Behavior

Techniques de manipulation pour réduire le stress chez la souris

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62593

Michael Marcotte¹, Ashley Bernardo^1,2, Nathaniel Linga³, Carmina A. Pérez-Romero⁴, Jean-Louis Guillou⁵, Etienne Sibille^1,2,3, Thomas D. Prevot^1,2

¹Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, ²Department of Psychiatry, University of Toronto, ³Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, ⁴Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, ⁵Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

Summary

Cet article décrit une technique de manipulation chez la souris, la technique de manipulation 3D, qui facilite la manipulation de routine en réduisant les comportements anxieux et présente des détails sur deux techniques connexes existantes (manipulation en tunnel et en queue).

Abstract

Les animaux de laboratoire sont soumis à de multiples manipulations par des scientifiques ou des fournisseurs de soins aux animaux. Le stress que cela provoque peut avoir des effets profonds sur le bien-être des animaux et peut également être un facteur de confusion pour des variables expérimentales telles que les mesures de l’anxiété. Au fil des ans, des techniques de manipulation qui minimisent le stress lié à la manipulation ont été développées en mettant l’accent sur les rats et en prêtant peu d’attention aux souris. Cependant, il a été démontré que les souris peuvent être habituées à des manipulations à l’aide de techniques de manipulation. Habituer les souris à la manipulation réduit le stress, facilite la manipulation de routine, améliore le bien-être des animaux, diminue la variabilité des données et améliore la fiabilité expérimentale. Malgré les effets bénéfiques de la manipulation, l’approche tail-pick-up, particulièrement stressante, est encore largement utilisée. Cet article fournit une description détaillée et une démonstration d’une nouvelle technique de manipulation de la souris destinée à minimiser le stress subi par l’animal lors de l’interaction humaine. Cette technique manuelle est réalisée sur 3 jours (technique de manipulation 3D) et se concentre sur la capacité de l’animal à s’habituer à l’expérimentateur. Cette étude montre également l’effet des techniques de manutention des tunnels précédemment établies (à l’aide d’un tunnel en polycarbonate) et de la technique de ramassage de la queue. Leurs effets sur les comportements anxieux sont spécifiquement étudiés, en utilisant des tests comportementaux (Elevated-Plus Maze et Novelty Suppressed Feeding), l’interaction volontaire avec les expérimentateurs et la mesure physiologique (niveaux de corticostérone). La technique de manipulation 3D et la technique de manipulation en tunnel ont réduit les phénotypes anxieux. Dans la première expérience, utilisant des souris mâles âgées de 6 mois, la technique de manipulation 3D a considérablement amélioré l’interaction avec l’expérimentateur. Dans la deuxième expérience, en utilisant une femme de 2,5 mois, il a réduit les niveaux de corticostérone. En tant que tel, la manipulation 3D est une approche utile dans les scénarios où l’interaction avec l’expérimentateur est requise ou préférée, ou où la manipulation de tunnel peut ne pas être possible pendant l’expérience.

Introduction

Les souris et les rats sont des atouts essentiels aux études précliniques^1,² à des fins multiples, y compris les études endocriminales, physiologiques, pharmacologiques ou comportementales^2. Du nombre croissant d’études impliquant des animaux, il est apparu que des variables environnementales incontrôlées, y compris l’interaction humaine, influencent divers résultats dans la recherche biomédicale³^,⁴^,⁵. Ceci est responsable de la variabilité significative observée entre les expériences et les laboratoires de recherche⁴^,⁵, ce qui pose une mise en garde majeure dans la recherche animale.

Diverses approches ont été mises en œuvre dans le but de limiter l’impact des facteurs de stress environnementaux et de réduire la réactivité à l’interaction humaine. Par exemple, pour limiter l’impact des facteurs de stress environnementaux, la normalisation des conditions de logement et les systèmes de logement automatisés⁶^,⁷ ont été mis en œuvre dans tous les laboratoires. En ce qui concerne l’interaction avec les êtres humains, les approches couramment utilisées pour la manipulation et le transport des animaux ne tiennent guère compte de l’inconfort et du stress des animaux. Par exemple, ramasser les animaux par la queue ou utiliser des forceps⁸ augmente l’anxiété de base⁹^,¹⁰^,¹¹, réduit l’exploration⁹^,¹² et contribue grandement à la variabilité interindi individuelle au sein et entre les études¹³^,¹⁴. En conséquence, d’autres approches ont été développées, telles que la technique de manipulation des tasses, qui est applicable aux souris et aux rats. Dans cette approche, les animaux sont « sortis » de leur cage et tenus par les expérimentateurs avec leurs mains formant une tasse⁹^,¹⁰^,¹¹. Une autre alternative utile à la manipulation de la queue implique l’utilisation d’un tunnel en polycarbonate pour transférer les souris⁹^,¹⁰^,¹⁵. Cette approche élimine l’interaction directe entre la souris et l’expérimentateur. Les approches en coupe et en tunnel ont montré une efficacité dans la réduction des comportements anxieux et de la peur de l’expérimentateur qui peuvent être exagérées par des techniques de manipulation aversives, telles que la manipulation de la queue⁹^,¹⁰.

Par conséquent, de plus en plus de preuves démontrent l’utilité d’une manipulation appropriée des souris pour réduire la variabilité entre les individus⁹^,¹¹et améliorer le bien-être des animaux¹⁰. Cependant, les techniques mentionnées ci-dessus sont encore confrontées à des limites. La technique de manipulation des gobelets a été mise en œuvre avec des horaires allant de 10 jours (10 séances sur 2 semaines¹⁶⁾à 15 semaines^17,ce qui représente une quantité considérable de temps pour le personnel de l’installation et les expérimentateurs. De plus, l’efficacité de la manipulation de la tasse varie selon la souche⁹ et la manipulation conventionnelle de la tasse dans les mains ouvertes peut conduire à des souris naïves ou à des souches particulièrement sautillantes de la main⁹^,¹⁸. La manutention des tunnels se traduit par des résultats plus cohérents et généralement plus rapides dans l’effleage¹⁹. Les tunnels sont également utilisés comme enrichissement de la cage domestique. Ils aident les animaux à s’habituer à la manipulation rapide et offrent les avantages supplémentaires de l’enrichissement. La manipulation en tunnel, cependant, a des limites lors du transfert d’animaux entre appareils. Fait intéressant, Hurst et West⁹, et Henderson et al.²⁰ ont démontré que l’utilisation d’une manipulation manuelle douce et brève pour transférer les animaux du tunnel à l’appareil n’affecte pas leur phénotype.

Pour fournir une alternative aux méthodes existantes, avec une accoutumance réalisable dans un court laps de temps, cet article décrit une nouvelle technique qui développe la technique de manipulation de la tasse, ne nécessitant donc aucun équipement particulier. Cette approche utilise des jalons pour évaluer le niveau de confort des souris avec le processus de manipulation. Il montre son efficacité pour diminuer la réactivité et le stress des souris (aux niveaux comportemental et hormonal), facilite la manipulation de routine et contribue à réduire la variabilité entre les animaux. Les détails de cette technique sont fournis ici, et son efficacité pour réduire les comportements anxieux, améliorer l’interaction avec les expérimentateurs et limiter la libération d’hormones de stress périphériques (corticostérone) est démontrée dans deux études distinctes (souris mâles et femelles), en comparaison avec la manipulation en tunnel (contrôle positif) et les techniques de manipulation de la queue (contrôle négatif).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le comité des soins aux animaux de CAMH et menées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien sur les soins aux animaux.

REMARQUE: La méthode de manipulation décrite ici peut être utilisée dans diverses souches de souris, y compris les lignées non transgéniques (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, etc.) et transgéniques. Il peut également être utilisé avec des souris jeunes ou âgées, notant que les jeunes adultes (4-6 semaines) ont tendance à être légèrement plus actives que les souris adultes ou âgées, en particulier le jour 1.

