Summary
本論文では、不安のような行動を軽減してルーチン処理を容易にする3Dハンドリング技術であるマウスの取り扱い技術について述べ、既存の2つの関連技術(トンネルおよびテールハンドリング)の詳細を提示する。
Abstract
実験動物は、科学者や動物のケア提供者によって複数の操作を受けます。このストレスは、動物の幸福に深い影響を与えることができ、また、不安対策などの実験変数の交核要因となり得る。長年にわたり、取り扱い関連のストレスを最小限に抑える取り扱い技術は、ラットに特に焦点を当てて開発され、マウスにはほとんど注意を払っていません。しかし、マウスはハンドリング技術を用いて操作に慣れることができることを示している。マウスの取り扱いを習慣化することで、ストレスを軽減し、日常的な取り扱いを容易にし、動物の幸福度を向上させ、データの変動性を低下させ、実験信頼性を向上させます。取り扱いの有益な効果にもかかわらず、特にストレスの多いテールピックアップアプローチは依然として広く使用されています。本論文では、人間の相互作用中に動物が経験するストレスを最小限に抑えることを目的として、新たに開発されたマウス処理技術の詳細な説明とデモンストレーションを提供する。この手動技術は3日間(3Dハンドリング技術)にわたって行われ、実験者に慣れる動物の能力に焦点を当てています。本研究は、(ポリカーボネートトンネルを用いた)トンネル処理技術とテールピックアップ技術の効果も示している。具体的に研究されているのは、行動検査(上昇プラス迷路およびノベルティ抑制給餌)、実験者との自発的相互作用および生理学的測定(コルチコステロンレベル)を用いた、不安様行動への影響である。3Dハンドリング技術とトンネル処理技術は、不安のような型を減少させた。最初の実験では、生後6ヶ月の雄マウスを用いて、3Dハンドリング技術は実験者の相互作用を有意に改善した。2番目の実験では、生後2.5ヶ月の女性を用いて、コルチコステロンレベルを低下させた。そのため、3D 処理は、実験者との対話が必要または好ましい場合や、実験中にトンネル処理ができない場合に役立ちます。
Introduction
マウスおよびラットは、内分泌、生理学的、薬理学的または行動学的研究2を含む複数の目的のための前臨床試験1、2に不可欠な資産である。動物を含む研究の増加から、人間の相互作用を含む制御されていない環境変数が生物医学研究3、4、5における様々な成果に影響を与えることが生じた。これは、実験や研究所4、5で観察される大きな変動性を担い、動物研究において大きな注意点を示しています。
環境ストレッサーの影響を抑え、人間との相互作用に対する反応性を低減することを目的として、さまざまなアプローチが実施されています。例えば、環境ストレスの影響を抑えるために、住宅条件や自動住宅システム6、7の標準化が実験室全体で実施されています。人間との相互作用に関しては、動物の扱いや運搬に一般的に使用されるアプローチは、動物の不快感やストレスをほとんど考慮していなかった。例えば、尾で動物を拾うか、鉗子8を使用すると、ベースライン不安9、10、11が増加し、探査9、12を減少させ、研究13、14の中および全体の個人間変動に大きく寄与する。その結果、マウスやラットに適用可能なカップハンドリング技術など、他のアプローチが開発された。このアプローチでは、動物はケージから「カップ」され、実験者が手でカップ9、10、11を形成します。尾の取り扱いに対するもう一つの有用な代替手段は、マウス9、10、15を移すポリカーボネートトンネルの使用を含む。この方法により、マウスと実験者の直接的な相互作用が排除されます。カップとトンネルの両方のアプローチは、不安のような行動を減らす効果を示し、尾のピックアップ/テールハンドリング9、10などの回避的な取り扱い技術によって誇張することができる実験者の恐怖を軽減する。
したがって、証拠の増加は、個人9,11,及び動物福祉の改善に対する適切なマウス処理の有用性を示す。ただし、上記の手法は依然として制限に直面しています。カップハンドリング技術は、10日間(2週間10回のセッション)から15週間17までのスケジュールで実施されており、これは施設スタッフと実験者にとってかなりの時間です。さらに、カップハンドリングの有効性は、ひずみ9およびオープンハンドでの従来のカップ処理によって異なり、ナイーブマウスまたは特にびくびくした株が手9,18からジャンプすることにつながる可能性がある。トンネル処理の結果、より一貫性が高く、一般的に迅速に19が得られます。トンネルはホームケージの濃縮としても使用されます。彼らは動物が迅速に取り扱うことを習慣化し、豊かさの付加的な利点を提供するのを助ける。しかし、トンネル処理には、装置間で動物を移送する際に制限があります。興味深いことに、ハーストとウェスト9、ヘンダーソンら20は、穏やかで短い手動処理を使用してトンネルから装置に動物を移しても、その表現型に影響を与えないことを実証した。
既存の方法に代わるものを提供し、短期間での慣用化を短期間で行うため、カップハンドリング技術を拡張する新しい技術を紹介し、特に設備を必要としない。このアプローチでは、マイルストーンを使用して、マウスがハンドリングプロセスで持っている快適さのレベルを測定します。これは、マウスの反応性とストレスの低下(行動およびホルモンレベル)での有効性を示し、日常的な取り扱いを促進し、動物間の変動を減らすことに寄与する。この技術の詳細は、ここで提供され、不安様行動の低減、実験者との相互作用の改善、末梢ストレスホルモン(コルチコステロン)放出の制限におけるその有効性は、トンネル処理(陽性対照)および尾処理技術(陰性対照)と比較して、2つの別々の研究(雄マウスと女性マウス)で実証されている。
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Protocol
動物の被験者に関する手続きは、CAMH動物ケア委員会によって承認され、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って実施されました。
注:本明細書に記載の取り扱い方法は、非トランスジェニック(C57/BL6、BalbC、CD1、SV129など)およびトランスジェニックラインを含む様々なマウス株で使用することができる。また、若いまたは古いマウスと一緒に使用することができ、特に1日目には、若年成人(生後4〜6週齢)のマウスが成人または古いマウスよりもわずかに活発である傾向があることを示す。
1. 実験準備
- 開始を研究する前に、ARRIVEガイドライン21に従って、各ハンドリンググループ(3Dハンドリング、トンネルハンドリングまたはテールハンドリング)にマウスをランダムに割り当てます。
- 取り扱いを実行する部屋を特定します。それは、住宅室、または別の部屋で行うことができます。取り扱いが移動カート上で移動する必要がある別の部屋で処理を行う場合、扱いプロトコルの開始前に20〜30分間、動物が新しい部屋に慣れることができるようにします。
- グループ収容動物の場合は、最初のホームケージでマウスをすべて再グループ化する前に、取り扱い後に一時的なケージを使用してマウスを収容します。これは、取り扱い前に動物間の潜在的な戦いを減らします (特に男性で).
