Summary
Mikroinjektionstekniker är viktiga för att introducera exogena gener i myggens genom. Detta protokoll förklarar en metod som används av James-laboratoriet för att mikroinjektionera DNA-konstruktioner till Anopheles gambiae-embryon för att generera förvandlade myggor.
Abstract
Embryomikroinjektionstekniker är viktiga för många molekylära och genetiska studier av insektsarter. De ger ett sätt att införa exogena DNA-fragment som kodar gener av intresse samt gynnsamma egenskaper i insektsgroddlinjen på ett stabilt och ärftligt sätt. De resulterande transgena stammarna kan studeras för fenotypiska förändringar till följd av uttrycket av det integrerade DNA för att svara på grundläggande frågor eller användas i praktiska tillämpningar. Även om tekniken är enkel kräver det av utredaren tålamod och övning för att uppnå en färdighetsnivå som maximerar effektiviteten. Visas här är en metod för mikroinjektion av embryon av den afrikanska malariamyggan, Anopheles gambiae. Målet är att med mikroinjektion leverera exogent DNA till embryot så att det kan tas upp i de framväxande könscellerna (polerna). Uttryck från injicerat DNA från transposaser, integraser, rekombinaser eller andra nukleaser (till exempel CRISPR-associerade proteiner, Cas) kan utlösa händelser som leder till dess kovalenta införande i kromosomer. Transgen an. gambiae som genereras från dessa tekniker har använts för grundläggande studier av immunsystemets komponenter, gener som är involverade i blodmatning och delar av luktsystemet. Dessutom har dessa tekniker använts för att producera An. gambiae stammar med egenskaper som kan hjälpa till att kontrollera överföringen av malaria parasiter.
Introduction
Mikroinjektionstekniker har använts för att experimentellt manipulera organismer sedan början av 1900-talet1. Mikroinjektion har använts för att studera både grundläggande biologiska funktioner och/eller införa viktiga förändringar i en önskad organisms biologi. Mikroinjektionstekniken har varit av särskilt intresse för vektorbiologer och har använts i stor utsträckning för att manipulera vektorgenom2-11. Transgenes experiment i arthropod vektorer syftar ofta till att göra vektorer mindre effektiva vid överföring av patogener genom att antingen anta förändringar som minskar en vektors kondition eller öka refraktoritet till de patogener de överför. Myggor överför en mängd olika mänskliga patogener och har en betydande inverkan på sjuklighet och dödlighet över hela världen. Anopheles-släktet av myggor överför de mänskliga malariaparasitära patogenerna, Plasmodium spp. Genteknikexperiment med Anopheles har syftat till att bättre förstå biologin och minska dessa myggors vektorkapacitet i försök att utveckla nya malariaelimineringsstrategier.
De myggvektorer som bidrar med flest malariainfektioner i världen finns i Anopheles gambiae artkomplex. Majoriteten av framgångsrika transgenesexperiment har dock utförts på malariavektorn hos den indiska subkontinenten, Anopheles stephensi. Medan det finns gott om laboratorieanpassade Anopheles gambiae-stammar, är antalet transgena Anopheles gambiae spp. linjer som rapporteras i litteraturen inte jämföras med Anopheles stephensi. Man tror att Anopheles gambiae embryo är svårare att injicera och uppnå framgångsrik transgenes än Anopheles stephensi, även om orsakerna till dessa skillnader är okända. Detta protokoll beskriver en metod som har visat sig vara konsekvent framgångsrik för att uppnå transgenes av Anopheles gambiae embryon via microinjection. Protokollet bygger på en metod som tidigare utvecklats av Hervé Bossin och Mark Benedict12 med några ytterligare detaljer och ändringar som har visat sig öka effektiviteten av transgenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda myggor för mikroinjektion
- Frö en bur13 (~ 5000 cm3) med ~ 100 manliga och 200-300 kvinnliga 1-2 dagar vuxna efterseklosionsmyggor och låt dem kompisera i 2 dagar.