1. Préparation expérimentale

Avant le lancement de l’étude, conformément aux lignes directrices²¹de l’ARRIVE, assignez au hasard des souris à chaque groupe de manutention (manutention 3D, manipulation en tunnel ou manipulation de la queue).
Identifiez la pièce pour effectuer la manipulation. Il peut être effectué dans la salle de logement ou dans une pièce séparée. Si la manipulation est effectuée dans une pièce séparée, ce qui nécessite que les animaux soient déplacés sur un chariot en mouvement, laissez les animaux s’habituer à la nouvelle pièce pendant 20 à 30 minutes avant le début du protocole de manipulation.
Pour les animaux logés en groupe, utilisez une cage temporaire pour loger les souris après la manipulation, avant de les regrouper toutes dans leur cage d’origine. Cela réduit les combats potentiels entre les animaux avant la manipulation (en particulier chez les mâles).
Travaillez sur un comptoir (de préférence un comptoir dégagé) ou dans une armoire de biosécurité, avec la cage de logement loin de l’animal manipulé. La proximité de la cage de logement augmente le risque de sauter. Si les animaux sont logés en groupe, sauter de la souris manipulée dans la cage de la maison peut causer du stress aux compagnons de cage.
REMARQUE: Travailler dans une armoire de biosécurité limite le risque que des souris sautent sur le sol et peut être nécessaire dans certaines installations. Cette technique peut être utilisée dans une armoire de biosécurité, en s’assurant de toujours effectuer toutes les étapes à l’intérieur de l’armoire de biosécurité et en évitant que les souris marchent sur les avant-bras du manipulateur.

2. JOUR 1 : 5 min par souris

Ouvrez doucement la cage et placez le couvercle sur le côté, retirez les matériaux de nidification et d’autres enrichissements tels que les roues de roulement ou les abris.
Introduisez une main ouverte gantée dans la cage de la maison, en plaçant lentement la main le long d’un côté du mur de la cage (le mur le plus proche du manipulateur, Figure 1A).
1. N’essayez pas immédiatement de prendre la souris.
Restez immobile et laissez l’animal s’habituer à la présence de la main dans la cage pendant environ 30 s.
Essayez de ramasser la souris dans la paume de la main (c.-à-d. évitez de ramasser l’animal par sa queue).
1. Si la souris n’est pas facilement ramassée après 3 tentatives, guidez la souris vers un coin et une tasse avec les deux mains.
2. Déplacez doucement les mains en coupe vers la souris pour essayer de la ramasser.
3. En cas d’échec après un maximum de 3 tentatives avec les deux mains, prenez doucement la souris par la base de sa queue et transférez-la à votre avant-bras ou à votre main plate.
Avec la souris dans la main, gardez la main aussi plate et ouverte que possible.
REMARQUE: Cela fournit une plate-forme plate sur laquelle la souris peut marcher et limite le risque de piqûres.
En tenant la main ouverte et plate avec la paume vers le haut, placez l’autre main à côté de la main qui tient la souris et laissez la souris se déplacer librement d’une main à l’autre sans aucune retenue (Figure 1B).
Laissez la souris explorer et se déplacer entre les mains pendant 1 min.
1. À ce stade, les souris peuvent essayer de sauter. Positionnez les mains de manière à ce que si la souris saute, elle atterrisse sur un comptoir plutôt que sur le sol.
2. Si une souris semble se préparer à sauter (se déplaçant vers le bord de la main et se redressant sur les pattes postérieures), placez lentement l’autre main devant elle et essayez de la guider pour qu’elle marche sur cette main. Évitez les mouvements brusques car cela augmente leur risque de sauter.
3. Si une souris saute, essayez de la ramasser en évitant la manipulation de la queue et reprenez la session de manipulation. Si la souris reste sur le sol ou hors des mains pendant plus de 10 s, ajoutez du temps supplémentaire à la session de manipulation pour compenser chaque fois que la souris était hors des mains.
4. Prenez des notes sur le saut. Le nombre total de sauts peut être utilisé pour évaluer la variabilité potentielle entre les animaux.
Après 1 min de manipulation avec les mains plates, relâchez la paume de la main et coupez légèrement la souris dans la main, avant de rouler doucement la souris entre les mains (Figure 1C).
1. Pour « rouler », positionnez la souris dans la paume de la main, sur une main plate, perpendiculaire aux doigts.
2. Fermez lentement la main, en plaçant les doigts sur le dos de la souris.
3. Placez la main libre directement sous la main en tenant la souris.
4. Tournez /faites pivoter lentement la main avec la souris pour transférer doucement la souris à l’autre main (flip à 180 °).
5. Répétez ceci d’avant en arrière entre les mains.
Alternez entre le roulement doux entre les mains et l’exploration libre sur les mains ouvertes pendant 60 s, en alternant entre les techniques environ toutes les 20 s.
Effectuer un « test d’abri » (Figure 1D).
1. Laissez la souris se déplacer sur le bord de la main puis rapprochez les 2 mains.
2. Très lentement, coupez-les pour que la souris rentre dans un « abri » formé par les mains. Laissez une ouverture pour que la souris puisse s’échapper si nécessaire.
3. Essayez de garder la souris à l’abri pendant 5 à 10 s, sans aucune contrainte.
4. Alternez entre le test de l’abri, le roulis entre les mains et l’exploration libre des mains ouvertes pendant encore 60 s, en veillant à effectuer l’étape de l’abri 3 fois ou plus.
Dans toutes les procédures décrites à la section 2.10, ne précipitez pas le processus. Si la souris semble stressée (c.-à-d. tentative d’évasion, saute des mains, évite le contact avec les mains, etc.) en étant confinée à l’intérieur des mains, continuez à rouler entre les mains et à explorer librement pendant 20 s, puis réessayez.
Jalon : Effectuez au moins 1 test d’abri réussi de 10 s pour terminer le jour 1.
1. Considérez un test d’abri réussi lorsque la souris reste dans les mains. Si la souris sort la tête et retourne à l’abri, c’est toujours un test réussi. Si l’animal sort entièrement du refuge, c’est un échec.
Permettre l’exploration libre dans les mains pendant 30 s.
Remplacez doucement la souris dans sa cage. Si le groupe est logé, placez la souris dans la cage temporaire jusqu’à ce que tous les compagnons de cage soient manipulés. Remettent les souris dans leur cage d’origine en les ramassant dans la paume de la main. N’utilisez pas de ramassage de queue.
Nettoyez la paillasse des matières fécales potentielles et de l’urine avec de l’éthanol à 70%.
Rincez soigneusement les gants avec de l’éthanol à 70% (ou une solution de nettoyage appropriée) ou changez de gants avant de manipuler la prochaine souris (il est possible de garder les mêmes gants pour les compagnons de cage).
REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer la manipulation avec un nombre raisonnable d’animaux pour éviter la fatigue du manipulateur. La manipulation de 24 souris prend environ 2 h et il est recommandé de ne pas dépasser 24 souris par manipulateur. Si plus d’animaux doivent être manipulés, il est recommandé soit d’avoir plusieurs manipulateurs, soit de diviser les procédures de manipulation en sous-groupes, sur plusieurs jours.

