Summary
Técnicas de microinjeção são essenciais para introduzir genes exógenos nos genomas dos mosquitos. Este protocolo explica um método usado pelo laboratório James para microinjetar construções de DNA em embriões Anopheles gambiae para gerar mosquitos transformados.
Abstract
Técnicas de microinjeção de embriões são essenciais para muitos estudos moleculares e genéticos de espécies de insetos. Eles fornecem um meio de introduzir fragmentos de DNA exógenos codificando genes de interesse, bem como traços favoráveis na germinação de insetos de forma estável e hereitária. As cepas transgênicas resultantes podem ser estudadas para alterações fenotípicas resultantes da expressão do DNA integrado para responder a perguntas básicas ou usadas em aplicações práticas. Embora a tecnologia seja simples, requer paciência e prática do investigador para alcançar um nível de habilidade que maximize a eficiência. Mostrado aqui é um método de microinjeção de embriões do mosquito africano da malária, Anopheles gambiae. O objetivo é entregar por microinjeção DNA exógeno ao embrião para que possa ser tomado nas células germinas em desenvolvimento (polo). A expressão do DNA injetado de transposases, integrases, recombinases ou outros nucleases (por exemplo, proteínas associadas ao CRISPR, Cas) pode desencadear eventos que levam à sua inserção covalente em cromossomos. A gambiae transgênica gerada a partir dessas tecnologias tem sido usada para estudos básicos de componentes do sistema imunológico, genes envolvidos na alimentação sanguínea e elementos do sistema olfativo. Além disso, essas técnicas têm sido utilizadas para produzir cepas de An. gambiae com características que podem ajudar a controlar a transmissão de parasitas da malária.
Introduction
Técnicas de microinjeção têm sido usadas para manipular experimentalmenteorganismos desde o início dos anos 1900. A microinjeção tem sido usada para estudar ambas as funções biológicas básicas e/ou introduzir mudanças importantes na biologia de um organismo desejado. A técnica de microinjeção tem sido de particular interesse para biólogos vetoriais e tem sido amplamente utilizada para manipular genomas vetoriais2-11. Experimentos de transgênese em vetores de artrópodes muitas vezes visam tornar os vetores menos eficientes na transmissão de patógenos, promulgando alterações que diminuem a aptidão de um vetor ou aumentam a refratabilidade aos patógenos que transmitem. Os mosquitos transmitem uma variedade de patógenos humanos e têm um impacto significativo na morbidade e mortalidade em todo o mundo. O gênero Anopheles de mosquitos transmite os patógenos parasiticos da malária humana, Plasmodium spp. Experimentos de engenharia genética com Anopheles têm como objetivo entender melhor a biologia e reduzir a capacidade vectorial desses mosquitos nos esforços para desenvolver novas estratégias de eliminação da malária.
Os vetores de mosquitos que mais contribuem para as infecções por malária no mundo estão no complexo de espécies anopheles gambiae. No entanto, a maioria dos experimentos bem sucedidos de transgênese foram realizados no vetor da malária do subcontinente indiano, Anopheles stephensi. Embora existam muitas cepas de Anopheles gambiae adaptadas em laboratório, o número de linhas transgênicas de Anopheles gambiae spp. relatadas na literatura não se compara à de Anopheles stephensi. Acredita-se que o embrião anofelino gambiae é mais difícil de injetar e alcançar transgênese bem sucedida do que Anopheles stephensi, embora as razões para essas diferenças sejam desconhecidas. Este protocolo descreve um método que tem sido consistentemente bem sucedido na obtenção de transgênese de embriões anofelinos gambiae via microinjeção. O protocolo é baseado em um método anteriormente desenvolvido por Hervé Bossin e Mark Benedict12 com alguns detalhes adicionais e alterações adicionadas que foram encontrados para aumentar a eficiência da transgênese.
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Protocol
1. Preparação de mosquitos para microinjeção
- Semente uma gaiola13 (~5000 cm3) com ~100 machos e 200-300 fêmeas 1-2 dias mosquitos pós-eclosão adultos e permitem que eles acasalem por 2 dias.
