Summary
Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.
Abstract
Las técnicas de microinyección embrionaria son esenciales para muchos estudios moleculares y genéticos de especies de insectos. Proporcionan un medio para introducir fragmentos de ADN exógenos que codifican genes de interés, así como rasgos favorables en la línea germinal de insectos de una manera estable y heredable. Las cepas transgénicas resultantes pueden estudiarse para detectar cambios fenotípicos resultantes de la expresión del ADN integrado para responder a preguntas básicas o utilizarse en aplicaciones prácticas. Aunque la tecnología es sencilla, requiere del investigador paciencia y práctica para lograr un nivel de habilidad que maximice la eficiencia. Aquí se muestra un método para la microinyección de embriones del mosquito africano de la malaria, Anopheles gambiae. El objetivo es entregar por microinyección ADN exógeno al embrión para que pueda ser absorbido en las células germinales (polos) en desarrollo. La expresión del ADN inyectado de transposasas, integrasas, recombinasas u otras nucleasas (por ejemplo, proteínas asociadas a CRISPR, Cas) puede desencadenar eventos que conducen a su inserción covalente en los cromosomas. An. gambiae transgénico generado a partir de estas tecnologías se han utilizado para estudios básicos de componentes del sistema inmunológico, genes involucrados en la alimentación sanguínea y elementos del sistema olfativo. Además, estas técnicas se han utilizado para producir cepas de An. gambiae con rasgos que pueden ayudar a controlar la transmisión de parásitos de la malaria.
Introduction
Las técnicas de microinyección se han utilizado para manipular experimentalmente organismos desde principios de 19001. La microinyección se ha utilizado para estudiar tanto las funciones biológicas básicas como para introducir cambios importantes en la biología de un organismo deseado. La técnica de microinyección ha sido de particular interés para los biólogos vectoriales y ha sido ampliamente utilizada para manipular genomas vectoriales2-11. Los experimentos de transgénesis en vectores de artrópodos a menudo tienen como objetivo hacer que los vectores sean menos eficientes en la transmisión de patógenos al promulgar cambios que disminuyen la aptitud de un vector o aumentan la refractariedad a los patógenos que transmiten. Los mosquitos transmiten una variedad de patógenos humanos y tienen un impacto significativo en la morbilidad y la mortalidad en todo el mundo. El género de mosquitos Anopheles transmite los patógenos parásitos de la malaria humana, Plasmodium spp. Los experimentos de ingeniería genética con Anopheles han tenido como objetivo comprender mejor la biología y reducir la capacidad vectorial de estos mosquitos en los esfuerzos por desarrollar nuevas estrategias de eliminación de la malaria.
Los mosquitos vectores que contribuyen con la mayor cantidad de infecciones de malaria en todo el mundo se encuentran en el complejo de especies anopheles gambiae. Sin embargo, la mayoría de los experimentos exitosos de transgénesis se han realizado en el vector de la malaria del subcontinente indio, Anopheles stephensi. Si bien existen muchas cepas de Anopheles gambiae adaptadas al laboratorio, el número de líneas transgénicas de Anopheles gambiae spp. reportadas en la literatura no se compara con el de Anopheles stephensi. Se cree que el embrión de Anopheles gambiae es más difícil de inyectar y lograr una transgénesis exitosa que Anopheles stephensi,aunque se desconocen las razones de estas diferencias. Este protocolo describe un método que ha demostrado ser consistentemente exitoso en el logro de la transgénesis de embriones de Anopheles gambiae a través de la microinyección. El protocolo se basa en un método previamente desarrollado por Hervé Bossin y Mark Benedict12 con algunos detalles adicionales y alteraciones añadidas que se han encontrado para aumentar la eficiencia de la transgénesis.
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Protocol
1. Preparación de mosquitos para la microinyección
- Separe una jaula13 (~ 5000 cm3) con ~ 100 machos y 200-300 hembras 1-2 días adultos post-eclosión mosquitos y déjelos aparearse durante 2 días.
- Después del período de apareamiento, proporcione a los mosquitos una comida de sangre utilizando 2 ml de sangre con un dispositivo de alimentación artificial o animales vivos anestesiados dependiendo de las prácticas insectarias14. Al día siguiente, proporcione a los mosquitos una segunda comida de sangre para garantizar que todas las hembras apareadas hayan tenido la oportunidad de alimentarse y que los mosquitos parcialmente alimentados se hayan hinchado por completo.