3. JOUR 2 : 3 à 5 min par souris

Essayez de prendre la souris dans la paume de la main. À ce stade, cela devrait déjà être faisable et les souris ne devraient pas sauter de la main.
Commencez par ouvrir la paume comme le jour 1, ce qui permet à la souris d’explorer librement pendant 20 s.
Ensuite, roulez la souris entre les mains plusieurs fois (4-5 fois).
Effectuez le « test d’abri » pendant 5 s.
Répétez le test d’abri plusieurs fois (~5-6) sur une période de 2 à 3 minutes.
Au cours de la même période de 2 à 3 minutes, alternez avec le roulement entre les mains et l’exploration libre des mains ouvertes à partir du jour 1 pour améliorer l’accoutumabilité.
1. Touchez la souris sur la tête et le dos (Figure 1E), 5 à 6 fois. Un signe d’accoutumant est lorsque la souris vous permet de la toucher sans tenter de vous échapper.
2. Effectuez un « nose poke » : Essayez de toucher le museau de la souris, 2 à 3 fois (Figure 1F).
  1. Si la souris tente de mordre ou montre des signes évidents de stress au toucher, ne réessayez pas immédiatement de piquer le nez. Au lieu de cela, alternez avec l’exploration à la main plate et roulez. L’accoutumante se traduit par le fait que l’animal ne s’enfuit pas ou ne tourne pas la tête en cas de contact humain.
Dans toutes les procédures décrites aux 3.4-3.6, ne précipitez pas le processus. Si la souris semble stressée par le fait d’être confinée à l’intérieur des mains ou ne veut pas être touchée, continuez à rouler entre les mains pendant 20 à 30 s, puis réessayez.
Jalons: Effectuez au moins 1 piqûre de nez réussie pendant 2-3 s pour terminer le jour 2.
Arrêtez cette séance après environ 3 minutes de manipulation si l’animal réagit bien au « refuge », aux « caresses de tête », au « nez piqué », et si la souris semble disposée à explorer les mains sans signes de stress.
Si la souris continue de présenter des signes de stress ou ne réagit pas bien au test « shelter test » ou « nose poke », poursuivez la séance jusqu’à atteindre 5 min comme au jour 1.
Remplacez la souris dans sa cage, nettoyez la paillasse et les gants comme au Jour 1.

4. JOUR 3: Environ 3 min par souris

Le troisième jour, suivez les mêmes étapes qu’au jour 2, pendant 2 à 3 min.
1. Prenez la souris dans la paume de la main.
2. Transférez et roulez la souris entre les mains
3. Effectuez un test d’abri.
4. Essayez de caresser la souris sur le dos et la tête.
Alternez entre ces étapes sur environ 1 à 2 min.
Continuez la procédure jusqu’à ce que la souris soit suffisamment détendue pour s’asseoir dans la paume de la main sans tenter de s’échapper.
Avant la fin du jour 3, répétez le test d’abri et le test de piqûre de nez comme test d’accoutumant.
1. Si les deux tests peuvent être complétés à leur première tentative, le processus d’accoutumant est terminé. Continuez à manipuler doucement la souris pendant 30 s à une minute.
2. Si la souris est initialement résistante à l’un ou l’autre test, répétez les étapes 4.1 à 4.3 pendant 20 à 30 s avant de réessayer le test de piqûre de nez et d’abri.
3. Si la souris reste résistante à ces tests après 3 min, le troisième jour peut être répété.
Jalons: Effectuez au moins 2 tests d’abri réussis de 10 s chacun, et 2 tests de piqûre de nez réussis pour terminer le jour 3 et terminer l’ensemble de la procédure de manipulation 3D.
Resser la souris dans sa cage, nettoyer la paillasse et les gants.

5. Approche facultative pour les animaux soumis à une contention pour injection ou gavage

REMARQUE: Le jour 3, si l’animal est retenu à des fins expérimentales (gavage oral, injection intra-péritonéale, etc.), les souris peuvent être soumises au test de pincement du cou.

Saisissez la nuque entre le pouce et l’index(Figure 1G).
Soulevez la souris de 3 à 5 cm au-dessus de la main pendant 2 à 3 s.
REMARQUE: Il s’agit normalement d’une position non naturelle pour les souris adultes, et si les souris restent presque immobiles, elles sont bien habituées à la manipulation et seront faciles à retenir à des fins expérimentales.
Replacez la souris dans la main plate ou, si la souris est réactive au pincement du cou, envisagez de la placer sur la manche, le couvercle de la cage ou le comptoir de l’expérimentateur.
REMARQUE: Si vous travaillez dans une armoire de biosécurité, ne placez pas la souris sur le manchon ou elle pourrait se lever et sortir de l’armoire de biosécurité. Préférez placer la souris sur le comptoir à l’intérieur de l’armoire de biosécurité.
Laissez la souris explorer librement la main de l’expérimentateur pendant 1 min.

6. Approche facultative pour les jours supplémentaires de manutention

Dans l’éventualité d’une lignée de souris très stressée, ajoutez des jours supplémentaires pour diminuer la réactivité et le niveau de stress des animaux, en utilisant les méthodes décrites au jour 2/3.
REMARQUE: De nombreux facteurs peuvent affecter le stress de base des animaux, y compris la souche, la présence de modifications transgéniques, l’âge, le sexe et les conditions de logement. Si ces facteurs ne sont pas cohérents entre des groupes tels que les animaux âgés testés sur de jeunes témoins ou les animaux transgéniques testés sur des témoins de type sauvage, il est recommandé d’utiliser le même nombre de jours d’accoutumant pour chaque groupe.

7. Manutention des tunnels

REMARQUE: Cette technique s’applique uniquement aux souris à manipulation tunnel. Les tunnels sont des tubes en polycarbonate d’environ 13 cm de long et 5 cm de diamètre.

Placez le tunnel dans la cage de la souris.
Laissez le tunnel dans la cage pendant 7 jours avant la manipulation.
Ouvrez la cage et placez le couvercle sur le côté.
Guidez doucement la souris dans le tunnel en polycarbonate (déjà dans la cage).
Soulevez le tunnel de la cage, horizontalement. Si nécessaire, couvrez lâchement les extrémités du tunnel pour empêcher l’animal de sauter / tomber du tunnel, retombant potentiellement dans sa cage ou sur le sol.
Éloignez l’animal dans le tunnel de la cage de la maison et tenez-le à l’écart de toute surface pendant 30 s.
Replacez le tunnel dans la cage de la maison, ce qui permet à la souris de sortir du tube.
Attendez 60 s, puis répétez les étapes 7.4 à 7.7 une fois.
Rincez soigneusement les gants avec de l’éthanol à 70% ou changez de gants avant d’habituer la souris suivante.
Répétez cette procédure pendant 10 jours consécutifs.

8. Manipulation de la queue

REMARQUE: Cette technique s’applique uniquement aux souris à manche de queue. Il est utilisé pour transférer des souris de leur cage à un appareil, et vice versa.

Ouvrez la cage et placez le couvercle sur le côté.
Saisissez les souris par la base de la queue entre le pouce et l’index.
Soulevez la souris de la cage.
En 2-3 s, transférez la souris à l’avant-bras opposé de l’expérimentateur tout en maintenant une prise sur la queue pour éviter que la souris ne pende.
Lorsque la manipulation de la queue est nécessaire dans la mise en œuvre de cette expérience (p. ex., avant les prélèvements sanguins pour les tests de cortisol), les animaux sont transférés à l’avant-bras de l’expérimentateur par manipulation de la queue et maintenus pendant 15 s avant d’être renvoyés dans leur cage.

9. Labyrinthe Surélevé Plus

Configuration de la salle
1. Placez le labyrinthe au milieu de la pièce, sous un appareil photo numérique équipé d’une carte mémoire.
2. Installez la lumière de la pièce à ~60 Lux à l’aide de 2 lampes debout placées derrière le labyrinthe.
3. Éteignez tout éclairage aérien pour éviter la lumière directe sur le labyrinthe qui crée une réflexion et perturbe la détection des animaux dans le labyrinthe.
4. Une fois tout l’équipement installé, transférez les animaux dans la pièce et laissez-les s’acclimater aux réglages de lumière et au nouvel environnement pendant 30 minutes.
Test
1. Nettoyez le labyrinthe avec de l’éthanol à 70% pour éviter les odeurs de poussière ou de l’animal qui a été testé précédemment.
2. Démarrez l’appareil photo.
3. Utilisez un morceau de papier avec l’ID de l’animal pour enregistrer l’ID sur la vidéo, avant de placer l’animal dans le labyrinthe (cela facilitera l’identification correcte de la souris filmée sur chaque vidéo).
4. Utilisez la technique de manipulation appropriée à chaque animal pour le transférer dans le labyrinthe.
5. Placez la souris sur la plate-forme centrale, face à un bras ouvert.
6. Laissez la souris explorer l’appareil pendant 10 minutes, sans être dérangé.
7. Après 10 minutes, arrêtez la caméra.
8. Récupérez la souris du labyrinthe et remettez-la dans sa cage.
9. Nettoyez les matières fécales et l’urine du labyrinthe avec 70% d’éthanol.
10. Une fois le test terminé avec toutes les souris, transférez les vidéos de la carte mémoire vers un ordinateur pour le suivi vidéo.
11. À l’aide d’un logiciel automatisé de suivi des animaux, suivez le nombre d’entrées dans les bras ouverts et fermés, et le temps passé dans les bras ouverts ou fermés (ici Ethovision XT 14).