- カウンター(好ましくはクリアされたカウンタートップ)またはバイオセーフティキャビネットで、ハウジングケージを取り扱う動物から離れて作業します。ハウジングケージに近い場合は、ジャンプのリスクが高まります。動物がグループ収容されている場合、マウスが操作されているマウスをホームケージに飛び込むと、ケージメイトにストレスを与える可能性があります。
注:バイオセーフティキャビネットで作業すると、マウスが床に飛び乗るリスクが制限され、特定の施設で必要になる可能性があります。この技術は、バイオセーフティキャビネットで使用することができ、常にバイオセーフティキャビネット内のすべてのステップを実行し、ハンドラーの前腕の上を歩くマウスを避けます。
2. 1日目:マウス1個あたり5分
- ケージを静かに開けて蓋を側面に置き、ネスティング材料や、ランニングホイールやシェルターなどの濃縮物を取り除きます。
- 手袋をはめた開いた手をホームケージに導入し、ゆっくりとケージの壁の片側(ハンドラに最も近い壁、 図1A)に沿って手を置きます。
- マウスをすぐに拾おうとしないでください。
- 不動のままで、動物が約30のケージの中に手の存在に慣れることができるようにします。
- 手のひらでマウスを拾おうとします(すなわち、その尾で動物を拾うのを避けてください)。
- 3回試みた後にマウスが手に入らない場合は、マウスを両手で隅に導き、両手でカップを取ります。
- カップの手をマウスに向かってそっと動かして拾おうとします。
- 両手で最大3回試行した後に失敗した場合は、尾の付け根でマウスをそっと拾い、前腕または平らな手に移します。
- マウスを手にして、手を平らにして、できるだけ開いてください。
注: これはマウスが踏み込む平らなプラットフォームを提供し、咬傷のリスクを制限します。 - 手を開けて平らにして手のひらを上にして、もう一方の手をマウスを持つ手に隣接して置き、マウスを手から手へ自由に動かしながら、手から手へ自由に動かします(図1B)。
- マウスを探索し、1分間手の間を移動してみましょう。
- この時点でマウスは飛び降りようとするかもしれません。マウスがジャンプした場合、それは床ではなくカウンターの上に着陸するように手を配置します。
- マウスがジャンプの準備をしているように見える場合(手の端に向かって移動し、後ろ足で飼育する)、ゆっくりとその前にもう一方の手を置き、この手の上を歩くように導こうとします。ジャンプのリスクが高まるので、突然の動きを避けてください。
- マウスがジャンプする場合は、テールハンドリングを避けてマウスを拾い、処理セッションを再開します。マウスが床や手の外に10以上離れている場合は、マウスが手から出ていたときはいつでも補うために、ハンドリングセッションに時間を追加します。
- ジャンプのノートを取ります。ジャンプの合計数は、動物間の潜在的な変動性を評価するために使用することができます。
- 平らな手でハンドリングを1分後、手のひらを緩め、手の中でマウスを少しカップに入れて、マウスを手の間でそっと転がす前に(図1C)。
- 「ロール」するには、マウスを手のひら、平らな手、指に垂直に置きます。
- 手をゆっくりと閉じ、指をマウスの背面に置きます。
- マウスを保持している手の下にフリーハンドを置きます。
- マウスでゆっくりと手を回したり回転させたりして、マウスをもう一方の手にそっと移動させます(180°フリップ)。
- このやり返しを手の間で繰り返します。
- 手の間の穏やかなローリングと60 sのためのオープンハンドでの自由な探検から、約20 sの技術の間で交互に。
- 「シェルターテスト」(図1D)を実施します。
- マウスを手の端に移動させ、2つの手を一緒に持って行きます。
- 非常にゆっくりと、マウスが手で形成された「避難所」の中に収まるようにカップします。マウスが必要に応じてエスケープできるように、開口部を残します。
- 拘束することなく、5-10 sの避難所にマウスを保つことを目指してください。
- 避難所のテストの間で交互に、手の間を転がり、別の60 sのための開いた手の自由な探査は、避難所のステップ3以上を実行することを確認する。
- 2.10 で説明されているすべての手順では、プロセスを急いでしないでください。マウスがストレスを感じている場合(すなわち、脱出する暫定的な、手からジャンプする、手との接触を避けるなど)、手の間を転がり、20sの自由な探検を続け、それから再試行してください。
- マイルストーン: 1 日目の完了に向けて、10 s のシェルター テストに成功した 1 回以上実行します。
- マウスが手に留まったときに、避難所のテストが成功したことを考えてみましょう。マウスが頭を飛び出して避難所に戻った場合、それはまだ成功したテストです。動物が完全に避難所から出た場合、それは失敗です。
- 30 sのための手で自由な探検を許可します。
- ケージ内のマウスをそっと取り替えます。グループが収容されている場合は、すべてのケージ合致が処理されるまで、マウスを一時的なケージに入れます。手のひらでマウスを拾って、マウスを元のケージに戻します。テールピックアップは使用しないでください。
- 70%エタノールで潜在的な便と尿のベンチトップをきれいにしてください。
- 手袋を70%エタノール(または適切な洗浄液)で十分に洗い流すか、次のマウスを取り扱う前に手袋を交換します(ケージの合体のために同じ手袋を保つことが可能です)。
メモ:ハンドラからの疲労を避けるために、適切な数の動物で処理を行うことをお勧めします。24匹のマウスの取り扱いは約2時間かかり、ハンドラあたり24匹を超えないようにすることをお勧めします。さらに多くの動物を扱う必要がある場合は、複数のハンドラを持つか、処理手順を複数日にわたってサブグループに分割することをお勧めします。