- Efter parningsperioden, ge myggor en blodmåltid med antingen 2 ml blod med en konstgjord utfodringsanordning eller levande bedövade djur beroende på insektspraxis14. Följande dag ger myggor en andra blodmåltid för att säkerställa att alla parade kvinnor har haft möjlighet att mata och att delvis matade myggor har blivit helt engorged.
- Använd myggorna för embryosamlingar 2-4 dagar efter den andra blodmåltiden.
OBS: Larvnäring är viktigt för vuxnas robusthet och reproduktiv kondition. Se Benedict et al. (2020) för information om hur man föder upp friska insekter14. Inga signifikanta skillnader i äggläggning har observerats när myggor matas på en konstgjord matare eller levande bedövade djur. Använd den metod som rutinmässigt används för Anopheles gambiae i insektsskådan.
2. Embryoberedning
- Använd en aspirator för att placera 20-30 honor i ett genomskinligt koniskt rör på 50 ml som har skurits (med en bandsåg) för att vara öppen i båda ändar och är täckt med latextandfilm i ena änden och nylonnät och filterpapper i den andra (figur 1).
OBS: Myggorna kommer att deponera sina ägg på filterpapperet och nylonnätet kommer att hålla filterpapperet säkert på plats. Myggägg är cylindriska i form, ~500 μm långa, ~200 μm i diameter vid sin bredaste punkt och avsmalnande i de främre och bakre ändarna(figur 2). - Placera det myggfyllda röret i en liten (60 mm x 15 mm) Petriskål fylld med dubbeldestillerat vatten (ddH2O). Placera röret och skålen i en inkubator vid 28 °C i 45 min (figur 3).
- Ta bort röret från inkubatorn och sätt in röret i ett tomt bur. Knacka försiktigt på röret så att myggor kan flyga ut och ta bort röret från buret när alla myggor har flugit ut.
- När röret är fritt från myggor, skruva loss bottenringen, ta bort nylon och använd tång för att försiktigt ta bort filterpapperet med äggen från röret. Placera filterpapperet i en petriskål i plast (100 mm x 15 mm) som innehåller ett lager filterpapper fuktat med ddH2O.
- Observera äggen. Ägg som har åldrats till den punkt där de är ljusgrå i färg (figur 4) är redo för justering.
- Om ägg fortfarande är vita, returnera dem till inkubatorn och kontrollera färgen var 5: e minut. Vita ägg är ömtåliga, brister lätt och överlever inte bra efter injektionsprocessen vilket resulterar i låg kläckning.
- Ägg som är mörkgrå eller svarta har åldrats för mycket. Använd dem inte.
3. Embryojustering
- Skär en bit nylon blottingmembran (2 cm x 1 cm) med ett rakblad och se till att kanten är snyggt trimmad.
OBS: Om kanten inte är rak kommer äggen inte att fästas på membranet ordentligt under injektionsprocessen. - Sätt ett membran på en glasrutschbana och täck membranet med ett filterpapper (2 cm x 2 cm), vilket lämnar ~ 1 mm av membranfiltret oskyddat (figur 5).
OBS: Se till att mikroskopbilderna är rena före användning och använd rena tångar för att manipulera membranfiltret. - Blöt filterpapperet med avjoniserat H2O eftersom ägg kommer att dö om de torkas under längre tidsperioder.
OBS: Lägg inte för mycket vatten på papperet eftersom embryona kommer att röra sig under injektionsprocessen, men se till att det finns tillräckligt för att förhindra att embryot torkar (figur 6A, B). Överflödigt vatten kan avlägsnas genom att absorbera det med en bit filterpapper. - Överför försiktigt 30-50 embryon till kanten av membranet med en pensel (storlek #0). Använd borsten för att justera äggen vertikalt längs membranet genom att försiktigt rulla dem över på bilden så att den ventrala sidan (konvex) är vänd uppåt.
- Orientera alla ägg i samma riktning så att när äggen observeras under mikroinjektionsmikroskopet, är den bakre änden (mer spetsig, figur 6A, B) i ett nedåtläge och bildar en vinkel på ~ 15 ° med nålen ( figur6C). Fodra hela kanten av membranet med ägg (30-50) och placera bilden under mikroskopet för injektion.