10. Interaction de l’expérimentateur (dérivée de Hurst et West⁹⁾

Configuration de la salle
1. Placez une table au milieu de la salle de test sous un appareil photo numérique équipé d’une carte mémoire.
2. Installez la lumière à 50-70 Lux avec 4 ampoules placées dans le coin de la pièce face au plafond. Éteignez l’éclairage aérien pour éviter la lumière directe sur le labyrinthe qui crée une réflexion et perturbe la détection des animaux dans l’arène.
3. Amenez les animaux dans la pièce.
4. Laissez-les s’acclimater à la pièce pendant 30 minutes.
Expérience
1. Placez la cage de la maison sous l’appareil photo numérique.
2. Retirez le couvercle.
3. Enlevez le matériel de nidification et tout autre enrichissement qui pourrait interférer avec le suivi des animaux.
4. Démarrez l’appareil photo.
5. Utilisez la carte de cage avec l’identifiant de l’animal pour identifier l’animal sur la vidéo.
6. Placez une main dans la cage de la maison le long du mur de la cage à l’avant droit.
  1. Assurez-vous que la tête du manipulateur ne bloque pas l’appareil photo pour filmer la souris.
7. Démarrez une minuterie.
8. Gardez la main immobile pendant 2 minutes et laissez la souris explorer la main.
9. Retirez la main de la cage pendant 15 s.
10. Essayez de ramasser la souris à l’aide de mains coupées et enregistrez si la souris s’enfuit.
11. Répétez la dernière étape jusqu’à cinq fois, toutes les 5 secondes, ou jusqu’à ce que la souris se permette d’être ramassée.
12. Enregistrez le nombre de tentatives nécessaires pour décrocher la souris.
13. Retournez le matériel de nidification et l’enrichissement dans la cage.
14. Nettoyez les gants avec de l’éthanol à 70% ou changez de gants avant de passer à l’animal suivant.
15. Après le test, transférez les vidéos de la carte mémoire vers un ordinateur.
16. À l’aide d’un logiciel de suivi vidéo automatisé, divisez la cage en quatre quadrants égaux et enregistrez le temps passé par la souris dans chaque quadrant (ici, Ethovision XT 14).

11. Nouveauté Alimentation supprimée

Privation de nourriture
1. 3 jours avant le test, effectuez un changement complet de la cage et hébergez individuellement les animaux (un seul logement est préférable pour effectuer le test de la cage à domicile).
  REMARQUE: Fournir de la literie fraîche élimine la poussière potentielle ou les petits morceaux de nourriture qui s’accumulent dans la litière depuis le dernier changement de cage.
2. La veille du test, pesez tous les animaux vers 18 heures.
3. Retirez tous les aliments de la trémie et assurez-vous qu’il n’y a pas de morceaux de nourriture dans la cage ou dans la litière.
Configuration de la salle
1. Placez la chambre NSF sur une table.
2. Remplissez la chambre avec une fine couche de litière de maïs (ou d’une autre litière différente de la litière utilisée dans la cage domestique des animaux).
3. Installez la lumière à 70 Lux avec 4 ampoules placées dans le coin de la table où se trouve la chambre, face au plafond. Éteignez les plafonniers pour maintenir un faible éclairage de la pièce.
4. Placez une pastille de chow standard utilisée dans l’installation, sur le côté de la chambre face à l’expérimentateur (≈10 cm du mur).
Test
1. Le matin, après la privation de nourriture, amenez les animaux dans la pièce 30 minutes avant le test pour les laisser s’acclimater aux paramètres de lumière et au nouvel environnement.
2. Peser tous les animaux afin de mesurer leur perte de poids en fonction du poids mesuré la veille. Les animaux devraient perdre 8 à 12% du jour au lendemain pour pouvoir effectuer la tâche correctement.
3. Triez les animaux par perte de poids et filtrez-les en partant de la souris qui a le plus perdu jusqu’à la souris qui a perdu le moins de poids.
4. Assurez-vous que la chambre est remplie de litière et d’une seule pastille.
5. Placez l’animal du côté opposé de la chambre, loin de la pastille de nourriture.
6. Démarrez la minuterie immédiatement.
7. Laissez la souris explorer la chambre pendant 12 minutes.
8. Mesurez la latence pour approcher et nourrir (l’animal doit mordre et manger) sur le granulé alimentaire.
  1. Considérez qu’il s’agit d’une approche lorsque l’animal s’approche de la pastille, la sent et ne mord pas.
  2. Définissez une morsure comme lorsque l’animal commence à consommer le granulé.
9. Enregistrez la latence pour approcher et alimenter la pastille en quelques secondes.
10. Une fois que la souris s’est nourrie de la pastille alimentaire, retirez-la de la chambre.
11. Jetez la literie, mais conservez le granulé qui sera utilisé pour tester l’entraînement de l’appétit dans la cage de la souris.
12. Réinitialisez la chambre pour l’animal suivant et passez à l’animal suivant.
13. 15 min après la fin du test dans la chambre, déposer la pastille utilisée pendant le test, à l’intérieur de la cage de la souris, contre le mur à l’avant de la cage.
14. Mesurez la latence pour vous nourrir de la pastille lorsque la pastille est dans la cage de la maison. Il s’agit d’une mesure de l’entraînement de l’appétit.
  1. Il est préférable de retirer le matériau de nidification pour s’assurer que la souris voit la pastille tomber dans sa cage.