3. 2日目:マウス1個につき3~5分
- 手のひらでマウスを拾おうとします。この段階では、それはすでに実現可能であり、マウスは手から飛び出すべきではありません。
- 1日目のように手のひらを開いて開始し、マウスが20sのために自由に探索できるようにします。
- その後、マウスを手の間に数回(4-5回)巻きます。
- 5 sの「シェルターテスト」を行います。
- 2~3分の間に、避難所のテストを数回(〜5~6)繰り返します。
- 同じ2〜3分の期間中に、慣れ慣れを改善するために、1日目から手の間のロールとオープンハンドステップの自由な探査と交互に。
- マウスの頭と背中(図1E)を5~6回タッチします。習慣の兆候は、マウスが脱出しようとせずに触れることができる場合です。
- 「鼻突き」を実行する:マウスの鼻を2〜3回タッチしてみてください(図1F)。
- マウスが噛み付こうとしたり、触れられた時に明らかなストレスの兆候を示したりする場合は、すぐに鼻を突っ込んではいけません。代わりに、平らな手の探査とロールと交互に。「習慣」は、人間と接触した場合に逃げたり頭を回したりしない動物によって反映されます。
- 3.4-3.6 で説明されているすべての手順では、プロセスを急いでしないでください。マウスが手の中に閉じ込められていることによって強調されているように見える場合、または触られたくない場合は、20〜30 sの手の間で転がり続けてから再試行してください。
- マイルストーン: 2 日目の完了に 2-3 s のノーズポークを 1 回以上実行します。
- 動物が「避難所」、「頭ふれあい」、「鼻突き」にうまく反応し、マウスがストレスの兆候なしに手を探索する意思があるように見える場合は、約3分後に取り扱いを停止します。
- マウスがストレスの徴候を示し続けるか、「シェルターテスト」または「鼻突き」テストにうまく反応していない場合は、1日目のように5分に達するまでセッションを続けます。
- ケージの中でマウスを交換し、1日目のようにベンチトップと手袋を清掃します。
4. 3日目:マウス1個につき約3分
- 3日目は、2日目と同じステップを2~3分間進めます。
- 手のひらでマウスを拾います。
- マウスを手の間で移動して転がす
- 避難所のテストを実行します。
- 背中と頭にマウスをペットしてみてください。
- これらのステップを約1〜2分で交互に行います。
- マウスが逃げようとせずに手のひらに座るのに十分なほどリラックスするまで手順を続けます。
- 3日目の終わりまでに、居住のテストとして避難所のテストと鼻の突きテストを繰り返します。
- 両方のテストを最初の試行で完了できる場合は、慣れプロセスが完了します。マウスを30sから1分間軽く取り扱い続けます。
- マウスが最初にいずれかのテストに耐性がある場合は、ノーズポークとシェルターテストを再試行する前に、20〜30 sのステップ4.1-4.3を繰り返します。
- マウスが3分後にこれらの試験に耐性を保つ場合、3日目を繰り返してもよい。
- マイルストーン:10 sの少なくとも2つの成功したシェルターテストを実行し、3日目の完了と3D処理手順全体の完了のための2つの成功した鼻の突きテストを行います。
- マウスをケージに戻し、ベンチトップと手袋を清掃します。
5. 注射またはギャバジの拘束を受ける動物のためのオプションのアプローチ
注:3日目に、実験目的(口腔ギャージ、腹腔内注射など)のために動物が拘束される場合、マウスは首ピンチテストを受けることができます。
- 親指と人差し指の間で首のうなじをつかむ(図1G)。
- マウスを手の上に3~5cm持ち上げて2~3sにします。
注:これは通常、成体マウスにとって非自然な位置であり、マウスが不動の近くに残っている場合、彼らは取り扱いに慣れているし、実験目的のために拘束することが容易になります。 - マウスを平らな手に戻すか、マウスが首のピンチに反応する場合は、実験者の袖、ケージの蓋またはカウンタートップに置くことを検討してください
注:バイオセーフティキャビネットで作業している場合は、袖の上にマウスを置かないか、歩いてバイオセーフティキャビネットを出る可能性があります。バイオセーフティキャビネット内のカウンタートップにマウスを置くことを好みます。 - マウスを離して実験者の手を1分間自由に探索します。
6. 追加の処理日数のオプションアプローチ
- ストレスの多いマウスラインの結果として、2/3日目に説明した方法を使用して、動物の反応性とストレスレベルを低下させる日数を追加します。
注:多くの要因は、株、トランスジェニック修飾の存在、年齢、性別および住宅条件を含む動物のベースラインストレスに影響を与える可能性があります。これらの要因が、若いコントロールに対してテストされる老化動物や遺伝子導入動物が野生型コントロールに対してテストされるなどのグループ間で一貫していない場合は、各グループに同じ日数の習慣化を使用することをお勧めします。
7. トンネル処理
注: この方法は、トンネル処理マウスにのみ適用されます。トンネルは、長さ約13cm、直径5cmのポリカーボネートチューブです。
- トンネルをマウスのケージに入れます。
- 取り扱いの前に7日間ケージにトンネルを残します。
- ケージを開け、蓋を側面に置きます。
- マウスをポリカーボネートトンネル(ケージ内)にそっと導きます。
- トンネルをケージから水平に持ち上げます。必要に応じて、動物がトンネルから飛び降りたり落ちたりするのを防ぐためにトンネルの端をゆるやかに覆い、ケージや床に落ちる可能性があります。
- 家のケージから離れてトンネル内の動物を移動し、30 sの任意の表面から離れて保持します。
- トンネルをホームケージに戻し、マウスがチューブから出るようにします。
- 60 s を待ってから、ステップ 7.4 ~ 7.7 を 1 回繰り返します。