OBS: Välj äggen noggrant. Kassera de som är vita (för unga eller outvecklade) eller mörkgrå (för gamla och kommer att bryta nålen) och de onormala (figur 7). Se till att filterpapperet alltid är fuktigt.
4. DNA-preparat
- Rena plasmid-DNAs för injektion, åtminstone, med en endotoxinfri DNA-plasmid maxiprep-sats enligt tillverkarens protokoll.
- Återanvänd DNA i PCR-klassat vatten och centrifug vid 17 100 x g i en kyld centrifug i 30 minuter vid 4 °C. Överför sedan supernatanten till ett nytt, rent koniskt rör på 1,5 ml. Mikropipett för att undvika överföring av oönskade partiklar från kolonnen.
- Utför en andra utfällning av DNA med en tiondel volym 3M natriumacetat och en tvåfaldig volym av 100% etanol.
- Återanvänd DNA i 300-500 μL PCR-klassat vatten för en slutlig plasmidkoncentration på 1000 ng/μL. Blanda plasmidcocktailen i injektionsbufferten för en slutlig plasmidkoncentration på 300-400 ng/μL och gör 10-20 μL alikvoter.
OBS: DNA kan lagras vid -20 °C. DNA-mikroinjektion alikvoter kan lagras vid -20 °C, eller vid -80 °C om du använder RNA-komponenter. Överskrid inte 800 ng/μL DNA i injektionsblandningen eftersom viskositeten gör att nålarna täpper till.
5. Nålpreparat
- Gör nålarna genom att dra 10 cm kvarts kapillärer med hjälp av en programmerbar mikropipettedragare.
- Undersök nålen under mikroskop för att säkerställa att spetsen bildas väl. Se till att nålinställningen på den programmerbara dragaren ger en spets som börjar avsmalna ~0,5 mm från den slutliga änden och slutar i en fin punkt (se figur 6). Nålar som lätt bryts har vanligtvis för lång avsmalning.
OBS: Förhållandena kan variera beroende på nåldragaren (Författarna kommer på begäran att göra inställningarna för den programmerbara dragare de använder tillgängliga. Journalbegränsningar hindrar oss från att citera ett specifikt varumärke). Nålar kan dras för hand, men detta kräver en färdighet som inte finns i de flesta laboratorier.
6. Embryomikroinjektion
- Använd en mikrolastarspets för att fylla nålarna med 2 μL DNA-blandning. Sätt in nålen i nålhållaren och anslut den automatiska tryckpumpsslangen(bild 8).
- Viktigt: Rikta in nålen så att den får en vinkel på 15° med bildens plan (figur 8).
- Öppna nålspetsen genom att försiktigt vidröra det första ägget och injicera det genom att sätta in nålens spets ≤ 10 μm i den bakre polen. En framgångsrik injektion kommer att leda till en liten rörelse av cytoplasma i ägget.
- Använd mikroskopkoaxialstegkontrollerna för att flytta till nästa ägg för att fortsätta injektionen.
- Tryck på knappen Injicera innan du går in i ett annat embryo för att säkerställa att nålspetsen förblir öppen och inte har täppt till den innan du går in i ett annat embryo och visualiserar den lilla droppen vid nålens öppning.
- Om nålen blir igensatt trycker du på knappen Rensa för att rensa nålen och upprepa droppvisualiseringstestet. Justera trycket efter behov om nålspetsöppningen blir något större för att säkerställa att droppens storlek förblir liten.
- Injicera ~40-50 ägg med en nål.
OBS: Se till att filterpapperet alltid är fuktigt. Håll tillräckligt med baktryck på nålen för att hålla den rensad. En nål som inte kan täppas till måste ersättas med en ny nål. Embryoplacering, nålinsättning och injektion underlättas med mikroskop som har koaxialkontroller för horisontell rörelse av scenen (figur 9).