12. Collecte de sérum et mesure de la corticostérone

Manipulez les animaux pendant 1 min en utilisant la technique assignée, 15 min avant la collecte de sang (cela peut être fait avec des animaux logés en groupe ou en individuel, en gardant à l’esprit le risque de bagarres lors du regroupement de souris).
1. Pour les souris manipulées par le tunnel, guidez-les vers le tunnel, soulevez le tunnel de la cage pendant 1 min et remplacez la souris dans sa cage.
2. Pour les souris manipulées par la queue, attrapez la base de la queue de la souris et retirez la souris de sa cage. Transférez la souris dans la pochette de l’expérimentateur pendant 1 min et ramenez la souris dans sa cage en manipulant la queue.
3. Pour les souris manipulées en 3D, utilisez des mains en coupe pour retirer la souris de sa cage. Tenez la souris dans des mains coupées pendant 1 min et retournez-la dans sa cage.
15 min après la manipulation, procéder à la collecte de sang dans la veine sous-maxillaire²².
Frottez fermement la souris de manière à ce que la tête de la souris soit solidement immobilisée.
Localisez le site de la ponction.
1. Il y a une petite fossette sans poils le long de la mandibule du visage qui peut être utilisée comme point de repère pour localiser le site de ponction. En traçant une ligne entre la base de la mâchoire et cette fossette, le site de ponction se trouve derrière cette fossette vers l’oreille d’environ 5 mm, juste derrière la charnière de la mâchoire.
Tenez une aiguille propre de 23 G perpendiculairement au site de ponction et utilisez un mouvement d’autopiqueur ferme et rapide. La pointe de l’aiguille doit pénétrer à une profondeur comprise entre 1 et 2 mm, le sang circulera immédiatement dès que la veine est perforée.
Recueillir environ 150 μL de sang dans des tubes de collecte enduits d’EDTA et les stocker sur de la glace.
Appliquez une légère pression avec un tampon de gaze stérile sur le site de ponction pendant 5 s ou plus pour permettre au sang de coaguler.
Une fois que le sang a coagulé, ramenez la souris dans sa cage d’origine.
Centrifuger le sang à 4 °C 3 500 x g pendant 10 min.
Décantez le surnageant.
Stocker le surnageant à -20 °C pour les analyses en aval.
Mesurez les niveaux de corticostérone à l’aide d’un kit ELISA de corticostérone en suivant le protocole du fabricant.
Utilisez un spectrophotomètre pour lire les résultats ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deux études distinctes ont été réalisées avec des souris C57BL/6. Les #1 de l’étude incluaient des mâles de 6 mois et l’étude #2 incluait des femelles de 2,5 mois (N = 36 / étude) de Jackson Laboratories (Cat #000664). Les souris sont arrivées dans l’établissement à l’âge de 2 mois. Alors que l’étude #2 les femmes ont été manipulées et testées deux semaines après leur arrivée, l’étude #1 les hommes n’ont été manipulés et testés qu’à l’âge de 6 mois (retard dû à l’arrêt de la pandémie mondiale). Pendant ce temps, une souris de l’étude #2 est décédée, avant de commencer à manipuler des expériences. L’étude #1 souris mâles ont été soignées par le personnel des animales. Toutes les souris ont été maintenues sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures (7h00 ON, 19h00 OFF), ayant accès à de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur cage à la maison était remplie de papier journal recyclé comme matériau de litière, ainsi que de matériel de nidification. Les souris ont été logées individuellement, afin de limiter le comportement agoniste potentiel chez les mâles logés en groupe pendant la séance de manipulation ou après des procédures telles que la collecte de sang ou les tests comportementaux. Les souris ont été randomisées en trois groupes : la manipulation de la queue, la manipulation en tunnel et la manipulation 3D,et manipulées dans la salle ouverte selon la conception de leur groupe respectif (Figure 2). Le groupe manipulé par le tunnel a reçu le tunnel en tant qu’enrichissement pendant 1 semaine avant la session de manutention. Ils ont ensuite été manipulés pendant dix (10) jours consécutifs, avant les tests comportementaux. Une semaine après la fin des différentes séances de manipulation, les tests comportementaux ont commencé. Le jour 16, les souris ont été testées dans l’EPM, puis dans le test d’interaction de l’expérimentateur. Deux jours plus tard, des souris ont été testées dans la NSF. Enfin, le jour 24, le sang a été prélevé 15 minutes après une séance de manipulation d’une minute du même type que la manipulation initiale.

Pour les tests comportementaux, les animaux manipulés en tunnel ont été transférés de leur cage à l’appareil en utilisant le tunnel autant que possible. Cependant, pour l’expérience Elevated-Plus Maze, les dimensions du labyrinthe ont rendu difficile l’enlèvement ou le placer des animaux dans le labyrinthe à l’aide du tunnel. Dans ce cas, les animaux ont été transférés des tunnels aux mains coupées et transportés dans le labyrinthe. Des souris manipulées en 3D ont été manipulées au cours des trois jours, en même temps que les jours 8 à 10 de manipulation en tunnel (Figure 2). Les souris manipulées par la queue n’étaient pas habituées à la manipulation, mais étaient manipulées par la queue lors d’interactions avec les expérimentateurs. Pendant la durée de l’étude, le changement de cage a été effectué par l’expérimentateur pour s’assurer de l’utilisation de la technique de manipulation appropriée utilisée pour chaque groupe.

Dans le test d’interaction avec l’expérimentateur, les animaux ont été testés pour leur volonté d’interagir volontairement avec l’expérimentateur et la facilité de manipulation dans un contexte expérimental (Figure 3). L’ANOVA effectuée sur le nombre de tentatives de ramassage de la souris dans la cage a montré un effet significatif de l’approche de manipulation dans l’étude #1 mâles (F_(2,31)= 6,36, p = 0,004) et dans l’étude #2 femelles (F_(2,33)= 12,21, p = 0,0001). Les analyses post-hoc de Scheffe ont révélé que le nombre de tentatives nécessaires pour ramasser les souris était significativement réduit à la fois par la 3D (p = 0,0061 dans l’étude #1 mâles, et p = 0,0002 dans l’étude #2 femelles) et la manipulation en tunnel (p = 0,04 dans l’étude #1 mâles, et p = 0,003 dans l’étude #2 femelles), par rapport au groupe manipulé de la queue(Figure 3A). L’ANOVA effectuée sur le temps passé dans le même quadrant que la main a montré un effet significatif de la manipulation dans l’étude #1 les hommes_{(F (2,31)}= 5,38, p = 0,009) et dans l’étude #2 les femmes (F_(2,33)= 3,5, p = 0,04; Figure 3B). Les analyses post-hoc de Scheffe ont montré que l’étude #1 souris mâles manipulées avec la technique de manipulation 3D passaient significativement plus de temps dans le même quadrant que la main de l’expérimentateur, par rapport aux souris à manche de queue (p = 0,012). Il n’y avait pas de différences significatives entre les groupes de manipulation dans l’étude #2, les femmes de 2,5 mois. Le degré d’interaction avec l’expérimentateur est en outre démontré par les cartes thermiques combinées des points centraux des souris(Figure 3C-E). Ceux-ci illustrent comment les souris mâles manipulées en 3D de l’étude #1 passé plus de temps proximal à la main, y compris les zones proches de la main, tandis que les souris manipulées par la queue avaient le moins d’interaction globale avec la main.

Les effets de la manipulation en 3D et en tunnel ont été comparés à la manipulation de la queue dans deux tests de comportements anxieux, le test d’alimentation supprimée de nouveauté (NSF) et le labyrinthe élevé plus (EPM). Dans le test NSF, l’ANOVA réalisée sur la latence à l’approche a montré un effet de la technique de manipulation utilisée dans l’étude #1 les hommes (F_(2,31)= 3,5, p = 0,04). Les analyses post-hoc de Scheffe dans Study #1 mâles ont montré des tendances chez les souris manipulées en 3D (p = 0,08) et chez les souris à tunnel (p = 0,08), avec une latence d’approche réduite par rapport aux souris manipulées par la queue(Figure 4A). Aucun effet n’a été observé dans l’étude #2. L’ANOVA réalisée sur la latence d’approche dans la cage de la souris (données non montrées) n’a montré aucun effet de manipulation (p = 0,88 dans l’étude #1 mâles et p = 0,16 dans l’étude #2 femelles). L’ANOVA réalisée sur le pourcentage de temps passé à bras ouverts dans l’EPM a révélé un effet significatif de la manipulation dans l’étude #2 les femmes (F_(2,33)= 3,5, p = 0,04). Aucun effet n’a été observé dans l’étude #1 les hommes (F_(2,31)= 2,1, p = 0,1; Figure 4B). Les analyses post-hoc de Scheffe n’ont révélé qu’une tendance à l’augmentation du temps passé à bras ouverts chez les souris manipulées en tunnel de l’étude #2, par rapport aux souris manipulées par la queue (p = 0,07). En ce qui concerne le pourcentage d’entrées dans les bras ouverts(figure 4C),l’ANOVA n’a révélé aucun effet de manipulation, ni dans l’étude #1 les hommes ni dans l’étude #2 les femmes_{(F (2,31)}= 1,12, p = 0,33; et F_(2,33)= 1,3, p = 0,26, respectivement). Les scores comportementaux ont été résumés dans un z-score, comme dans Guilloux et al.²³, informant sur la réduction potentielle des comportements anxieux par rapport aux souris manipulées par la queue (Figure 4D). L’ANOVA sur les scores z a montré un effet significatif de la manipulation dans l’étude #1 les hommes (F_(2,31)= 5,6, p = 0,008) mais pas dans l’étude #2 les femmes (F_(2,33)= 1,07, p = 0,35). Les analyses post-hoc de Scheffe ont montré que la manipulation 3D et la manipulation en tunnel diminuaient significativement le z-score (p = 0,04 et 0,01, respectivement), par rapport à la manipulation de la queue, suggérant que les deux approches réduisent les comportements anxieux dans l’étude #1 les hommes.