- 手袋を70%エタノールで十分に洗い換えたり、次のマウスを習慣化する前に手袋を交換してください。
- この手順を 10 日連続で繰り返します。
8. テールハンドリング
注: この方法は、Tail 処理マウスにのみ適用できます。これは、マウスをケージから装置に移すために使用され、その逆もまた同様である。
- ケージを開け、蓋を側面に置きます。
- 親指と人差し指の間の尻尾の付け根でマウスをつかみます。
- ケージからマウスを持ち上げます。
- 2-3 sでは、マウスがぶら下がらないように、尾部のグリップを維持しながら、実験者の反対側の前腕にマウスを移します。
- この実験の実施で尾の取り扱いが必要な場合(例えば、コルチゾール検査のために血液が引き出される前に)動物は尾の取り扱いによって実験者の前腕に移され、ケージに戻される前に15分間保持される。
9. 高架プラス迷路
- 部屋の設定
- 部屋の真ん中に、メモリカードを搭載したデジタルカメラの下に迷路を置きます。
- 迷路の後ろに置かれた2つの立っているランプを使用して、〜60ルクスで部屋の光を設定します。
- 反射を作成し、迷路内の動物の検出を妨害する迷路に直接光を避けるために、任意のオーバーヘッド照明をオフにします。
- すべての機器が設定されたら、動物を部屋に移し、光の設定と新しい環境に30分間順応させます。
- テスティング
- 70%エタノールで迷路を洗浄し、ほこりや以前にテストした動物の臭いを防ぎます。
- カメラを起動します。
- 動物を迷路に入れる前に、動物IDを持つ紙を使用して、ビデオにIDを記録します(これは、各ビデオで撮影されているマウスの適切な識別を容易にします)。
- 迷路に移す各動物に適切な取り扱い技術を使用します。
- 開いた腕に向けて中央のプラットフォームにマウスを置きます。
- マウスが10分間、邪魔されずに装置を探索できるようにします。
- 10分後、カメラを停止します。
- 迷路からマウスを取り出し、ケージに戻します。
- 70%エタノールで迷路からきれいな便と尿。
- すべてのマウスでテストが完了したら、ビデオをメモリカードからコンピュータに転送してビデオ追跡を行います。
- 自動動物追跡ソフトウェアを使用して、開いた腕と閉じた腕へのエントリー数、および開いた腕または閉じた腕に費やされた時間を追跡します(ここではEthovision XT 14)。
10. 実験者の相互作用 (ハーストと西9から派生)
- 部屋の設定
- メモリカードを搭載したデジタルカメラの下のテストルームの中央にテーブルを置きます。
- 天井に面した部屋の隅に配置された4電球で50-70ルクスでライトを設定します。反射を作成し、アリーナでの動物の検出を中断迷路に直接光を避けるために、頭上の照明をオフにします。
- 動物を部屋に連れて行け。
- 彼らは30分間部屋に順応してみましょう。
- 実験
- ホームケージをデジタルカメラの下に置きます。
- 蓋を取り外します。
- 動物の追跡を妨げる可能性のある入れ子材料やその他の濃縮を削除します。
- カメラを起動します。
- 動物IDとケージカードを使用して、ビデオ上の動物を識別します。
- 右側の右側にあるケージの壁に沿って、ホームケージに手を置きます。
- ハンドラーのヘッドがマウスを撮影するためにカメラをブロックしていないことを確認します。
- タイマーを開始します。
- 手を2分間動かさないようにし、マウスが手を探し出さないようにします。
- 15 sのケージから手を取り外します。
- カップの手を使用してマウスをピックアップし、マウスが逃げるかどうかを記録しようとします。
- 最後のステップを 5 回、5 秒ごとに、またはマウスが自身を拾い上げることができるまで繰り返します。
- マウスのピックアップに必要な試行回数を記録します。
- ケージに入れ子の材料と濃縮を返します。
- 次の動物に進む前に、70%エタノールで手袋を清掃するか、手袋を交換してください。
- テスト後、ビデオをメモリカードからコンピュータに転送します。
- 自動ビデオトラッキングソフトウェアを使用して、ケージを4つの同じ象限に分割し、各象限(ここでは、Ethovision XT 14)でマウスが費やした時間を記録します。
11. 新規性抑制供給
- 食糧不足
- 試験の3日前に、完全なケージ交換を行い、動物をシングルハウス(単一のハウジングは、ホームケージ試験を行うことが好ましい)。
注:新鮮な寝具を提供すると、最後のケージの変更以来、寝具に蓄積される潜在的なほこりや食べ物の小片を取り除きます。 - テストの前日は、午後6時頃にすべての動物の重量を量ります。
- 食物ホッパーからすべての食物を取り出し、ケージや寝具に食べ物がないことを確認します。
- 試験の3日前に、完全なケージ交換を行い、動物をシングルハウス(単一のハウジングは、ホームケージ試験を行うことが好ましい)。
- 部屋の設定
- NSFチャンバーをテーブルの上に置きます。
- トウモロコシの寝具の薄い層(または動物のホームケージで使用される寝具とは異なる他の寝具)でチャンバーを埋めます。
- チャンバーが立っているテーブルの隅に4つの電球を置き、天井に向けて70ルクスでライトを設定します。低い部屋の照明を維持するために、オーバーヘッドライトをオフにします。
- 施設で使用される標準的なチャウのペレットを、実験者に面したチャンバーの側(壁から10cm≈)に置きます。
- テスティング
- 食糧欠乏の翌朝、動物を試験の30分前に部屋に連れて行き、光の設定と新しい環境に順応させます。
- 前日に測定された体重に基づいて体重減少を測定するために、すべての動物の体重を量る。動物は、タスクを適切に実行できるように一晩で8〜12%を失う必要があります。