- Skölj av äggen i en glasbehållare fodrad med filterpapper och fyll de med 50 ml avjoniserad H2O (figur 10).
OBS: Embryon börjar kläckas 2 dagar efter injektionen och kan ta så lång tid som 3-5 dagar. Kläckta först instar larver måste överföras omedelbart (kontrollera 2 gånger dagligen) till en ren behållare med vatten och mat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett representativt exempel på tillämpningen av det beskrivs mikroinjektionsprotokollet finns i Carballar-Lejarazú et al5. Avsikten här var att sätta in ett autonomt gendrivsystem i bakterien av en laboratoriestam, G3, av An. gambiae. Systemet utformades för att rikta in sig på kardinal ortosloglobus (Agcd) på den tredje kromosomen i denna art, som kodar en hemeperoxidas som katalyserar omvandlingen av 3-hydroxykynurenin till xanthommatin, det sista steget i ommochrom biosyntes (figur 11). Homozygous gen drive-innehållande myggor är förlust-av-funktion kardinal mutanter med larver, pupae och nyligen uppkomna vuxna med en röd-öga fenotyp. En plasmid, pCO37, som innehåller drivsystemet uttrycker Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) endonuclease under kontroll av de regulatoriska elementen i An. gambiae nanos gen ortoslog, en 23-nukleotid guide RNA (gRNA) under kontroll av en An. gambiae U6 genpromotor och en 3XP3-CFP dominerande markörkassett som uttrycker cyan fluorescerande protein. Agcd DNA-fragment homologa till genomiska regioner flankerande gRNA mål cut plats göra möjliga homology-riktade reparation- (HDR) medierad integration.
Sjuhundra åttio vilda-typ An. gambiae embryon injicerades med pCO37 plasmid tillsammans med SpCas9 protein. 146 injicerade embryon (18,7 %; G0) överlevde till vuxenstadiet och övervanns därefter till vilda medlemmar av motsatt kön. Fluorescerande mikroskop screening av nästa generation (G1) avkomma identifierade tre av 3,428 (0,09%) som var positiva för den gemensamma fiskeripolitiken markör genen, endast två av dem, en manlig och en kvinna, överlevde. Molekylära metoder (genförstärkning, DNA-sekvensering) verifierade den exakta införandet av ~ 10 kb DNA och den resulterande stammen betecknades AgNosCd-1. Omfattande uppföljande analyser visade att AgNosCd-1 var mycket effektiv vid körning, skapade få resistenta alleler och inte hade någon större genetisk belastning (fitnesskostnader) till följd av integrationen och uttrycket av gendrivsystemet5. PCO37 plasmid fungerar som ryggrad för att utveckla population modifiering stammar av An. gambiae för att förhindra malaria parasit överföring.
Bild 1: Ägguppsamlingsenhet. Ägguppsamlingsanordningen består av filterpapper, nylonnät, tandfilm och ett eftermonterat koniskt rör på 50 ml. Enheten gör det möjligt att deponera myggor av aspirator säkert i behållaren via slitsen i tandfilm. Filterpapperet och nylonnätet gör att vatten kan absorberas, vilket ger en fuktig, men inte översvämmad yta, för oviposition. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Anopheles gambiae embryon. A) Ett parti embryon i olika mognadsstadier. B) Pilarna anger den bakre polen, den plats i embryot som innehåller könsceller, som är de avsedda målen för omvandling. Skalstrecket representerar ~1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Äggsamling. När myggorna har placerats inuti ägguppsamlingsanordningen flyttas den till en Petri-maträtt som innehåller ett lager filterpapper fuktat med ddH2O. Justera vattenvolymen så att vattennivån stiger till ~ 1/4 höjden på locket. Ägguppsamlingsanordningen och Petriskålen placeras sedan i en mörk inkubator och myggor får oviposit i totalt 45 minuter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Utveckling av embryon. Embryona är endast lämpliga för injektion under ett kort tidsfönster. Ägg som injiceras i förtid under utveckling är för känsliga och kommer att drabbas av skador och inte kläckas. Ägg som injiceras senare i sin utveckling blir härdade och kan bryta nålen vilket