Les niveaux de corticostérone après la manipulation ont également été évalués 15 minutes après une brève séance de manipulation (Figure 5). L’ANOVA a trouvé un effet significatif de la manipulation dans l’étude #2 les femmes (F_(2,33)= 4,44, p = 0,01), mais pas dans l’étude #1 les hommes (F_(1,31)= 0,53, p = 0,59). Dans l’étude #2 femelles, des analyses post-hoc ont révélé une diminution significative des niveaux de corticostérone chez les souris du groupe de manipulation 3D par rapport au groupe de manipulation de la queue (p = 0,02).

Pour déterminer si les techniques de manipulation ont eu un impact significatif sur la variabilité des données obtenues, nous avons appliqué le test d’homogénéité de la variance de Bartlett. Nos résultats n’ont trouvé aucune différence significative dans la variabilité de l’étude #2 souris femelles entre les mesures (% temps EPM B_(2,33)= 4,95, p = 0,087; % entrées EPM B_{(2, 33)}= 3,68, p = 0,16; NSF B_{(2, 33)}= 0,20, p = 0,91; CORT B_{(2, 33)}= 1,69, p = 0,42). Cependant, dans l’étude #1 souris mâles, il y avait une hétérogénéité significative de variance dans le test NSF_{(B (2,31)}= 8,08, p = 0,0175) et dans les niveaux DE CORT mesurés (B_(2,32)= 11,63, p = 0,0029), mais pas dans l’une ou l’autre des mesures pour l’EPM (% temps EPM B_(2,32)= 1,16, p = 0,56; % des entrées EPM B_(2,32)= 2,79, p = 0,25). L’utilisation du test F pour comparer deux variances a montré que dans le test NSF, la variance était significativement réduite pour l’étude #1 mâles par les techniques de manutention 3D_{(F (1,21)}= 4,22, p = 0,04) et de manutention en tunnel (F_(1,22)= 4,01; p = 0,03) par rapport à la manipulation de la queue. Pour la concentration de CORT après manipulation, seule la manipulation 3D a significativement réduit la variabilité (F_(1,20)= 9,65, p = 0,0019) par rapport à la manipulation de la queue.

Graphique 1. Images représentatives de la procédure de manipulation 3D. Les images illustrent la procédure de manipulation 3D. A) Main dans la cage: La main de l’expérimentateur est placée dans la cage et maintenue immobile, ce qui permet à la souris de s’habituer à la présence de la main dans la cage. B) Main plate: lors du premier retrait de la cage, la souris est placée sur la paume plate de la main. La souris peut marcher librement autour de la paume et se déplacer entre les mains plates adjacentes. C) Rouler: Détendez la paume de la main pour former une « tasse » lâche autour de la souris. Inclinez doucement la tasse dans la main opposée, la souris doit se déplacer librement vers cette main, sinon la guider doucement dans l’autre main. D) Abri: placez la souris sur le bord de la main puis rapprochez les deux mains et formez très lentement une tasse autour de la souris. La souris ne doit pas être retenue et une ouverture doit être laissée pour que la souris puisse s’échapper. Maintenez pendant ~ 5-10 s, puis ouvrez les mains plates. E) Caresses tête/dos : Pendant que la souris explore la paume plate de la main, caressez doucement la souris sur la tête et le dos. Cela habitue la souris à l’approche de l’expérimentateur d’en haut. F) Nose Poke: Lorsque la souris semble être habituée à la manipulation, essayez de toucher doucement la souris directement sur le museau. Si la souris ne déplace pas sa tête, elle est bien habituée à la manipulation. G) Il est possible d’effectuer un pincement court (2-3 s) du cou le dernier jour, pour mesurer l’accoutumabilité des animaux en cas d’interventions futures nécessitant une contention. Lorsqu’elles sont habituées à la manipulation, les souris restent immobiles pendant le pincement du cou, tandis que les souris non habituées essaieront de s’échapper en tournant la queue pour se libérer de la dispute. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 2. Conception expérimentale. Après leur arrivée dans l’établissement, les souris manipulées par la queue n’ont reçu aucune accoutumant. Les souris à manipulation tunnel ont été habituées aux tunnels dans leur cage d’origine pendant une semaine avant le début de la manipulation. Les souris manipulées en tunnel ont été manipulées avec la technique de manipulation en tunnel pendant 10 jours (premier jour de manipulation = jour 1), tandis que les souris manipulées en 3D ont été habituées pendant trois jours (jours 8 à 10). Les souris ont ensuite été soumises au labyrinthe plus élevé (EPM) (jour 16), au test d’interaction avec l’expérimentateur (jour 19), à une alimentation supprimée de la nouveauté (jour 21) et à une brève séance de manipulation suivie d’une collecte de sérum pour la mesure CORT (jour 24). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 3. Impact des trois techniques de manipulation sur la facilité de manipulation et la volonté d’interagir avec l’expérimentateur. A) Nombre moyen de tentatives de ramassage nécessaires pour retirer une souris de la cage. L’étude #1 mâle (panneau de gauche, Tail Handling N = 12, Tunnel Handling N = 12 et 3D handling N = 11) et Study #2 souris femelles (panneau de droite, N = 12 par groupe) des groupes tunnel et 3D a montré une réduction significative du nombre de tentatives requises pour les retirer de la cage par rapport aux souris manipulées par queue. B) Temps moyen passé par un animal dans le même quadrant de la cage que la main de l’expérimentateur. L’étude #1 souris mâles manipulées avec la technique 3D a montré une augmentation significative du temps passé dans le même quadrant que la main de l’expérimentateur. C-E) Les cartes thermiques moyennes du point central de la souris par le temps rendues dans Ethovision XT 14 ont démontré visuellement l’exploration et l’interaction accrues avec l’expérimentateur de l’étude #1 souris mâles manipulées en 3D. Les barres d’erreur indiquent SEM. *p<005, **p<0,01 par rapport au groupe Tail Handled. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 4. Impact des trois techniques de manipulation sur les comportements anxieux. A) Latence pour approcher et se nourrir de la pastille dans la chambre d’alimentation supprimée de nouveauté dans l’étude #1 souris mâles (Manipulation de la queue N = 12, Manipulation en tunnel N = 12 et Manipulation 3D N = 11) et dans l’étude #2 souris femelles (N = 12 / groupe). Les données de l’étude #1 souris mâles dans les groupes de manipulation 3D et de manipulation de tunnel ont montré une tendance à la réduction significative de la latence pour approcher la pastille. B) Moyens de % du temps passé dans les bras ouverts du labyrinthe surélevé plus. Il n’y avait pas de différences significatives entre les groupes de l’étude #1 les hommes, et une tendance vers plus de temps à bras ouverts par l’étude #2 les femmes du groupe de manipulation des tunnels. C) Entrées à bras ouverts : Il n’y avait pas de différences significatives entre les groupes dans l’étude #1 les hommes, ni dans l’étude #2 les femmes. D) Z-score résumant les comportements anxieux. En utilisant les données présentées en A, B et C, un score z a été calculé en utilisant les souris à manche de queue comme référence. La diminution du score z suggère une diminution des comportements anxieux mesurés par les tests NSF et EPM. L’étude #1 souris mâles manipulées à l’aide de la technique 3D ou tunnel a montré un phénotype anxieux réduit par rapport aux souris manipulées par la queue. Les barres d’erreur indiquent SEM. *p<0,05 comparaison avec le groupe à manche arrière. t représente le niveau de signification tendancile (p<0,1) par rapport au groupe de queue manipulée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 5. Niveaux de corticostérone après manipulation. Le sérum a été recueilli 15 minutes après une brève séance de manipulation, puis les niveaux de CORT ont été mesurés par ELISA dans l’étude #1 mâle (Manipulation de la queue N = 12, Manipulation en tunnel N = 12 et Manipulation 3D N = 11) et dans l’étude #2 souris femelles (N = 12 / groupe). L’étude #2 souris femelles manipulées via la technique de manipulation 3D a montré des niveaux de corticostérone réduits par rapport aux souris manipulées par la queue. L’ANOVA dans l’étude #1 souris mâles n’a pas atteint la signification des différences entre les groupes (p = 0,5). Les barres d’erreur indiquent SEM. *p<0,05 par rapport au groupe Tail Handled. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Table 1
Tableau 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cette étude et le développement de méthodes sont basés sur l’observation que les techniques de manipulation chez la souris sont encore négligées par la communauté scientifique, et que certains laboratoires sont encore réticents à mettre en œuvre des techniques d’accoutumant ou de manipulation pour réduire le stress et la réactivité de leurs animaux avant les expériences. Tout en représentant un engagement de temps, la manipulation des animaux fournit des effets bénéfiques aux animaux qui peuvent contribuer au succès des expériences à effectuer et évite que les expériences doivent être effectuées plusieurs fois en raison de la variabilité des données ou de la sur-réactivité des animaux. L’utilisation de la technique de manipulation 3D a réduit les tentatives d’évasion chez la souris. Il a également augmenté l’interaction avec l’expérimentateur et diminué les phénotypes anxieux chez nos souris mâles de 6 mois. De plus, la manipulation 3D a diminué la variabilité des données et diminué les niveaux de corticostérone chez les souris femelles de 2,5 mois après seulement 3 premiers jours de manipulation. Cette approche repose sur des manipulations douces pour habituer la souris à la manipulation par l’expérimentateur facilitant un transport plus fluide et une intervention plus facile.