- Após o período de acasalamento, forneça aos mosquitos uma refeição sanguínea usando 2 mL de sangue com um dispositivo de alimentação artificial ou animais anestesiados vivos, dependendo das práticas insetíduas14. No dia seguinte, forneça aos mosquitos uma segunda refeição de sangue para garantir que todas as fêmeas acasaladas tenham tido a oportunidade de se alimentar e que mosquitos parcialmente alimentados tenham se tornado totalmente engorgados.
- Utilize os mosquitos para coletas de embriões 2-4 dias após a segunda refeição sanguínea.
NOTA: A nutrição larval é importante para a robustez adulta e o condicionamento reprodutivo. Consulte Benedict et al. (2020) para obter informações sobre como criar insetos saudáveis14. Não foram observadas diferenças significativas na colocação de ovos quando os mosquitos são alimentados com um alimentador artificial ou animais anestesiados vivos. Use qualquer método que seja usado rotineiramente para Anopheles gambiae no inseto.
2. Preparação do embrião
- Use um aspirador para colocar 20-30 fêmeas em um tubo cônico transparente de 50 mL que foi cortado (com uma serra de banda) para ser aberto em ambas as extremidades e é coberto com filme dental de látex em uma extremidade e malha de nylon e papel filtro na outra(Figura 1).
NOTA: Os mosquitos depositarão seus ovos no papel do filtro e a malha de nylon manterá o papel do filtro firmemente no lugar. Os ovos de mosquito são cilíndricos em forma, ~500 μm de comprimento, ~200 μm de diâmetro em seu ponto mais largo, e afunilando nas extremidades anterior e posterior(Figura 2). - Coloque o tubo cheio de mosquitos em uma pequena placa de Petri (60 mm x 15 mm) cheia de água dupla destilada (ddH2O). Coloque o tubo e o prato em uma incubadora a 28 °C por 45 min(Figura 3).
- Retire o tubo da incubadora e insira o tubo em uma gaiola vazia. Bata suavemente no tubo para permitir que os mosquitos voem para fora e remova o tubo da gaiola uma vez que todos os mosquitos tenham voado para fora.
- Quando o tubo estiver livre de mosquitos, desaparafusar o anel inferior, remover o nylon e usar fórceps para remover cuidadosamente o papel filtro com os ovos do tubo. Coloque o papel filtro em uma placa de Petri de plástico (100 mm x 15 mm) contendo uma camada de papel filtro umedecido com ddH2O.
- Observe os ovos. Os ovos que envelheceram até o ponto em que são de cor cinza claro(Figura 4) estão prontos para o alinhamento.
- Se os ovos ainda estiverem brancos, devolva-os à incubadora e verifique a cor a cada 5 minutos. Os ovos brancos são frágeis, rompem facilmente e não sobrevivem bem após o processo de injeção que resulta em baixa eclosão.
- Ovos que são cinza escuro ou preto envelheceram demais. Não os use.
3. Alinhamento embrionário
- Corte um pedaço de membrana de mancha de nylon (2 cm x 1 cm) com uma lâmina de barbear, certificando-se de que a borda está bem aparada.
NOTA: Se a borda não estiver reta, os ovos não permanecerão afixados na membrana corretamente durante o processo de injeção. - Coloque uma membrana em uma lâmina de vidro e cubra a membrana com um pedaço de papel filtro (2 cm x 2 cm), deixando ~1 mm do filtro de membrana descoberto(Figura 5).
NOTA: Certifique-se de que as lâminas do microscópio estejam limpas antes do uso e use fórceps limpos para manipular o filtro de membrana. - Molhe o papel filtro com H2O desionizado, pois os ovos morrerão se dessecados por longos períodos de tempo.
NOTA: Não coloque muita água no papel porque os embriões se moverão durante o processo de injeção, mas certifique-se de que há o suficiente para evitar que o embrião seque(Figura 6A, B). O excesso de água pode ser removido absorvendo-o com um pedaço de papel filtro. - Transfira suavemente 30-50 embriões para a borda da membrana com um pincel (tamanho #0). Use a escova para alinhar os ovos verticalmente ao longo da membrana, enrolando-os suavemente sobre a lâmina para que o lado ventral (convexo) esteja voltado para cima.