- Utilice los mosquitos para la recolección de embriones 2-4 días después de la segunda comida de sangre.
NOTA: La nutrición larvaria es importante para la robustez adulta y la aptitud reproductiva. Ver Benedict et al. (2020) para obtener información sobre cómo criar insectos sanos14. No se han observado diferencias significativas en la puesta de huevos cuando los mosquitos se alimentan de un comedero artificial o animales vivos anestesiados. Use cualquier método que se use rutinariamente para Anopheles gambiae en el insectario.
2. Preparación embrionaria
- Use un aspirador para colocar 20-30 hembras en un tubo cónico transparente de 50 ml que ha sido cortado (con una sierra de cinta) para que esté abierto en ambos extremos y está cubierto con película dental de látex en un extremo y malla de nylon y papel de filtro en el otro (Figura 1).
NOTA: Los mosquitos depositarán sus huevos en el papel de filtro y la malla de nylon mantendrá el papel de filtro firmemente en su lugar. Los huevos de mosquito son de forma cilíndrica, ~ 500 μm de longitud, ~ 200 μm de diámetro en su punto más ancho y disminuyen en los extremos anterior y posterior(Figura 2). - Coloque el tubo lleno de mosquitos en una pequeña placa de Petri (60 mm x 15 mm) llena de agua de doble destilación (ddH2O). Coloque el tubo y el plato en una incubadora a 28 °C durante 45 min (Figura 3).
- Retire el tubo de la incubadora e inserte el tubo en una jaula vacía. Golpee suavemente el tubo para permitir que los mosquitos salgan volando y retire el tubo de la jaula una vez que todos los mosquitos hayan volado.
- Cuando el tubo esté libre de mosquitos, desenrosque el anillo inferior, retire el nylon y use fórceps para quitar cuidadosamente el papel de filtro con los huevos del tubo. Coloque el papel de filtro en una placa de Petri de plástico (100 mm x 15 mm) que contenga una capa de papel de filtro humedecido con ddH2O.
- Observa los huevos. Los huevos que han envejecido hasta el punto en que son de color gris claro(Figura 4)están listos para la alineación.
- Si los huevos todavía son blancos, devuélvalos a la incubadora y verifique el color cada 5 minutos. Los huevos blancos son frágiles, se rompen fácilmente y no sobreviven bien después del proceso de inyección, lo que resulta en una eclosión baja.
- Los huevos que son de color gris oscuro o negro han envejecido demasiado. No los use.
3. Alineación embrionaria
- Corte un trozo de membrana secante de nylon (2 cm x 1 cm) con una cuchilla de afeitar, asegurándose de que el borde esté bien recortado.
NOTA: Si el borde no es recto, los huevos no permanecerán fijados a la membrana correctamente durante el proceso de inyección. - Coloque una membrana en un portaobjetos de vidrio y cubra la membrana con un trozo de papel de filtro (2 cm x 2 cm), dejando al descubierto ~ 1 mm del filtro de membrana (Figura 5).
NOTA: Asegúrese de que los portaobjetos del microscopio estén limpios antes de usarlos y use fórceps limpios para manipular el filtro de membrana. - Humedezca el papel de filtro con H2O desionizado, ya que los huevos morirán si se desecan durante períodos prolongados de tiempo.
NOTA: No ponga demasiada agua en el papel porque los embriones se moverán durante el proceso de inyección, pero asegúrese de que haya suficiente para evitar que el embrión se seque(Figura 6A,B). El exceso de agua se puede eliminar absorbiéndola con un trozo de papel defiltro. - Transfiera suavemente 30-50 embriones al borde de la membrana con un pincel (tamaño # 0). Use el cepillo para alinear los huevos verticalmente a lo largo de la membrana enrollándolos suavemente sobre la diapositiva para que el lado ventral (convexo) esté orientado hacia arriba.
- Oriente todos los huevos en la misma dirección para que cuando los óvulos se observen bajo el microscopio de microinyección, el extremo posterior (más puntiagudo, Figura 6A,B)esté en una posición hacia abajo y forme un ángulo de ~15° con la aguja(Figura 6C). Cubra todo el borde de la membrana con huevos (30-50) y coloque el portaobjetos debajo del microscopio para inyección.
