embryoet tørker (Figur 6A, B). Overflødig vann kan fjernes ved å absorbere det med et stykke filterpapir. - Overfør forsiktig 30-50 embryoer til kanten av membranen med en pensel (størrelse # 0). Bruk børsten til å justere eggene vertikalt langs membranen ved å rulle dem forsiktig over på lysbildet slik at ventralsiden (konveks) vender oppover.
- Orienter alle eggene i samme retning slik at når eggene observeres under mikroskopet for mikroinjeksjon, er den bakre enden (mer spiss, figur 6A, B) i en ned-stilling og danner en vinkel på ~ 15° med nålen ( Figur6C). Line hele kanten av membranen med egg (30-50) og plasser lysbildet under mikroskopet for injeksjon.
MERK: Velg eggene nøye. Kast de som er hvite (for unge eller uutviklede) eller mørkegrå (for gamle og vil bryte nålen), og de unormale (Figur 7). Kontroller at filterpapiret til enhver tid er fuktig.
4. DNA-forberedelse
- Rens plasmid DNAer for injeksjon, i det minste, med et endotoksinfritt DNA-plasmid maxiprep-sett etter produsentens protokoller.
- Resuspend DNA i PCR-klasse vann og sentrifuge ved 17,100 x g i en nedkjølt sentrifuge i 30 min ved 4 °C. Overfør deretter supernatanten til et nytt, rent 1,5 ml konisk rør. Mikropipetten forsiktig for å unngå å overføre uønsket svevestøv fra kolonnen.
- Utfør en ny utfelling av DNA ved hjelp av en tiendedel volum 3M natriumacetat og et todelt volum på 100% etanol.
- Resuspend DNA i 300-500 μL PCR-grade vann for en endelig plasmid konsentrasjon på 1000 ng /μL. Bland plasmidcocktailen i injeksjonsbufferen for en endelig plasmidkonsentrasjon på 300-400 ng / μL og lag 10-20 μL aliquots.
MERK: DNA kan lagres ved -20 °C. DNA-mikroinjeksjons aliquots kan lagres ved -20 °C, eller ved -80 °C ved bruk av RNA-komponenter. Ikke overskrid 800 ng/μL DNA i injeksjonsblandingen fordi viskositet vil føre til at nålene tetter seg.
5. Nål forberedelse
- Lag nålene ved å trekke 10 cm kvarts kapillærer ved hjelp av en programmerbar mikropipettetrekker.
- Undersøk nålen under mikroskopet for å sikre at spissen dannes godt. Påse at nåleinnstillingen på den programmerbaretrekkeren gir en spiss som begynner å avsmalne ~0,5 mm fra klemmeenden og ender i et fint punkt (se figur 6). Nåler som bryter lett har vanligvis for lang kon.
MERK: Forholdene kan variere avhengig av nåletrekkeren (Forfatterne vil gjøre tilgjengelig på forespørsel innstillingene for den programmerbare pulleren de bruker. Journalbegrensninger hindrer oss i å sitere et bestemt merke). Nåler kan trekkes for hånd, men dette krever et ferdighetssett som ikke er tilgjengelig i de fleste laboratorier.
6. Embryo mikroinjeksjon
- Bruk en mikrolasterspiss til å fylle nålene med 2 μL DNA-blanding. Sett nålen inn i nåleholderen og koble til den automatiske trykkpumpeslangen (Figur 8).
- Viktig: Juster nålen slik at den gjør en vinkel på 15° med glideplanet (figur 8).
- Åpne nålespissen ved å berøre det første egget forsiktig og injiser det ved å sette inn spissen av nålen ≤ 10 μm i bakre pol. En vellykket injeksjon vil føre til en liten bevegelse av cytoplasma i egget.
- Bruk koaksialtrinnkontrollene i mikroskopet til å gå til neste egg for å fortsette injeksjonen.
- For å sikre at nålespissen forblir åpen og ikke er tilstoppet, trykker du på Injiser-knappen før du går inn i et annet embryo og visualiserer det lille dråpet ved åpningen av nålen.
- Hvis kanylen blir tilstoppet, trykker du på Clear-knappen for å fjerne kanylen og gjenta dråpevisualiseringstesten. Juster trykket etter behov hvis nålespissåpningen blir litt større for å sikre at størrelsen på dråpen forblir liten.