orsakar för mycket genetiskt material för att injiceras i ägget. Dessutom är injektioner senare i utvecklingen mindre benägna att orsaka permanenta förändringar i könscellen eftersom polceller snabbt genomgår ytterligare replikering och differentiering. Bilder togs var 10:e minut efter ovipositionstid på 45 min. Asterisker (*) anger ägg som är lämpliga för injektion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5:Membranrutschbana. Äggen är inriktade längs nylonmembranet, vilket ger en stödstruktur så att äggen inte rör sig under injektionsprocessen. Filterpapperet fungerar som en behållare för vatten för att säkerställa att äggen förblir fuktiga under hela injektionen. Placera filterpapperet och nylonmembranet nära glasrutschbanans kant så att det ger plats åt både ägg och vatten som dränker dem. Om membranet och filterpapperet är för långt från kanten av bilden blir det svårt att uppnå rätt vinkel mellan embryon och nål. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Embryoorientering för mikroinjektion. A) Embryona är i linje med de bakre polerna lägre än de främre, som löper ner i membranet. B) Embryona är nedsänkta i vatten. justera vattenlinjens bredd ovanför ägget till ungefär en åttonde till en fjärdedel bredden på ett genomsnittligt embryo. C) Närbild av nålvinkel med embryon. Skalstrecket representerar ~1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Onormala embryon. Embryon som verkar onormala i färg eller konsistens kommer inte att kläcka; injicera dem inte. Embryon som är gula i färg kommer inte att melanisera ordentligt. Minskad kläckning har också observerats i släta embryon som inte har normaluppträdande äggskal (nagelband). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 8: Nålposition under mikroinjektionerna. A) Vidvinkelvy av injektionssteget. B,C) Placera nålen så att de justerade embryona bildar en vinkel på 15° med injektionsnålen. Lyft inte armen på mikroinjektionsinstrumentet som håller nålen betydligt högre än mikroskopstadiet för att säkerställa korrekt mete mellan nålen och diabilden som innehåller embryona. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 9: Co-axial kontroller och nålhållare. A) De co-axiella kontrollerna (pilen) möjliggör 3-dimensionell rörelse av nålen för att säkerställa exakt placering av nålen för varje injektion. Det är viktigt att använda co-axial kontroller för att höja nålen vertikalt när du byter diabilder så att nålen inte kolliderar med den nya bilden när den sätts på plats på scenen. Laterala co-axiella kontroller möjliggör korrekt penetration av nålen i den bakre polen. B) Bild av nålhållaren som visar vinkel för injektion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 10: Kammare för äggkläckning. A,B) Tvätta försiktigt injicerade embryon i en cylindrisk behållare fylld till ett kvarts djup med dubbeldestillerat vatten och fodrat med filterpapper. C,D) Behållarens rörelse gör att äggen naturligt fastnar på filterpapperet. Innan du lämnar behållaren för kläckning, se till att eventuella ägg som har klibbat högre upp filterpapperet försiktigt tvättas tillbaka ner till vattennivån. Den blå ovalen markerar ett antal deponerade ägg för att visa relativ storlek. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 11. Anopheles gambiae kardinal (Agcd) gen ortos, pCO37 gendrift konstruktion och resulterande fenotyper. Topp) Agcd-gen: rödbruna block, exoner (E1-4); Tomma block, 3'- och 5-oöversatta regioner (UTR). tjock svart linje, introner och intergent DNA. Mitten) pCO37 plasmid: homologiarmar från Agcd-genen: rödbruna block, blå block, dominerande markörgenkomponenter (3XP3 och CFP); Solbränna block, drivkomponenter(nanos promotor och SpCas9 proteinkodningssekvenser); gröna block, styra RNA-komponenter (U6-promotor och gRNA-sekvens). Gener och egenskaper hos pCO37 ska inte skalas. Rekombination (rödbruna pilar) som härrör från homology riktad reparation (HDR) initierad vid SpCaS9/gRNA-medierad klippplats (grön pilspets) resulterar i integration av gendrivarkonstruktionen. Botten) resulterande synliga fenotyper av gendrift integration: (vänster) CFP+ (vit/blå pil) och homozygous Agcd-mutant(röd pil) fenotyper i larver och Agcd-mutant(röd pil) fenotyper i pupae. (höger) Homozygous Agcd mutant fenotyp "röda ögat" hos vuxna. Anpassad från Carballar-Lejarazú et al. (2020) och används med tillstånd5. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den ökade tillgången till exakt och flexibel genteknik som CRISPR/Cas9 kan transgena organismer utvecklas på ett enklare och stabilare sätt än tidigare möjligt. Dessa verktyg har gjort det möjligt för forskare att skapa transgena stammar av myggvektorer som är mycket nära att uppnå de önskade egenskaperna hos antingen eldfasthet mot patogener (populationsmodifiering) eller ärftlig sterilitet (populationsdämpning). Men för att utveckla de säkraste och stabilaste genetiskt modifierade myggorna som möjligt måste ytterligare transgena linjer skapas och utvärderas så att optimala linjer väljs ut för fältstudier. Det beskrivna protokollet kan öka effektiviteten i att generera Anopheles gambiae transgenics så att ytterligare kandidater kan utvecklas för befolkningsmodifiering och undertryckande strategier.
Mikroinjektionsproceduren som beskrivs använder utrustning och material som sannolikt finns tillgängliga i ett labb som rutinmässigt utför mikroinjektioner av myggor eller andra leddjursvektorer. Det är viktigt att hålla uppmärksamheten på detaljer i hela protokollet. Att rusa genom steg som att välja ägg efter kvalitet eller hoppa över steg som den andra DNA-nederbörden kommer att försämra resultaten och orsaka minskad kläckning och minskad omvandlingseffektivitet. Dessutom kan många svårigheter med förfarandet uppstå om man inte är försiktig i mygghållning. Myggor som föds upp i trånga förhållanden eller med brist på näringsämnen kommer att lägga mindre ägg av sämre kvalitet14, vilket skapar flaskhalsar i mikroinjektionsarbetsflödet och kommer att öka den tid som behövs för att nå önskat antal injicerade embryon.
Till skillnad från metoder som beskrivs för mikroinjektion av Anopheles stephensi12kräver denna metod inte oljesänkning av embryona och fler embryon kan injiceras på kortare tid utan de ytterligare steg som krävs enligt den oljebaserade metoden. En begränsning av denna metod jämfört med den oljebaserade metoden är sämre visualisering under hela mikroinjektionsprocessen. För att säkerställa att injektionsmaterialet eller embryocytoplasmen inte strömmar tillbaka in i nålen måste alltid nålens baktryck hållas vid nålens baktryck under hela injektionsprocessen.
Den afrikanska malariavektorn har historiskt varit svår att genetiskt manipulera jämfört med andra Anopheles spp., men det är den största bidragsgivaren till malariafall över hela världen. Nya verktyg behövs för att hjälpa malaria eliminering ansträngningar och transgena myggor utformade för att antingen modifiera eller undertrycka myggpopulationer kan spela en viktig roll för att uppnå eliminering. För att välja ut de bästa transgena kandidaterna för fältbaserade malariaelimineringsstudier bör ett antal rader utvärderas så att de kan jämföras och väljas ut för optimal effekt och säkerhet15. De genetiska och molekylära byggstenar som behövs för att skapa transgena linjer med förbättrad eldfasthet eller undertryckande kännetecknas och finns tillgängliga. Detta protokoll kommer att hjälpa till att öka hastigheten med vilken dessa eldfasta eller undertryckande linjer kan skapas så att valideringsinsatser kan börja välja en kandidat för fältförsök inom en snar framtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell och Madeline Nottoli för mygghållning. Finansieringen tillhandahölls av University of California, Irvine Malaria Initiative. AAJ är professor i Donald Bren vid University of California, Irvine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