- Oriente todos os ovos na mesma direção para que quando os ovos são observados sob o microscópio de microinjeção, a extremidade posterior (mais pontiaguda, Figura 6A, B) esteja em posição de baixa e forme um ângulo de ~15° com a agulha(Figura 6C). Fore toda a borda da membrana com ovos (30-50) e coloque o slide sob o microscópio para injeção.
NOTA: Escolha os ovos com cuidado. Descarte aqueles que são brancos (muito jovens ou não desenvolvidos) ou cinza escuro (muito velho e vai quebrar a agulha), e os anormais(Figura 7). Certifique-se de que o papel do filtro permaneça úmido o tempo todo.
4. Preparação de DNA
- Purifique DNAs plasmídeos para injeção, no mínimo, com um kit de maxiprep plasmídeo de DNA sem endotoxina seguindo os protocolos do fabricante.
- Resuspenque o DNA em água de grau PCR e centrífuga a 17.100 x g em uma centrífuga refrigerada por 30 min a 4 °C. Em seguida, transfira o supernasal para um novo tubo cônico limpo de 1,5 mL. Cuidadosamente micro-pipeta para evitar a transferência de material particulado indesejado da coluna.
- Realize uma segunda precipitação de DNA usando um décimo de volume de acetato de sódio 3M e um volume de duas vezes de 100% de etanol.
- Resuspend o DNA em 300-500 μL de água de grau PCR para uma concentração plasmida final de 1000 ng/μL. Misture o coquetel plasmídeo no tampão de injeção para uma concentração plasmida final de 300-400 ng/μL e faça 10-20 μL aliquots.
NOTA: O DNA pode ser armazenado a -20 °C. As alíquotas de microinjeção de DNA podem ser armazenadas a -20 °C ou a -80 °C se usarem componentes de RNA. Não exceda 800 ng/μL de DNA na mistura de injeção porque a viscosidade fará com que as agulhas obstruam.
5. Preparação da agulha
- Faça as agulhas puxando capilares de quartzo de 10 cm usando um puxador de micropipette programável.
- Examine a agulha sob microscópio para garantir que a ponta esteja bem formada. Certifique-se de que a configuração da agulha no puxador programável produz uma ponta que começa a afunilar ~0,5 mm da extremidade do terminal e termina em um ponto fino (ver Figura 6). Agulhas que quebram facilmente geralmente têm muito tempo de uma fita.
NOTA: As condições podem diferir dependendo do puxador de agulha (os autores disponibilizarão a pedido as configurações do puxador programável que utilizam. Restrições de revistas nos impedem de citar uma marca específica). Agulhas podem ser puxadas à mão, mas isso requer um conjunto de habilidades não disponível na maioria dos laboratórios.
6. Microinjeção de embriões
- Use uma ponta de microcarregador para encher as agulhas com 2 μL de mistura de DNA. Insira a agulha no suporte da agulha e conecte o tubo automatizado da bomba de pressão(Figura 8).
- Importante: Alinhe a agulha para que ela faça um ângulo de 15° com o plano do slide(Figura 8).
- Abra a ponta da agulha tocando cuidadosamente o primeiro ovo e injete-o inserindo a ponta da agulha ≤ 10 μm no poste posterior. Uma injeção bem sucedida levará a um pequeno movimento do citoplasma dentro do ovo.
- Use os controles de estágio coaxial do microscópio para mover-se para o próximo ovo para continuar a injeção.
- Para garantir que a ponta da agulha permaneça aberta e não tenha entupido, pressione o botão Injetar antes de inserir outro embrião e visualize a pequena gota na abertura da agulha.
- Se a agulha ficar entupida, pressione o botão Limpar para limpar a agulha e repetir o teste de visualização de gotículas. Ajuste a pressão conforme necessário se a abertura da ponta da agulha ficar ligeiramente maior para garantir que o tamanho da gota permaneça pequeno.
- Injete ~40-50 ovos com uma agulha.