- Injiser ~40-50 egg med en nål.
MERK: Sørg for at filterpapiret holder seg fuktig til enhver tid. Hold tilstrekkelig tilbaketrykk på kanylen for å holde den ryddet. En nål som ikke kan fjernes må erstattes med en ny nål. Embryoplassering, nålinnsetting og injeksjon gjøres enklere med mikroskoper som har koaksiale kontroller for horisontal bevegelse av scenen (figur 9).
- Når injeksjonene er fullført, skyll eggene i en glassbeholder foret med filterpapir og fylt med 50 ml deionisert H2O (Figur 10).
MERK: Embryoer vil begynne å klekke 2 dager etter injeksjon og kan ta så lang tid som 3-5 dager. Klekket først instar larver må overføres umiddelbart (sjekk 2 ganger daglig) til en ren beholder med vann og mat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et representativt eksempel på anvendelsen av den beskrevne mikroinjeksjonsprotokollen finnes i Carballar-Lejarazú et al5. Hensikten her var å sette inn et autonomt gendriftssystem i bakterien av en laboratoriestamme, G3, av An. gambiae. Systemet ble designet for å målrette kardinal ortholog locus (Agcd) på det tredje kromosomet i denne arten, som koder en heme peroxidase som katalyserer konverteringen av 3-hydroksykynurenin til xantmathomin, det siste trinnet i ommokrome biosyntese (Figur 11). Homozygot gendriftholdige mygg er tap av funksjonkardinalmutanter med larver, pupper og nyoppdagede voksne som har en rødøye fenotype. En plasmid, pCO37, inneholder drivsystemet uttrykker Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) endonuclease under kontroll av regulatoriske elementer av An. gambiae nanos gen ortholog, en 23-nukleotid guide RNA (gRNA) under kontroll av en An. gambiae U6 genpromotor og en 3XP3-CFP dominerende markørkassett som uttrykker cyan fluorescerende protein for å identifisere transgen Agcd DNA-fragmenter homologe til genomiske regioner som flankerer gRNA-målkuttstedet, gjør mulig homologistyrt reparasjons- (HDR) mediert integrasjon.
Syv hundre åtti ville type An. gambiae embryoer ble injisert med pCO37 plasmid sammen med SpCas9 protein. Hundre førtiseks injiserte embryoer (18,7%; G0) overlevde til voksenstadiet og ble senere overveid til ville medlemmer av motsatt kjønn. Fluorescerende mikroskopscreening av neste generasjon (G1) avkom identifiserte tre av 3428 (0,09%) som var positive for CFP-markørgenet, hvorav bare to, en mann og kvinne, overlevde. Molekylære tilnærminger (genforsterkning, DNA-sekvensering) verifiserte nøyaktig innsetting av ~ 10 kb DNA og den resulterende stammen ble utpekt AgNosCd-1. Omfattende oppfølgingsanalyser viste at AgNosCd-1 var svært effektiv på stasjonen, skapte få resistente alleler og ikke hadde noen stor genetisk belastning (treningskostnader) som følge av integrering og uttrykk for gendriftssystemet5. pCO37-plasmiden fungerer som ryggrad for å utvikle befolkningsmodifiseringsstammer av An. gambiae for å forhindre overføring av malariaparasitter.