Il convient de souligner la technique de manipulation 3D que la progression des méthodes de manipulation se produit en réponse à la réactivité de la souris, en fonction de la réalisation des jalons décrits ci-dessus et dans le tableau 1. Les animaux devraient avoir réduit la réactivité à une étape de manipulation avant de passer aux étapes suivantes. Tenter de progresser trop rapidement vers les étapes « refuge » ou « nez piqué » sur des animaux qui ne sont pas suffisamment habitués entraînerait probablement une augmentation du stress et pourrait réduire l’efficacité de la procédure. De même, la réactivité de l’animal à chaque jour de manipulation devrait être surveillée et devrait être prise en compte au moment de décider si des jours de manipulation supplémentaires sont nécessaires. Si les animaux ne répondent pas bien au test du refuge le premier jour, ne répondant pas aux critères d’atteinte du premier jalon, le premier jour de manipulation pourrait être répété jusqu’à la fin du jalon. De même, si les animaux ne répondent pas au test de piqûre nasale le deuxième jour, le deuxième jour peut également être répété. Une autre mise en garde à noter avec cette approche est que le risque que les souris sautent est plus grand le premier jour de manipulation, en particulier dans les souches sautillantes comme C57BL6. Suivre les directives décrites ci-dessus devrait réduire le risque de sauter et fournir des moyens de limiter de tels comportements. La durée de la manipulation et la progression à travers les étapes peuvent varier en fonction des souches, en particulier si l’on travaille avec des modèles transgéniques connus pour présenter des phénotypes anxieux.

Plusieurs facteurs peuvent contribuer à réduire l’efficacité de la technique de manipulation 3D présentée. L’un de ces facteurs est la peur ou l’hésitation potentielle de l’expérimentateur, dans le cas où l’expérimentateur n’est pas familier avec la manipulation de la souris ou a peur des souris. Par conséquent, l’effet sur le manipulateur est également quelque chose à considérer. Cependant, l’augmentation progressive du niveau d’interaction avec les souris permet aux expérimentateurs novices de développer une confiance et de plus grandes compétences pour exécuter la technique de manipulation au fur et à mesure des étapes de manipulation. Les étapes et jalons proposés (les tests d’abri et de piqûre de nez) peuvent aider à contrer la variabilité humaine potentielle chez les manipulateurs novices, en veillant à ce que les animaux atteignent des niveaux d’accoutumant similaires. Il a été rapporté que la promotion d’interactions humaines-animales positives avec les animaux avait entraîné une meilleure qualité de vie et une plus grande satisfaction de compassion chez le personnel soignant les animaux²⁴. En tant que tel, le fait de s’éloigner de la manipulation présente des avantages à la fois pour le manipulateur et pour l’animal lors de toute interaction ou intervention générale.

Avec son impact sur la diminution du nombre de tentatives de ramassage de la souris, à la fois chez les mâles de 6 mois et les femelles de 2,5 mois, la manipulation 3D offre une alternative à la manipulation en tunnel ou à d’autres techniques, facilitant le transfert des animaux de leur cage à l’appareil expérimental. La technique de manipulation 3D a également augmenté l’interaction de souris mâles de 6 mois avec l’expérimentateur. Cela n’a pas été observé chez les souris femelles âgées de 2,5 mois, mais les souris femelles sont restées plus faciles à ramasser que les souris à poignée de queue. Cela suggère que la technique de manipulation 3D pourrait être plus appropriée pour les expériences nécessitant des interactions directes entre l’animal et l’expérimentateur, comme le labyrinthe d’eau de Morris (malgré les facteurs de confusion potentiels entre le sexe et l’âge discutés plus loin). D’autres ont développé et utilisé des techniques de manipulation manuelle, consistant à ramasser les animaux avec des mains en coupe, sans manipulation supplémentaire¹⁰. Bien que ces techniques aient montré des effets bénéfiques, les données de la littérature présentent souvent des protocoles de manipulation avec des périodes d’accoutumant supérieures à 10 jours^9,¹⁶. De plus, la manipulation en coupe sans l’interaction raffinée fournie par la manipulation 3D peut ne pas convenir aux souches sautillantes qui continuent de sauter et de s’éloigner des mains. Bien que nous n’ayons pas fait de comparaison directe dans cette étude avec la méthode de la tasse, la manipulation 3D aborde ce problème et repose sur des mouvements raffinés pour favoriser l’interaction entre la souris et le manipulateur. L’étude de Ghosal et al.¹⁶ a utilisé une technique de manipulation de tasse combinée à un massage pendant 5 jours, et a montré que cette technique limite l’impact du stress sur les paramètres métaboliques, soulignant la nécessité de mouvements raffinés et d’interaction pendant la manipulation pour une meilleure efficacité. Basé sur cette technique de massage en tasse, la manipulation 3D utilise une interaction supplémentaire pour habituer les souris. En utilisant l’approche de manipulation 3D, les manipulateurs s’assurent que toutes les souris atteignent un niveau d’accoutumant similaire en effectuant des mouvements standardisés et en adaptant la durée de la procédure à chaque animal en fonction de ses besoins (dans la présente étude, toutes les souris ont franchi les étapes et terminé le protocole de manipulation 3D en 3 jours). Cette approche peut être considérée comme « personnalisée » pour chaque souris, de sorte que tous les animaux atteignent le niveau d’accoutumant souhaité chaque jour de manipulation. Comme mentionné précédemment, si les animaux n’atteignent pas les jalons décrits dans le protocole, cette technique peut être ajustée en augmentant le nombre de jours. Cette technique a montré des effets bénéfiques pour réduire la variabilité entre les animaux dans les études comportementales et la mesure physiologique (niveaux cort), suggérant que cette approche pourrait contribuer à la réduction de la variabilité intra-étude et réduire l’impact de l’erreur expérimentale potentiellement à l’origine de résultats biaisés dans les études précliniques.

Les résultats à l’appui suggèrent que les souris soumises à la manipulation 3D et en tunnel présentent une anxiété réduite dans le test d’alimentation supprimée de nouveauté, par rapport aux souris manipulées par la queue. Compte tenu des données combinées de la NSF et de l’EPM, les deux approches ont montré des effets significatifs sur la réduction de l’anxiété chez les souris mâles de 6 mois. Cela reproduit les résultats selon lesquels les animaux habitués à la manipulation en tunnel avaient des performances améliorées dans les tests d’anxiété^9,¹⁵ après plus de 10 jours de manipulation, et démontre davantage le potentiel de la manipulation 3D à présenter des effets similaires. Cela a également montré que les souris mâles de 6 mois manipulées en 3D s’approchent et interagissent volontairement davantage avec leur expérimentateur que les souris mâles de 6 mois soumises à une manipulation en tunnel et en queue. Il est important de se faire une évidence, les souris femelles de 2,5 mois soumises à une manipulation 3D avaient des niveaux réduits de CORT, ce qui est en accord avec les résultats publiés précédemment⁹. Les deux études (Study #1 chez des mâles de 6 mois et Study #2 chez des femelles de 2,5 mois) ont confirmé, de deux manières différentes, que la manipulation a un impact bénéfique sur les phénotypes anxieux (soit sur les résultats comportementaux dans l’étude #1, soit sur les niveaux de CORT dans l’étude #2).