- 体重減少ごとに動物をソートし、最も体重を減らしたマウスに最も失ったマウスから始めてそれらをスクリーニングします。
- チャンバーが寝具と単一のペレットで満たされていることを確認します。
- 動物をチャンバーの反対側に置き、食品ペレットから離します。
- タイマーをすぐに開始します。
- マウスは、最大12分間チャンバーを探索してみましょう。
- 食物ペレットに近づき、餌を与える待ち時間(動物は噛んで食べる必要があります)を測定します。
- 動物がペレットの近くに来て、それを嗅ぎ、噛まないときにアプローチであると考えてください。
- 動物がペレットを消費し始めるときのように一口を定義します。
- 数秒でペレットにアプローチし、餌を与える待機時間を記録します。
- マウスが食品ペレットに供給されたら、チャンバーからマウスを取り出します。
- 寝具を捨てるが、マウスホームケージで食欲ドライブをテストするために使用されるペレットを保存します。
- 次の動物のためにチャンバーをリセットし、次の動物に進みます。
- チャンバー内の試験終了後15分、試験中に使用したペレットを、マウスのホームケージ内に、ケージの前面の壁に当てはめます。
- ペレットがホームケージに入っているときにペレットを供給するレイテンシを測定します。これは食欲のドライブのための尺度です。
- 巣の材料を取り除き、そのケージに落とされるペレットをマウスが見るようにすることが好ましい。
12. 血清採取およびコルチコステロン測定
- 採血の15分前に割り当てられた技術を使用して1分間動物を扱う(これは、マウスを再グループ化するときの戦いのリスクを念頭に置いて、グループ収容動物または単一の収容動物で行うことができる)。
- トンネルで取り扱ったマウスの場合は、マウスをトンネルに案内し、トンネルをケージから1分間持ち上げ、ケージ内のマウスを交換します。
- 尾の処理マウスの場合は、マウスの尾部のベースをつかみ、そのケージからマウスを取り外します。マウスを実験者の袖に1分間移動し、マウスを尾部処理でケージに戻します。
- 3D 処理マウスの場合は、カップを使用してケージからマウスを取り外します。カップに入ったマウスを1分間手に持ち、ケージに戻します。
- 取り扱い後15分、顎下静脈22から採血を進める。
- マウスの頭部がしっかり固定化される様に、マウスをしっかりと擦り切る。
- 穿刺の部位を見つけます。
- 穿刺部位を見つけるためのランドマークとして使用できる顔の下顎に沿って小さな無毛のディンプルがあります。顎の基部とこのディンプルの間に線を引く穿刺部位は、顎のヒンジのすぐ後ろにある約5mmで耳に向かってこのディンプルの後ろにあります。
- 穿刺部位に垂直にきれいな23 Gの針を保持し、速いしっかりした傾斜運動を使用する。針の先端は1〜2mmの深さまで浸透する必要があり、静脈が穿刺されるとすぐに血液が流れます。
- EDTA被覆の集金管に約150μLの血液を採取し、氷の上に保管してください。
- 滅菌ガーゼパッドでわずかな圧力を穿刺部位に5s以上塗布し、血液を凝固させます。
- 血液が凝固したら、マウスを自宅のケージに戻します。
- 遠心分離機血液を4°C3,500 x gで10分間用いた。
- 上清をデカントします。
- 下流解析のために上清を-20 °Cで保管してください。
- メーカーのプロトコルに従ってコルチコステロンELISAキットを使用してコルチコステロンレベルを測定します。
- 分光光度計を使用してELISAの結果を読み取ります。
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Representative Results
2つの別々の研究をC57BL/6マウスで行った。研究#1には生後6ヶ月の男性が含まれており、研究#2にはジャクソン研究所(猫#000664)の生後2.5ヶ月の女性(N=36/研究)が含まれていました。マウスは2ヶ月の年齢で施設に到着しました。研究#2女性は到着の2週間後に処理され、テストされましたが、研究#1男性は6ヶ月(世界的なパンデミックシャットダウンによる遅延)で処理され、テストされました。この間、試験#2のマウスが1本死亡し、実験の処理を開始した。研究は、雄のマウスが動物施設のスタッフによって世話されたことを#1しました。すべてのマウスは、食料と水のアドリビタムへのアクセスを与えられた12時間の明暗サイクル(7:00 ON、19:00 OFF)で維持されました。彼らのホームケージは、寝具材料としてリサイクルされた新聞だけでなく、ネスティング材料で満たされていました。マウスは、取り扱いセッション中または採血または行動検査などの処置後にグループ収容の雄の潜在的な苦痛行動を制限するために、個別に収容された。マウスは、尾の取り扱い、トンネル処理、3Dハンドリングの3つのグループに無作為化され、それぞれのグループの設計に従ってオープンルームで処理された(図2)。トンネル処理グループは、セッションの処理前に 1 週間のエンリッチメントとしてトンネルを受信しました。その後、行動テストの前に、10日間連続して処理されました。異なる処理セッションが完了してから1週間が経過した後、行動テストが開始されました。16日目に、マウスをEPMで試験し、次いで実験者相互作用試験で試験した。2日後、マウスをNSFで試験した。最後に、24日目に、最初の取り扱いと同じタイプの1分間の取り扱いセッションの後、15分間血液を引き出した。
行動検査のために、トンネル処理動物は可能な限りトンネルを使用してケージから装置に移された。しかし、上昇プラス迷路実験では、迷路の寸法は、トンネルを使用して迷路に動物を除去または配置することが困難でした。この場合、動物はトンネルからカップに移され、迷路に運ばれました。3D処理マウスは3日間にわたって処理され、トンネル処理の8~10日目と同時に処理された(図2)。尾の取り扱いマウスは取り扱いに慣れず、実験者との相互作用中に尾を処理した。研究の間、ケージの変更は、各群に使用される適切な取り扱い技術の使用を確実にするために実験者によって行われた。