Figur 1: Eggoppsamlingsenhet. Eggoppsamlingsenheten består av filterpapir, nylonnett, tannfilm og et ettermontert 50 ml konisk rør. Enheten gjør at mygg kan deponeres av aspirator sikkert i beholderen via spalten i tannfilm. Filterpapiret og nylonnettet gjør at vann kan absorberes, noe som gir en fuktig, men ikke oversvømmet overflate, for oviposisjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Anopheles gambiae embryoer. A) En gruppe embryoer i ulike stadier av modning. B) Pilene indikerer den bakre polen, plasseringen i embryoet som inneholder bakterieceller, som er de tiltenkte målene for transformasjon. Skalalinjen representerer ~1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eggsamling. Når myggene er plassert inne i eggoppsamlingsenheten, flyttes den til en Petri-tallerken som inneholder et lag med filterpapir fuktet med ddH2O. Juster vannvolumet slik at vannstanden stiger til ~ 1/4 høyden på hetten. Eggoppsamlingsenheten og Petri-parabolen plasseres deretter i en mørk inkubator og mygg tillatt å oviposit i totalt 45 min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Embryoutvikling. Embryoene er bare egnet for injeksjon i løpet av et kort tidsvindu. Egg som injiseres for tidlig i utviklingen er for delikate og vil lide skade og ikke luke. Egg som injiseres senere i utviklingen blir herdet og kan bryte nålen og forårsake for mye genetisk materiale til å bli injisert i egget. I tillegg er det mindre sannsynlig at injeksjoner senere i utviklingen vil forårsake permanente endringer i bakterien, da stangceller raskt gjennomgår ytterligere replikasjon og differensiering. Bilder ble tatt hver 10 min etter oviposisjonstid på 45 min. Stjernene (*) indikerer egg som er egnet for injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Montering av membransklie. Eggene er justert langs nylonmembranen, som gir en støttestruktur slik at eggene ikke beveger seg under injeksjonsprosessen. Filterpapiret fungerer som et reservoar for vann for å sikre at eggene holder seg fuktige gjennom hele injeksjonen. Plasser filterpapiret og nylonmembranen nær kanten av glasssklie, slik at det er plass til både egg og vann som senker dem ned. Hvis membranen og filterpapiret er for langt fra kanten av lysbildet, vil det være vanskelig å oppnå riktig vinkel mellom embryoer og nål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Embryoorientering for mikroinjeksjon. A) Embryoer er på linje med bakre poler lavere enn fremre, kjører ned membranen. B) Embryoene er nedsenket i vann; juster bredden på vannlinjen over egget til å være omtrent en åttende til en fjerdedel bredden på et gjennomsnittlig embryo. C) Nærbilde av nålevinkel med embryoer. Skalalinjen representerer ~1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Unormale embryoer. Embryoer som virker unormale i farge eller tekstur, vil ikke klekkes; Ikke injiser dem. Embryoer som er gule i fargen, vil ikke melanisere riktig. Redusert klekking er også observert i glatte embryoer som ikke har normale eggeskall (kutikkler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Nåleposisjon under mikroinjeksjonene. A) Vidvinkelvisning av injeksjonsstadiet. B,C) Plasser kanylen slik at de justerte embryoene danner en vinkel på 15° med injeksjonsnålen. Ikke løft armen på mikroinjeksjonsinstrumentet som holder nålen betydelig høyere enn mikroskopstadiet for å sikre riktig sportsfiske mellom nålen og gli som inneholder embryoene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Koaksiale kontroller og nåleholder. A) De koaksiale kontrollene (pilen) tillater 3-dimensjonal bevegelse av nålen for å sikre presis plassering av nålen for hver injeksjon. Det er viktig å bruke koaksiale kontroller for å heve nålen vertikalt når du bytter lysbilder, slik at nålen ikke kolliderer med det nye lysbildet når den settes på plass på scenen. Laterale koaksiale kontroller gir nøyaktig penetrasjon av nålen inn i bakre pol. B) Bilde av nåleholderen som viser injeksjonsvinkelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Kammer for egg klekking. A,B)Vask forsiktig injiserte embryoer i en sylindrisk beholder fylt til en kvart dybde med dobbeltdestillert vann og foret med filterpapir. C,D) Bevegelse av beholderen fører til at eggene naturlig fester seg til filterpapiret. Før du forlater beholderen for klekking, må du sørge for at egg som har festet seg høyere opp i filterpapiret, vaskes forsiktig ned til vannstanden. Den blå ovalen markerer en rekke avsatte egg for å vise relativ størrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11. Anopheles gambiae