NOTA: Elija los huevos cuidadosamente. Deseche los que son blancos (demasiado jóvenes o sin desarrollar) o gris oscuro (demasiado viejos y romperán la aguja), y los anormales(Figura 7). Asegúrese de que el papel de filtro permanezca húmedo en todomomento.
4. Preparación del ADN
- Purifique los ADN de plásmidos para inyección, como mínimo, con un kit maxiprep de plásmido de ADN libre de endotoxinas siguiendo los protocolos del fabricante.
- Resuspender el ADN en agua de grado PCR y centrifugar a 17.100 x g en una centrífuga refrigerada durante 30 min a 4 °C. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo cónico nuevo y limpio de 1,5 ml. Micropipeta cuidadosamente para evitar la transferencia de partículas no deseadas de la columna.
- Realice una segunda precipitación de ADN utilizando una décima parte del volumen de acetato de sodio 3M y un volumen doble de etanol al 100%.
- Resuspend el ADN en 300-500 μL de agua de grado PCR para una concentración final de plásmido de 1000 ng/μL. Mezcle el cóctel de plásmidos en el tampón de inyección para obtener una concentración final de plásmido de 300-400 ng/μL y haga alícuotas de 10-20 μL.
NOTA: El ADN se puede almacenar a -20 °C. Las alícuotas de microinyección de ADN se pueden almacenar a -20 °C, o a -80 °C si se utilizan componentes de ARN. No exceda los 800 ng/μL de ADN en la mezcla de inyección porque la viscosidad hará que las agujas se obstruyan.
5. Preparación de la aguja
- Haga las agujas tirando de capilares de cuarzo de 10 cm utilizando un extractor de micropipeta programable.
- Examine la aguja bajo el microscopio para asegurarse de que la punta esté bien formada. Asegúrese de que el ajuste de la aguja en el extractor programable produzca una punta que comience a disminuir ~ 0.5 mm desde el extremo terminal y termine en un punto fino (consulte la Figura 6). Las agujas que se rompen fácilmente generalmente tienen una contracción demasiado larga.
NOTA: Las condiciones pueden diferir según el extractor de agujas (los autores pondrán a disposición, previa solicitud, la configuración del extractor programable que utilicen. Las restricciones de la revista nos impiden citar una marca específica). Las agujas se pueden tirar a mano, pero esto requiere un conjunto de habilidades que no están disponibles en la mayoría de los laboratorios.
6. Microinyección embrionaria
- Use una punta de microcargador para llenar las agujas con 2 μL de mezcla de ADN. Inserte la aguja en el soporte de la aguja y conecte el tubo de la bomba de presión automatizada (Figura 8).
- Importante: Alinee la aguja de manera que forme un ángulo de 15° con el plano de la diapositiva (Figura 8).
- Abra la punta de la aguja tocando cuidadosamente el primer óvulo e inyéctelo insertando la punta de la aguja ≤ 10 μm en el polo posterior. Una inyección exitosa conducirá a un pequeño movimiento del citoplasma dentro del óvulo.
- Use los controles de la etapa coaxial del microscopio para pasar al siguiente óvulo para continuar la inyección.
- Para asegurarse de que la punta de la aguja permanezca abierta y no se haya obstruido, presione el botón Inyectar antes de ingresar a otro embrión y visualice la pequeña gota en la abertura de la aguja.
- Si la aguja se obstruye, presione el botón Borrar para limpiar la aguja y repita la prueba de visualización de gotas. Ajuste la presión según sea necesario si la abertura de la punta de la aguja se hace un poco más grande para asegurarse de que el tamaño de la gota permanezca pequeño.
- Inyecte ~ 40-50 huevos con una aguja.
NOTA: Asegúrese de que el papel de filtro permanezca húmedo en todo momento. Mantenga suficiente contrapresión en la aguja para mantenerla despejada. Una aguja que no se puede destapar debe reemplazarse con una aguja nueva. La colocación del embrión, la inserción con aguja y la inyección se facilitan con microscopios que tienen controles coaxiales para el movimiento horizontal de la etapa (Figura 9).