実験者の相互作用試験では、動物が実験者と自主的に相互作用する意欲と実験コンテキストでの取り扱いの容易さについて試験した(図3)。ケージからマウスを拾おうとする試みの回数に対して行われたANOVAは、研究#1男性(F(2,31)=6.36、p=0.004)および研究#2女性(F(2,33)、p=0.0001)における取り扱いアプローチの有意な効果を示した。シェフのポストホック分析は、マウスを拾うために必要な試みの数が3D(研究#1のp=0.0061、研究#2女性のp=0.0002)とトンネル処理(研究 #1#2女性ではp=0.003)とトンネル処理の両方によって有意に減少したことを明らかにした#2ANOVAは、手と同じ象限で過ごした時間に行われ、研究#1男性(F(2,31)=5.38、p=0.009)および研究#2女性(F(2,33)=3.5、p=0.04;と同じ作業での取り扱いの有意な効果を示した。図 3B)。シェフのポストホック分析は、3Dハンドリング技術で扱われた研究#1雄マウスが、尾処理マウス(p=0.012)と比較して、実験者の手よりも同じ象限で有意に多くの時間を費やしたことを示した。研究#2の取り扱いグループ間に有意な違いはありませんでした, 2.5 ヶ月の女性.実験者との相互作用の程度は、マウスの中心点の結合されたヒートマップによってさらに実証される(図3C-E)。これらは、スタディ#1の3D処理された雄マウスが手の近くの領域を含む手に近い時間を費やした一方で、尾処理マウスが手との全体的な相互作用が最も少なかったことを示しています。
3Dおよびトンネル処理の効果は、不安様行動の2つのテスト、新規性抑制された摂食(NSF)テストおよび上昇プラス迷路(EPM)における尾処理と比較された。NSF試験では、アプローチまでの待ち時間に対して実行されたANOVAは、研究#1男性(F(2,31)=3.5、p=0.04)で使用される処理技術の効果を示した。研究#1研究におけるScheffeのポストホック分析は、3D処理マウス(p=0.08)とトンネル処理マウス(p=0.08)からの傾向を示し、尾処理マウスと比較してアプローチまでの待ち時間が短縮された(図4A)。研究#2では効果は認められなかった。マウスホームケージ(図示しないデータ)で接近する待ち時間に対して行われたANOVAは、取り扱い効果を示さなかった(研究#1男性ではp=0.88、研究#2女性ではp=0.16)。EPMでのオープンアームでの時間のパーセントで行われたANOVAは、研究#2女性(F(2,33)=3.5、p=0.04)での取扱いの有意な効果を明らかにした。研究では、研究#1男性(F(2,31)=2.1, p=0.1;図4B)。シェフのポストホック分析は、テール処理マウス(p=0.07)と比較して、研究#2のマウスを扱ったトンネル内の両手を広げて過ごす時間の増加傾向を明らかにしたに過ぎない。オープンアーム(図4C)のエントリの割合に関しては、ANOVAは、研究#1男性でも研究#2女性(F(2,31)=1.12、p=0.33;およびF(2,33)=1.3、p=0.26で、取り扱いの効果は明らかにしなかった。行動スコアは、Guillouxら23のようにzスコアで要約され、尾処理マウスと比較して不安様行動の潜在的な減少を知らせる(図4D)。Zスコアに関するANOVAは、研究#1男性(F(2,31)=5.6、p=0.008)では取り扱いの有意な効果を示したが、研究#2女性(F(2,33)=1.07、p=0.35)には有意な効果を示さなかった。Scheffeのポストホック分析は、3Dハンドリングとトンネル処理が尾部処理と比較してzスコア(それぞれp=0.04と0.01)を有意に減少させることを示し、両方のアプローチが研究#1男性の不安のような行動を減少させることを示唆した。
取り扱い後コルチコステロンレベルも、簡単な取り扱いセッションの15分後に評価した(図5)。ANOVAは、研究#2女性(F(2,33)=4.44、p=0.01)では取り扱いの有意な効果を発見したが、研究#1男性(F(1,31)=0.53、p=0.59)では見つからなかった。雌#2研究では、ポストホック分析は、尾の取り扱い群(p=0.02)と比較して、3Dハンドリング群からのマウスのコルチコステロンレベルの有意な減少を明らかにした。
処理手法が得られたデータの変動性に大きな影響を与えたかどうかを判断するために、バートレットの分散の均質性検定を適用しました。我々の結果は、測定全体で雌マウス#2研究で変動性に有意な差を見なかった(% 時間EPM B(2,33)=4.95、p=0.087;% エントリEPMB(2,33)=3.68、p=0.16;NSF B(2, 33)=0.20, p=0.91;コルト B(2, 33)=1.69, p=0.42.しかし、研究#1雄マウスでは、NSF試験(B(2,31)=8.08において有意な不均一性の分散があった。 p=0.0175)および測定されたCORTレベル(B(2,32)=11.63、p=0.0029)では、EPM(%時間EPMB(2,32)=1.16、p=0.56;%エントリEPMB(2,32)=2.79、p=0.25)のいずれにも含まれていません。F検定を用いて2つの分散を比較すると、NSF検定の分散は、3D(F(F)=4.22、p=0.04)とトンネル処理技術(F(1,22)=4.01;p=0.03の両方によって研究#1の男性に対して有意に減少したことを示した。取り扱い後のCORTの濃度については、3D処理のみで、テールハンドリングと比較して変動性が大幅に減少しました(F(1,20)=9.65、p=0.0019)。