kardinal (Agcd) gen ortholog, pCO37 gen drive konstruksjon og resulterende fenotyper. Topp) Agcd gen: maroon blokker, exons (E1-4); tomme blokker, 3' - og 5-ikke-oversatte regioner (UTR); tykk svart linje, introner og intergenisk DNA. Midten) pCO37 plasmid: homologi armer fra Agcd gen: maroon blokker, blå blokker, dominerende markør genkomponenter (3XP3 og CFP); solbrune blokker, drivkomponenter (nanos promoter og SpCas9 protein-koding sekvenser); grønne blokker, guide RNA-komponenter (U6-promotor og gRNA-sekvens). Gener og egenskaper av pCO37 skal ikke skaleres. Rekombinasjon (maroon piler) som følge av homologi rettet reparasjon (HDR) initiert på SpCaS9 / gRNA-mediert cut site (grønn pilspiss) resulterer i integrasjon av gen stasjonen konstruksjon. Bunn) resulterende synlige fenotyper av gendrift integrasjon: (venstre) CFP+ (hvit / blå pil) og homozygot Agcd-mutant (rød pil) fenotyper i larver og Agcd-mutant(rød pil) fenotyper i pupper. (høyre) Homozygot Agcd mutant fenotype "røde øyne" hos voksne. Tilpasset fra Carballar-Lejarazú et al. (2020) og brukes med tillatelse5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med økt tilgjengelighet av presise og fleksible genteknologier som CRISPR/Cas9, kan transgene organismer utvikles på en enklere og mer stabil måte enn tidligere mulig. Disse verktøyene har gjort det mulig for forskere å lage transgene stammer av myggvektorer som er svært nær å oppnå de ønskede egenskapene til enten ildfasthet mot patogener (befolkningsmodifisering) eller arvelig sterilitet (befolkningsundertrykkelse). Men for å utvikle de mest sikre og stabile genetisk modifiserte myggene som er mulig, må ytterligere transgene linjer opprettes og evalueres slik at optimale linjer velges for feltstudier. Protokollen som beskrives kan øke effektiviteten ved å generere Anopheles gambiae transgenics slik at flere kandidater kan utvikles for befolkningsmodifisering og undertrykkelsesstrategier.
Mikroinjeksjonsprosedyren som er beskrevet, bruker utstyr og materialer som sannsynligvis er tilgjengelige i et laboratorium som rutinemessig utfører mikroinjeksjoner av mygg eller andre leddyrvektorer. Det er viktig å holde oppmerksomheten på detaljer gjennom hele protokollen. Rushing gjennom trinn som å velge egg etter kvalitet eller hoppe over trinn som den andre DNA-nedbøren vil svekke resultatene og forårsake redusert klekking og redusert transformasjonseffektivitet. I tillegg kan mange vanskeligheter med prosedyren oppstå hvis det ikke tas hensyn til mygghold. Mygg som oppdrettes under overfylte forhold eller med mangel på næringsstoffer, vil legge mindre egg av dårligere kvalitet14, noe som skaper flaskehalser i mikroinjeksjonsarbeidsflyten og vil øke tiden som trengs for å nå et ønsket antall injiserte embryoer.
I motsetning til metoder beskrevet for mikroinjeksjon av Anopheles stephensi12, krever denne metoden ikke oljesenking av embryoene, og flere embryoer kan injiseres på kortere tid uten de ekstra trinnene som kreves av den oljebaserte metoden. En begrensning i denne metoden sammenlignet med den oljebaserte metoden er dårligere visualisering gjennom mikroinjeksjonsprosessen. For å sikre at injeksjonsmaterialet eller embryocytoplasma ikke strømmer tilbake i nålen, må oppmerksomheten holdes til nålens baktrykk til enhver tid gjennom injeksjonsprosessen.
Den afrikanske malariavektoren har vært historisk vanskelig å genetisk manipulere sammenlignet med andre Anopheles spp., men det er den største bidragsyteren til malaria tilfeller over hele verden. Nye verktøy er nødvendig for å aide malaria eliminering innsats og transgene mygg designet for å enten endre eller undertrykke myggpopulasjoner kan spille en viktig rolle i å oppnå eliminering. For å velge de beste transgene kandidatene for feltbaserte malaria elimineringsstudier, bør en rekke linjer evalueres slik at de kan sammenlignes og velges for optimal effekt og sikkerhet15. De genetiske og molekylære byggesteinene som trengs for å skape transgene linjer med forbedret ildfasthet eller undertrykkelse er karakterisert og tilgjengelig. Denne protokollen vil bidra til å øke hastigheten som disse ildfaste eller undertrykkende linjene kan opprettes med, slik at valideringsarbeidet kan begynne å velge en kandidat for feltforsøk i nær fremtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell og Madeline Nottoli for mygghold. Finansieringen ble gitt av University of California, Irvine Malaria Initiative. AAJ er professor i Donald Bren ved University of California, Irvine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