NOTA: Certifique-se de que o papel do filtro permaneça úmido o tempo todo. Mantenha pressão suficiente na agulha para mantê-la limpa. Uma agulha que não pode ser desocupada deve ser substituída por uma nova agulha. Colocação embrionária, inserção de agulhas e injeção são facilitam com microscópios que possuem controles coaxiais para o movimento horizontal do palco(Figura 9).
- Após as injeções completas, enxágue os ovos em um recipiente de vidro forrado com papel filtro e preenchido com 50 mL de H2O desionizado(Figura 10).
NOTA: Os embriões começarão a eclodir 2 dias após a injeção e podem levar até 3-5 dias. As primeiras larvas instar eclodidas devem ser transferidas imediatamente (verifique 2 vezes por dia) para um recipiente limpo com água e alimentos.
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Representative Results
Um exemplo representativo da aplicação do protocolo de microinjeção descrito pode ser encontrado em Carballar-Lejarazú et al5. A intenção aqui era inserir um sistema autônomo de acionamento genético na linha germinal de uma cepa de laboratório, G3, de An. gambiae. O sistema foi projetado para atingir o lócus ortolog cardeal (Agcd) no terceiro cromossomo desta espécie, que codifica uma peroxidase heme que catalisa a conversão de 3-hidroxiquilenrina para xanthommatina, o último passo na biossíntese ommocromática(Figura 11). Mosquitos homozigos que contêm unidade de genes são mutantes cardeais com larvas, pupas e adultos recém-emergidos com um fenótipo de olho vermelho. Um plasmídeo, pCO37, contendo o sistema de acionamento expressa Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) endonuclease sob controle dos elementos regulatórios do An. Gâmbiae nanos gene ortolog, um guia de 23 nucleotídeos RNA (gRNA) sob o controle de um promotor genético An. gambiae U6 e um marcador dominante 3XP3-CFP expressando a proteína fluorescente de ciano para identificar progênero transgênico. Agcd Fragmentos de DNA homólogos de regiões genômicas que flanqueam o local de corte de alvo do gRNA possibilitam a integração mediada por reparo direcionado à ímologia (HDR).
780 embriões de gambiae tipo 780 foram injetados com o plasmídeo pCO37 juntamente com a proteína SpCas9. Cento e quarenta e seis embriões injetados (18,7%; G0) sobreviveu ao estágio adulto e foi superado posteriormente por membros do sexo oposto. A triagem de microscópio fluorescente da prole da próxima geração (G1) identificou três dos 3.428 (0,09%) positivos para o gene marcador CFP, dos quais apenas dois, um homem e uma fêmea, sobreviveram. Abordagens moleculares (amplificação genética, sequenciamento de DNA) verificaram a inserção precisa de ~10 kb de DNA e a cepa resultante foi designada AgNosCd-1. Extensas análises de acompanhamento mostraram que o AgNosCd-1 era altamente eficiente na unidade, criava poucos alelos resistentes e não tinha carga genética importante (custos de aptidão) como resultado da integração e expressão do sistema de acionamento genético5. O plásmido pCO37 serve como espinha dorsal para o desenvolvimento de modificações populacionais de An. gambiae para prevenir a transmissão de parasitas da malária.