図 1.3D処理手順の代表的な画像。 画像は 3D 処理手順を示しています。 A) ケージの中の手:実験者の手はケージに入れられ、じっとしていられ、マウスがケージの中に手が存在するように習慣化することができます。 B) 平らな手:ケージから最初に取り外すと、マウスは手の平らな手のひらの上に置かれます。マウスは手のひらの周りを自由に歩き回り、隣接する平らな手の間を移動することができます。 C) ロール:手のひらをリラックスして、マウスの周りに緩い「カップ」を形成します。カップを反対側の手にそっと傾けると、マウスは他の手にそっと導かなければ、この手に自由に移動する必要があります。 D)シェルター:手の端にマウスを置き、両手を一緒に持って、マウスの周りに非常にゆっくりとカップを形成します。マウスを拘束して、マウスが逃げないように開口部を残す必要があります。~5~10sを保持し、平らな手に開きます。 E) 頭/背中のふれあい:マウスが手のひらの平らな手のひらを探索している間、そっと頭と背中にマウスをペット。これは、上から実験者のアプローチにマウスを習慣化します。 F) 鼻の突き:マウスが取り扱いに慣れているように見えるときは、鼻の上でマウスを直接軽く触らせようとします。マウスが頭を離さない場合は、取り扱いに慣れています。 G) 最後の日に短い(2-3 s)首ピンチを行い、競合を必要とする将来の介入の際に動物の居住を測定することが可能である。取り扱いに慣れている場合、マウスは首のピンチ中に不動のままであり、非習慣化されたマウスは、競合から解放するために尾を回転させることによって脱出しようとします。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.実験デザイン 施設に到着した後、尾は習慣を受け取らない取り扱いマウス。トンネルで処理されたマウスは、取り扱い開始前の1週間、自宅のケージ内のトンネルに慣れていました。トンネル取り扱いマウスはトンネル処理技術で10日間(取り扱い初日=1日目)、3D取り扱いマウスは3日間(8-10日目)慣用されていた。次いで、マウスを上昇プラス迷路(EPM)(16日目)、実験者相互作用試験(19日目)、新規性抑制された摂食(Day 21)、およびCORT測定のための血清採取(Day 24)に続く簡単な取り扱いセッションを行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.3つの取り扱い技術が操作の容易さと実験者とのやり取りに対する意欲に与える影響。 A) ケージからマウスを取り外すために必要なピックアップ試行の平均回数。研究研究#1男性(左パネル、テールハンドリングN= 12、トンネルハンドリングN=12および3DハンドリングN=11)および研究#2メスマウス(右パネル、グループあたりN=12)、トンネルと3D処理グループの両方からマウスを取り除くために必要な試みの数が、尾処理マウスと比較して大幅に減少した。 B) 動物が実験者の手と同じケージの象限で費やした平均時間。3D技術で扱われた雄マウス#1研究は、実験者の手と同じ象限で費やされた時間の有意な増加を示した。 C-E) Ethovision XT 14でレンダリングされた時間ごとのマウス中心点の平均熱マップは、3D処理された雄マウス#1研究の実験者との探査および相互作用の増加を視覚的に実証した。エラー バーは、SEM. *p<0.05、**p<0.01 をテール処理グループと比較して示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.3つの取り扱い技術が不安のような行動に及ぼす影響。 A) 研究#1雄マウス(尾処理N=12、トンネル処理N=12および3DハンドリングN=11)および研究#2雌マウス(N=12/群)で、新規性抑制された摂食室内のペレットに近づいて餌を与える待ち時間。3Dハンドリングおよびトンネル処理群の雄マウス#1研究のデータは、ペレットに近づく待ち時間の大幅な減少に向けた傾向を示した。 B) 上昇プラス迷路の両手を広げて過ごした時間の%の手段。研究#1男性のグループ間に有意な違いはなく、トンネル処理グループの女性#2研究による両手を広げる傾向がありました。 C) 両手を広げて:研究#1男性のグループ間に有意な違いはなく、研究#2女性でもありませんでした。 D) 不安のような行動を要約したZスコア。A、B、Cで示されたデータを使用して、Zスコアを参照としてテール処理マウスを使用して計算した。Zスコアの低下は、NSFおよびEPM試験によって測定された不安様行動の減少を示唆している。3Dまたはトンネル技術を用いて取り扱う雄マウス#1研究は、テール処理マウスと比較して不安様表現型の減少を示した。エラー バーは、SEM. *p<0.05 をテール処理グループと比較することを示します。 t は、テール処理グループと比較した有意性の傾向レベル(p<0.1)を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.取り扱い後のコルチコステロンのレベル。 血清は、簡単な取り扱いセッションの15分後に収集され、その後、CORTレベルをELISAによって測定した試験#1男性(尾処理N=12、トンネル処理N=12および3DハンドリングN=11)と研究#2雌マウス(N=12/群)の両方で測定した。3Dハンドリング技術を介して取り扱われた雌マウス#2研究は、尾で処理されるマウスと比較してコルチコステロンレベルの低下を示した。研究のANOVA#1雄マウスは、群間の違い(p=0.5)の有意性に達しなかった。エラー バーは、SEM. *p<0.05 をテール処理グループと比較して示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表 1.