- Después de que se completen las inyecciones, enjuague los huevos en un recipiente de vidrio forrado con papel de filtro y lleno con 50 ml de H2O desionizado(Figura 10).
NOTA: Los embriones comenzarán a eclosionar 2 días después de la inyección y pueden tardar hasta 3-5 días. Las larvas eclosionadas deben transferirse inmediatamente (verifique 2 veces al día) a un recipiente limpio con agua y alimentos.
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Representative Results
Un ejemplo representativo de la aplicación del protocolo de microinyección descrito se puede encontrar en Carballar-Lejarazú et al5. La intención aquí era insertar un sistema autónomo de impulsores genéticos en la línea germinal de una cepa de laboratorio, G3, de An. gambiae. El sistema fue diseñado para dirigirse al locus ortólogo cardinal (Agcd)en el tercer cromosoma de esta especie, que codifica una hemo peroxidasa que cataliza la conversión de 3-hidroxiquinurenina en xanthommatina, el último paso en la biosíntesis del ommocromo(Figura 11). Los mosquitos homocigotos que contienen impulsores genéticos son mutantes cardinales de pérdida de función con larvas, pupas y adultos recién surgidos que tienen un fenotipo de ojos rojos. Un plásmido, pCO37, que contiene el sistema de accionamiento expresa endonucleasa Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) bajo el control de los elementos reguladores del ortólogo del gen An. gambiae nanos, un ARN guía de 23 nucleótidos (ARNg) bajo el control de un promotor del gen An. gambiae U6 y un casete de marcador dominante 3XP3-CFP que expresa la proteína fluorescente cian para identificar la progenie transgénica. Agcd Los fragmentos de ADN homólogos a las regiones genómicas que flanquean el sitio de corte objetivo de ARNg hacen posible la integración mediada por reparación dirigida por homología (HDR).
Setecientos ochenta embriones de An. gambiae de tipo salvaje fueron inyectados con el plásmido pCO37 junto con la proteína SpCas9. Ciento cuarenta y seis embriones inyectados (18,7%; G0) sobrevivió a la etapa adulta y fueron cruzados posteriormente a miembros de tipo salvaje del sexo opuesto. El cribado con microscopio fluorescente de la progenie de la siguiente generación (G1)identificó tres de los 3.428 (0,09%) que fueron positivos para el gen marcador de LA PPC, solo dos de los cuales, un hombre y una mujer, sobrevivieron. Los enfoques moleculares (amplificación de genes, secuenciación de ADN) verificaron la inserción precisa de ~ 10 kb de ADN y la cepa resultante se denominó AgNosCd-1. Extensos análisis de seguimiento mostraron que AgNosCd-1 era altamente eficiente en el accionamiento, creaba pocos alelos resistentes y no tenía una carga genética importante (costos de aptitud) como resultado de la integración y expresión del sistema de impulsorgenético 5. El plásmido pCO37 sirve como columna vertebral para el desarrollo de cepas de modificación de la población de An. gambiae para prevenir la transmisión del parásito de la malaria.