Figura 1: Dispositivo de coleta de ovos. O dispositivo de coleta de ovos é composto por papel filtro, malha de nylon, película dentária e um tubo cônico de 50 mL adaptado. O dispositivo permite que os mosquitos sejam depositados pelo aspirador com segurança no recipiente através da fenda em filme dentário. O papel filtro e a malha de nylon permitem que a água seja absorvida, o que proporciona uma superfície úmida, mas não inundada, para oviposição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Embriões anofelinos gambiae. A) Um lote de embriões em diferentes estágios de maturação. B) As setas indicam o polo posterior, a localização dentro do embrião que contém células germinativas, que são os alvos pretendidos para a transformação. A barra de escala representa ~1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Coleta de ovos. Uma vez que os mosquitos são colocados dentro do dispositivo de coleta de ovos, ele é movido para uma placa de Petri contendo uma camada de papel filtro umedecido com ddH2O. Ajuste o volume de água para que o nível de água suba para ~1/4 a altura da tampa. O dispositivo de coleta de ovos e a placa de Petri são então colocados em uma incubadora escurecida e mosquitos permitidos para oviposit por um total de 45 minutos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Desenvolvimento de embriões. Os embriões só são adequados para injeção durante uma janela de pouco tempo. Os ovos que são injetados prematuramente em desenvolvimento são muito delicados e sofrerão danos e não escotilha. Os ovos que são injetados mais tarde em seu desenvolvimento tornam-se endurecidos e podem quebrar a agulha fazendo com que muito material genético seja injetado no ovo. Além disso, injeções mais tarde em desenvolvimento são menos propensas a causar mudanças permanentes na germinação à medida que as células polo sofre rapidamente mais replicação e diferenciação. Fotos foram tiradas a cada 10 minutos após o tempo de oviposição de 45 min. Os asteriscos (*) indicam ovos adequados para injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Montagem de lâmina de membrana. Os ovos estão alinhados ao longo da membrana de nylon, que fornece uma estrutura de suporte para que os ovos não se movam durante o processo de injeção. O papel filtro serve como um reservatório para a água para garantir que os ovos permaneçam úmidos durante toda a injeção. Coloque o papel filtro e a membrana de nylon perto da borda do escorregador de vidro, permitindo espaço tanto para os ovos quanto para a água que os submerge. Se a membrana e o papel filtro estiverem muito longe da borda do slide, alcançar o ângulo correto entre embriões e agulha será difícil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Orientação embrionária para microinjeção. A) Os embriões estão alinhados com os polos posteriores inferiores aos anteriores, escorrendo pela membrana. B) Os embriões estão imersos em água; ajustar a largura da linha de água acima do ovo para ser aproximadamente um oitavo a um quarto da largura de um embrião médio. C) Imagem de close-up do ângulo da agulha com embriões. A barra de escala representa ~1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Embriões anormais. Embriões que parecem anormais na coloração ou textura não chocarão; não injetá-los. Embriões de cor amarela não se misturam adequadamente. A eclosão reduzida também tem sido observada em embriões lisos que não possuem cascas de ovos (cutículas) de aparecimento normal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Posição da agulha durante as microinjeções. A) Visão grande angular do estágio de injeção. B,C) Posicione a agulha para que os embriões alinhados formem um ângulo de 15° com a agulha de injeção. Não eleve o braço do instrumento de microinjeção que mantém a agulha significativamente maior do que o estágio do microscópio para garantir a adequada angling entre a agulha e slide contendo os embriões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Controles coaxiais e porta-agulhas. A) Os controles coaxiais (seta) permitem o movimento tridimensional da agulha para garantir a colocação precisa da agulha para cada injeção. É importante usar controles coaxiais para levantar a agulha verticalmente ao trocar slides para que a agulha não colida com o novo slide ao colocá-la no lugar no palco. Os controles coaxiais laterais permitem uma penetração precisa da agulha no polo posterior. B) Imagem do suporte da agulha mostrando ângulo para injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Câmara para eclosão de ovos. A,B) Lave cuidadosamente os embriões injetados em um recipiente cilíndrico cheio a um quarto de profundidade com água duplamente destilada e forrado com papel filtro. C,D) O movimento do recipiente faz com que os ovos aderam naturalmente ao papel filtro. Antes de deixar o recipiente para eclodir, certifique-se de que todos os ovos que aderiram mais alto ao papel do filtro sejam suavemente lavados de volta ao nível da água. O oval azul marca uma série de ovos depositados para mostrar tamanho relativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11. Ortologo