Un facteur contribuant possiblement à l’effet est le sexe de l’expérimentateur, dans ce cas masculin. Il a été démontré par Sorge et al.²⁵ que la présence d’expérimentateurs mâles peut entraîner une augmentation du CORT et des comportements anxieux chez les souris mâles mais pas femelles. Cela contraste avec les résultats de la présente étude. La principale différence entre cette étude et l’étude de Sorge et al.²⁵ est que l’approche décrite ici consiste à habituer les souris à la manipulation, en favorisant une interaction positive (non renforcée) avec l’expérimentateur, tandis que Sorge et al.²⁵ ont utilisé des rongeurs naïfs qui n’ont jamais interagi avec les êtres humains. On peut s’attendre à ce que les souris naïves puissent avoir une forte réaction contre les expérimentateurs humains s’ils n’apprennent pas que l’expérimentateur ne représente pas une menace. Cependant, la présente étude n’a été réalisée qu’avec un expérimentateur masculin, et les études futures devraient examiner si de tels effets sont reproductibles avec une expérimentatrice. Bien que l’isolement de ces facteurs ne relève pas de la portée du présent document, il convient de souligner l’importance d’identifier de telles sources de variabilité lors de la mise en œuvre de l’accoutumière de manipulation, ou dans la conception expérimentale plus généralement.

La présente étude a également confirmé l’efficacité de la technique de manipulation en tunnel pour réduire les comportements anxieux et les niveaux de CORT chez les souris⁹^,¹⁰^,¹¹. Un avantage supplémentaire de cette approche est que le tunnel peut être laissé dans la cage comme enrichissement²⁶, ce qui peut également contribuer à une réduction de la réponse au stress / anxiété, contribuant ainsi à améliorer le bien-être¹⁰^,¹¹. Dans ce cas, le rôle de l’expérimentateur est de manipuler le tunnel seulement, avec chaque animal, pendant une minute. Cependant, comme décrit par Gouveia et al¹⁹, le tunnel n’a pas nécessairement besoin de rester dans la cage de la maison et ne peut être présenté aux animaux que lorsque cela est nécessaire pour transférer l’animal, sans causer de stress supplémentaire. Les deux approches, les techniques de manipulation en tunnel et en 3D, offrent des avantages qui devraient être évalués par le laboratoire et les expérimentateurs afin de déterminer quelle approche est la plus appropriée à leurs besoins. Dans la présente étude, le tunnel a été laissé dans la cage, et les effets que nous avons observés sur les comportements anxieux peuvent être dus à une combinaison de manipulation et d’enrichissement du tunnel.

Bien que les deux offrent des effets bénéfiques, les techniques de manipulation 3D et de tunnel ne sont pas sans limites. Une limitation commune est qu’il peut être long et potentiellement décourageant pour les installations pour animaux de mettre en œuvre de telles procédures. Cependant, les avantages supplémentaires sont inestimables, améliorant le bien-être des animaux en réduisant le stress et en améliorant l’interaction avec les expérimenteurs et les fournisseurs de soins aux animaux (comme décrit dans Spangenberg et Kelling²⁷), ainsi que la fiabilité et la reproductibilité de la recherche. Les données probantes de notre établissement suggèrent que cette technique améliore les interactions entre les animaux et le personnel d’élevage, facilitant le changement de cage et la surveillance de la santé. D’autres utilisateurs de notre établissement, la contention et la manipulation globale sont signalées comme étant beaucoup plus faciles avec les souris manipulées, ce qui correspond à nos conclusions selon lesquelles les souris manipulées avec la technique 3D sont moins susceptibles de fuir lorsqu’elles sont ramassées et dans notre exemple, les mâles de 6 mois sont plus enclins à interagir avec leur expérimentateur. Des études de suivi pourraient quantifier ces effets pour démontrer davantage l’utilité de la technique. Dans l’ensemble, cette approche de manipulation 3D, ainsi que l’approche tunnel, contribuent à la règle des 3R, notamment en affinant les interactions animales de routine pour minimiser le stress en réponse à la manipulation. Compte tenu de la réduction observée de la variabilité des données, cela a également le potentiel de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats cohérents et affiner l’approche utilisée pour limiter la variabilité.

Un autre point de discussion basé sur les données présentées est que cette étude a été réalisée avec des animaux logés seuls. Un seul logement a été préféré car il limite les comportements agonistes potentiels (en particulier chez les souris mâles), qui peuvent contribuer à la variabilité interindépendante²⁸^,²⁹. Par souci de cohérence entre les groupes, tous les animaux étaient logés seuls. Il est également intéressant de noter que les interactions positives entre l’expérimentateur et l’animal chez les rats sous forme de chatouillement des rats ont pu atténuer certains des effets de l’isolement social chez les rats logés seuls³⁰^,³¹. Il est possible que des techniques de manipulation impliquant un contact direct entre l’animal et l’expérimentateur, telles que la technique de manipulation 3D ou la technique de massage en tasse décrite par Ghosal et al.^11, puissent avoir un effet similaire. Des études futures pourraient explorer cette question en comparant les effets des techniques de manipulation chez les animaux isolés et les animaux logés en groupe. Des études antérieures ont étudié l’impact des approches de manipulation en tasse et en tunnel avec des souris dans un environnement de groupe, et ont obtenu des résultats^similaires⁷,⁸. Cela confirme qu’il est possible d’utiliser les protocoles de manipulation décrits ici avec des animaux gardés dans des conditions de maison individuelle ou de groupe, en gardant à l’esprit la possibilité d’un comportement agoniste lors du sort d’un animal de la cage et de son retour (en particulier chez les souris mâles ou dans les lignées de souris agressives). Dans de tels cas, il est recommandé d’utiliser une cage temporaire avant de regrouper tous les animaux.

Pour conclure, l’approche de manipulation 3D proposée contribue à réduire la réactivité et le stress chez la souris. Il augmente également la fiabilité des données en réduisant la variabilité après 3 jours de manipulation. Des résultats similaires sont observables avec la manutention du tunnel, dans notre cas après 10 jours de traitement du tunnel. En comparaison avec la technique de manipulation en tunnel, la technique de manipulation 3D a fourni l’avantage d’augmenter l’interaction avec un expérimentateur chez nos souris mâles de 6 mois, ce qui peut être critique dans certains cas. Si la technique de manipulation 3D ou en tunnel devait être mise en œuvre dans toutes les installations pour animaux, cela représenterait une amélioration majeure pour la génération de données et contribuerait grandement à la réduction de l’utilisation des animaux dans la recherche.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le comité de soins aux animaux de CAMH d’avoir soutenu ce travail, ainsi que les soignants d’animaux de CAMH qui ont fourni des commentaires détaillés sur l’utilité de la procédure, motivant l’exécution des expériences décrites et la soumission du protocole détaillé pour d’autres utilisateurs. Ce travail a été financé en partie par le Défi BreakThrough de CAMH, décerné à TP, et par des fonds internes de CAMH.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel.	BD	2546-CABD305145	Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk	BD	367841	EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding	Bed-O-Cobs	BEDO1/4	Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424 R	For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit	Arbor Assays	K003-H1W
Digital Camera	Panasonic	HC-V770	Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze	Home Made	n/a	Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol	Medstore House Brand	39753-P016-EA95	Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15	Noldus	n/a	Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Memory Card	Kingstone Technology	SDA3/64GB	For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber	Home Made	n/a	Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes	Home Made	n/a	13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding	Purina	n/a	Standard Bedding
Spectrophotometer	Biotek	Epoch Microplate Reader