Figura 1: Dispositivode recolección de huevos. El dispositivo de recolección de huevos está compuesto por papel de filtro, malla de nylon, película dental y un tubo cónico de 50 ml reacondicionado. El dispositivo permite que los mosquitos sean depositados por el aspirador de forma segura en el recipiente a través de la hendidura en la película dental. El papel de filtro y la malla de nylon permiten absorber el agua, lo que proporciona una superficie húmeda, pero no inundada, para la oviposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Anopheles gambiae embriones. A)Un lote de embriones en diferentes etapas de maduración. B)Las flechas indican el polo posterior, la ubicación dentro del embrión que contiene las células de la línea germinal, que son los objetivos previstos para la transformación. La barra de escala representa ~ 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Recolección de huevos. Una vez que los mosquitos se colocan dentro del dispositivo de recolección de huevos, se mueve a una placa de Petri que contiene una capa de papel de filtro humedecido con ddH2O. Ajuste el volumen de agua para que el nivel de agua se eleve a ~ 1/4 de la altura de la tapa. El dispositivo de recolección de huevos y la placa de Petri se colocan en una incubadora oscura y los mosquitos se dejan oviposit durante un total de 45 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Desarrollo embrionario. Los embriones solo son adecuados para inyección durante un corto período de tiempo. Los huevos que se inyectan prematuramente en el desarrollo son demasiado delicados y sufrirán daños y no eclosionarán. Los óvulos que se inyectan más tarde en su desarrollo se endurecen y pueden romper la aguja causando que se inyecte demasiado material genético en el óvulo. Además, es menos probable que las inyecciones más avanzadas en el desarrollo causen cambios permanentes en la línea germinal a medida que las células polares se someten rápidamente a una mayor replicación y diferenciación. Las imágenes se tomaron cada 10 minutos después del tiempo de oviposición de 45 minutos. Los asteriscos (*) indican los huevos que son adecuados para la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Montaje de diapositivas de membrana. Los huevos están alineados a lo largo de la membrana de nylon, que proporciona una estructura de soporte para que los huevos no se muevan durante el proceso de inyección. El papel de filtro sirve como depósito de agua para garantizar que los huevos permanezcan húmedos durante toda la inyección. Coloque el papel de filtro y la membrana de nylon cerca del borde del portaobjetos de vidrio dejando espacio tanto para los huevos como para el agua que los sumerge. Si la membrana y el papel de filtro están demasiado lejos del borde del portaobjetos, será difícil lograr el ángulo correcto entre los embriones y la aguja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Orientación embrionaria para microinyección. A)Los embriones están alineados con los polos posteriores más bajos que el anterior, corriendo por la membrana. B)Los embriones se sumergen en agua; ajustar el ancho de la línea de agua por encima del óvulo para que sea aproximadamente de un octavo a un cuarto del ancho de un embrión promedio. C)Imagen de primer plano del ángulo de la aguja con embriones. La barra de escala representa ~ 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Embriones anormales. Los embriones que parecen anormales en coloración o textura no eclosionarán; no se los inyecte. Los embriones que son de color amarillo no se melanizarán adecuadamente. También se ha observado una eclosión reducida en embriones lisos que no tienen cáscaras de huevo de apariencia normal (cutículas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Posición de la aguja durante las microinyecciones. A) Vista gran angular de la etapa de inyección. B,C)Coloque la aguja de modo que los embriones alineados formen un ángulo de 15° con la aguja de inyección. No eleve el brazo del instrumento de microinyección que sostiene la aguja significativamente más alto que la etapa del microscopio para garantizar una pesca adecuada entre la aguja y el portaobjetos que contiene los embriones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Controles coaxiales y soporte de aguja. A)Los controles coaxiales (flecha) permiten el movimiento tridimensional de la aguja para garantizar la colocación precisa de la aguja para cada inyección. Es importante utilizar controles coaxiales para elevar la aguja verticalmente al cambiar de portaobjetos para que la aguja no choque con la nueva corredera al colocarla en su lugar en el escenario. Los controles coaxiales laterales permiten una penetración precisa de la aguja en el polo posterior. B)Imagen del soporte de la aguja que muestra el ángulo para la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Cámara para incubación de huevos. A, B) Lave cuidadosamente los embriones inyectados en un recipiente cilíndrico lleno a un cuarto de profundidad con agua de doble destilación y forrado con papel de filtro. C,D) El movimiento del recipiente hace que los huevos se adhieran naturalmente al papel de filtro. Antes de dejar el recipiente para incubar, asegúrese de que los huevos que se hayan adherido más arriba en el papel de filtro se laven suavemente hasta el nivel del agua. El óvalo azul marca un número de huevos depositados