genético Anopheles gambiae (Agcd),construção de unidade genética pCO37 e fenótipos resultantes. Topo) Gene Agcd: blocos marrons, exons (E1-4); blocos vazios, regiões de 3'e 5 não traduzidas (UTR); linha preta grossa, introns e DNA intergênico. Médio) pCO37 plasmid: braços de homologia do gene Agcd: blocos marrons, blocos azuis, componentes genéticos marcadores dominantes (3XP3 e CFP); blocos bronzeados, componentes de unidade(nanos promoter e sequências de codificação de proteína spcas9); blocos verdes, guiar componentes RNA (promotor U6 e sequência gRNA). Genes e características do pCO37 não são dimensionados. A recombinação (setas marrons) resultante do reparo direcionado à homologia (HDR) iniciado no local de corte mediado por SpCaS9/gRNA (ponta-verde) resulta na integração da construção da unidade genética. Inferior) resultantes fenótipos visíveis da integração do gene drive: (esquerda) CFP+ (seta branca/azul) e fenótipos homozigos Agcd-mutante (seta vermelha) em larvas e fenótipos Agcd-mutante (seta vermelha) em pupas. (à direita) Fenótipo mutante homozigo agcd "olho vermelho" em adultos. Adaptado de Carballar-Lejarazú et al. (2020) e usado com permissão5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Com o aumento da disponibilidade de tecnologias precisas e flexíveis de engenharia genética, como o CRISPR/Cas9, organismos transgênicos podem ser desenvolvidos de forma mais simples e estável do que antes possível. Essas ferramentas permitiram aos pesquisadores criar cepas transgênicas de vetores de mosquitos que estão muito perto de alcançar as propriedades desejadas de refratria a patógenos (modificação populacional) ou esterilidade heredital (supressão populacional). No entanto, para desenvolver os mosquitos geneticamente modificados mais seguros e estáveis possíveis, linhas transgênicas adicionais precisam ser criadas e avaliadas para que as linhas ideais sejam selecionadas para estudos de campo. O protocolo descrito pode aumentar a eficiência da geração de anofeeles gambiae transgênicos para que candidatos adicionais possam ser desenvolvidos para estratégias de modificação e supressão populacional.
O procedimento de microinjeção descrito utiliza equipamentos e materiais que provavelmente estão disponíveis em um laboratório que realiza rotineiramente microinjeções de mosquitos ou outros vetores de artrópodes. Manter a atenção aos detalhes durante todo o protocolo é importante. Correr por etapas como selecionar ovos por qualidade ou pular etapas como a segunda precipitação do DNA prejudicará os resultados e causará redução da incubação e redução da eficiência de transformação. Além disso, muitas dificuldades com o procedimento podem surgir se o cuidado não for tomado na criação de mosquitos. Mosquitos criados em condições de aglomeração ou com falta de nutrientes colocarão menos ovos de pior qualidade14, o que cria gargalos no fluxo de trabalho de microinjeção e aumentará o tempo necessário para alcançar um número desejado de embriões injetados.
Ao contrário dos métodos descritos para a microinjeção de Anopheles stephensi12, este método não requer submersão de óleo dos embriões e mais embriões podem ser injetados em um tempo menor sem as etapas adicionais exigidas pelo método à base de óleo. Uma limitação a este método em comparação com o método à base de óleo é uma visualização mais fraca durante todo o processo de microinjeção. Para garantir que o material de injeção ou citoplasma embrião não esteja fluindo de volta para a agulha, a atenção deve ser mantida para a pressão traseira da agulha em todos os momentos durante todo o processo de injeção.
O vetor africano de malária tem sido historicamente difícil de manipular geneticamente em comparação com outros Anopheles spp., mas é o maior contribuinte para os casos de malária em todo o mundo. Novas ferramentas são necessárias para auxiliar os esforços de eliminação da malária e mosquitos transgênicos projetados para modificar ou suprimir populações de mosquitos podem desempenhar um papel importante na obtenção da eliminação. Para selecionar os melhores candidatos transgênicos para estudos de eliminação da malária em campo, uma série de linhas devem ser avaliadas para que possam ser comparadas e selecionadas para a eficácia e segurança ideais15. Os blocos genéticos e moleculares necessários para criar linhas transgênicas com maior refratabilidade ou supressão são caracterizados e disponíveis. Este protocolo irá auxiliar no aumento da velocidade com que essas linhas refratárias ou supressivas podem ser criadas para que os esforços de validação possam começar a selecionar um candidato para testes de campo em um futuro próximo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Somos gratos a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell e Madeline Nottoli pela criação de mosquitos. O financiamento foi fornecido pela Iniciativa irvine malária da Universidade da Califórnia. AAJ é um professor donald bren na Universidade da Califórnia, Irvine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
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