para mostrar el tamaño relativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11. Anopheles gambiae cardinal (Agcd) gen ortholog, pCO37 gene drive construct y fenotipos resultantes. Arriba) Gen Agcd: bloques granates, exones (E1-4); bloques vacíos, regiones no traducidas (UTR) de 3' y 5'; línea negra gruesa, intrones y ADN intergénico. Medio) plásmido pCO37: brazos de homología del gen Agcd: bloques granates, bloques azules, componentes genéticos marcadores dominantes (3XP3 y CFP); bloques de bronceado, componentes de accionamiento (promotorde nanos y secuencias de codificación de proteínas SpCas9); bloques verdes, componentes de ARN guía (promotor U6 y secuencia de ARNg). Los genes y las características de pCO37 no están a escala. La recombinación (flechas granates) resultante de la reparación dirigida por homología (HDR) iniciada en el sitio de corte mediado por SpCaS9 / gRNA (punta de flecha verde) da como resultado la integración de la construcción del impulsor genético. Abajo) fenotipos visibles resultantes de integración de impulsores genéticos: (izquierda) CFP+ (flecha blanca / azul) y fenotipos homocigotos Agcd-mutante (flecha roja) en larvas y Agcd-mutante (flecha roja) fenotipos en pupas. (derecha) Fenotipo mutante homocigoto Agcd "ojo rojo" en adultos. Adaptado de Carballar-Lejarazú et al. (2020) y utilizado con permiso5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Con la mayor disponibilidad de tecnologías de ingeniería genética precisas y flexibles como CRISPR/Cas9, los organismos transgénicos pueden desarrollarse de una manera más directa y estable de lo que era posible anteriormente. Estas herramientas han permitido a los investigadores crear cepas transgénicas de mosquitos vectores que están muy cerca de lograr las propiedades deseadas de refractariedad a patógenos (modificación de la población) o esterilidad hereditaria (supresión de la población). Sin embargo, para desarrollar los mosquitos modificados genéticamente más seguros y estables posibles, se deben crear y evaluar líneas transgénicas adicionales para que se seleccionen las líneas óptimas para los estudios de campo. El protocolo descrito puede aumentar la eficiencia de la generación de transgénicos Anopheles gambiae para que se puedan desarrollar candidatos adicionales para estrategias de modificación y supresión de la población.
El procedimiento de microinyección descrito utiliza equipos y materiales que probablemente estén disponibles en un laboratorio que realiza rutinariamente microinyecciones de mosquitos u otros vectores artrópodos. Mantener la atención al detalle durante todo el protocolo es importante. Apresurarse a través de pasos como seleccionar huevos por calidad o saltarse pasos como la segunda precipitación de ADN perjudicará los resultados y causará una eclosión reducida y una eficiencia de transformación reducida. Además, pueden surgir muchas dificultades con el procedimiento si no se tiene cuidado en la cría de mosquitos. Los mosquitos que se crían en condiciones de hacinamiento o con falta de nutrientes pondrán menos huevos de peor calidad14, lo que crea cuellos de botella en el flujo de trabajo de microinyección y aumentará el tiempo necesario para alcanzar el número deseado de embriones inyectados.
A diferencia de los métodos descritos para la microinyección de Anopheles stephensi12,este método no requiere la inmersión en aceite de los embriones y se pueden inyectar más embriones en un tiempo más corto sin los pasos adicionales requeridos por el método a base de aceite. Una limitación de este método en comparación con el método basado en aceite es una visualización más pobre a lo largo del proceso de microinyección. Para asegurarse de que el material de inyección o el citoplasma embrionario no vuelva a fluir hacia la aguja, se debe prestar atención a la contrapresión de la aguja en todo momento durante todo el proceso de inyección.
El vector africano de la malaria ha sido históricamente difícil de manipular genéticamente en comparación con otros Anopheles spp., sin embargo, es el mayor contribuyente a los casos de malaria en todo el mundo. Se necesitan nuevas herramientas para ayudar a los esfuerzos de eliminación de la malaria y los mosquitos transgénicos diseñados para modificar o suprimir las poblaciones de mosquitos pueden desempeñar un papel importante en el logro de la eliminación. Para seleccionar los mejores candidatos transgénicos para los estudios de eliminación de la malaria en el campo, se deben evaluar varias líneas para que puedan compararse y seleccionarse para una eficacia y seguridad óptimas15. Los bloques de construcción genéticos y moleculares necesarios para crear líneas transgénicas con refractariedad o supresión mejorada están caracterizados y disponibles. Este protocolo ayudará a aumentar la velocidad a la que se pueden crear estas líneas refractarias o supresoras para que los esfuerzos de validación puedan comenzar a seleccionar un candidato para ensayos de campo en un futuro próximo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos agradecidos a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell y Madeline Nottoli por la cría de mosquitos. La financiación fue proporcionada por la Iniciativa de Malaria de la Universidad de California, Irvine. AAJ es profesor Donald Bren en la Universidad de California, Irvine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