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Discussion
この研究と方法の開発は、マウスの取り扱い技術は依然として科学界によって見落とされており、実験前に動物のストレスや反応性を軽減するための習慣や取り扱い技術を実装することに消極的であるという観察に基づいています。時間の約束を表しながら、動物の取り扱いは、実施される実験の成功に寄与する可能性のある動物に有益な効果を提供し、データ変動性または動物の過剰反応性のために実験を複数回行わなければならないことを防ぎます。3Dハンドリング技術の使用は、マウスの脱出の試みを減少させた。また、実験者との相互作用が増加し、6ヶ月齢の雄マウスにおける不安様型の減少も起きました。さらに、3D処理は、わずか3日間の取り扱い後、生後2.5ヶ月の雌マウスにおけるデータ変動性の低下とコルチコステロンレベルの低下を示した。このアプローチは、よりスムーズな輸送と容易な介入を促進する実験者による取り扱いにマウスを習慣化するために穏やかな操作に依存しています。
3Dハンドリング技術から強調する価値のある何かは、上記および 表1で説明したマイルストーンの達成に応じて、マウスの反応性に応じて処理方法の進行が起こるということである。動物は、次のステップに進む前に、反応性を1つの処理ステップに減らすべきでした。十分に慣れていない動物の「避難所」または「鼻突き」ステップにあまりにも速く進行しようとすると、ストレスが増加し、手順の有効性を低下させる可能性があります。同様に、取り扱いの各日に動物の反応性を監視する必要があり、追加の処理日数が必要かどうかを決定する際に考慮する必要があります。動物が最初のマイルストーンを達成するための基準を満たしていない最初の日に避難所のテストにうまく反応しない場合、取り扱いの最初の日はマイルストーンが完了するまで繰り返すことができます。同様に、動物が2日目に鼻突き検査に反応しなかった場合、2日目も繰り返され得る。このアプローチで注意すべきもう一つの注意点は、特にC57BL6のようなびくびく株では、取り扱いの最初の日にマウスが飛び降りるリスクが大きいことです。上記のガイドラインに従って、ジャンプのリスクを減らし、そのような動作を制限する方法を提供する必要があります。工程を通る取り扱いおよび進行の持続時間は、特に不安な型を示すことが知られているトランスジェニックモデルで働く場合、株によって異なる場合がある。
提示された3Dハンドリング技術の有効性を低下させる要因がいくつかあります。そのような要因の1つは、実験者からの潜在的な恐怖またはためらいであり、実験者がマウスの取り扱いに精通していない場合、またはマウスを怖がっている場合である。したがって、ハンドラへの影響も考慮すべきものです。しかし、マウスとの相互作用のレベルが徐々に増加することで、初心者の実験者は、処理手順を進める際にハンドリング技術を実行する際に自信とより大きなスキルを開発することができます。提案されたステップ/マイルストーン(避難所と鼻突きテスト)は、初心者のハンドラーの潜在的な人間の変動に対抗し、動物が同様のレベルの習慣に達することを保証するのに役立ちます。動物との人間と動物の積極的な相互作用を促進することは、動物ケアスタッフ24における生活の質と思いやりの満足度の向上をもたらしたと報告されている。したがって、取り扱いからのジェントリングは、一般的な相互作用または介入の間にハンドラーと動物の両方に利点を提示します。
マウスのピックアップの試みの数を減らすことに影響を与える3Dハンドリングは、6ヶ月の男性と2.5ヶ月のメスの両方で、トンネル処理やその他の技術に代わるものを提供し、ケージから実験装置への動物の移動を容易にします。3Dハンドリング技術はまた、実験者と6ヶ月の雄マウスとの相互作用を増加させた。これは生後2.5ヶ月の雌マウスでは観察されなかったが、雌マウスは尾処理マウスと比較して拾い方が容易であった。これは、3Dハンドリング技術が、動物と実験者(後で議論される潜在的な性別/年齢の交論要因にもかかわらず)のような実験者との間の直接的な相互作用を必要とする実験に適している可能性があることを示唆している。他の人は、追加の操作なし、カップの手で動物を拾うことからなる手動ハンドリング技術を開発し、使用しています10.これらの技術は有益な効果を示したが、文献のデータはしばしば10日9、16を超える習慣期を有する処理プロトコルを提示する。さらに、3Dハンドリングによって提供される洗練された相互作用のないカップハンドリングは、手から飛び出し続けるびくびく株には適さないかもしれません。この研究ではカップ法と直接比較しませんでしたが、3Dハンドリングはこれに対処し、マウスとハンドラの相互作用を促進するために洗練された動きに依存しています。Ghosal et al.16の研究では、5日間のマッサージと組み合わせたカップハンドリング技術を使用し、この技術が代謝エンドポイントに対するストレスの影響を制限し、より良い有効性のための取り扱い中の精製された動きおよび相互作用の必要性を強調したことを示した。このカップマッサージ技術に基づいて、3Dハンドリングはマウスを習慣化するために追加の相互作用を使用します。3Dハンドリングアプローチを使用して、ハンドラーは、標準化された動きを行い、その必要性に応じて各動物に手順の持続時間を適応させることによって、すべてのマウスが同様のレベルの習慣化に達することを保証します(本研究では、すべてのマウスがマイルストーンを通過し、3D処理プロトコルを3日間で終了しました)。このアプローチは、各マウスに「パーソナライズ」と見なすことができるので、すべての動物は、取り扱いの各日に習慣の所望のレベルに達します。前述のように、動物がプロトコルに記載されているマイルストーンに達しない場合、この技術は日数を増やすことによって調整することができます。この技術は、行動研究および生理学的測定における動物間の変動性を減少させる有益な効果を示し(CORTレベル)、このアプローチが研究中の変動性の低下に寄与し、前臨床試験における偏った結果を駆動する可能性のある実験誤差の影響を低減できることを示唆した。
支持の結果は、3D-およびトンネル処理を受けたマウスが、尾処理マウスと比較して、新生抑制された摂食試験における不安を軽減することを示唆した。NSFとEPMの両方のアプローチを組み合わせたデータを考慮すると、両方のアプローチは、6ヶ月齢の雄マウスの不安を軽減する上で有意な効果を示した。これは、トンネル処理に慣れている動物が不安9、10日以上の取り扱い後のテストでパフォーマンスを向上させたことを再現し、同様の効果を示す3Dハンドリングの可能性をさらに実証する。これはまた、3D処理された6ヶ月の雄マウスが、トンネルと尾の取り扱いを受けた6ヶ月の雄マウスよりも実験者に近づき、自発的に相互作用することを示した。重要なのは、3D処理を行った生後2.5ヶ月の雌マウスは、以前に発表された結果9と一致しているCORTのレベルを低下させた。2つの研究(研究#1 6ヶ月の男性で#1、2.5ヶ月の女性の研究#2)は、取り扱いが不安のような現象(研究#1の行動結果、または研究#2のCORTレベルに有益な影響を与える)に有益な影響を与える2つの異なる方法で確認した。
効果に可能な要因は、実験者の性別であります, この場合、男性.Sorgeらら25では、男性実験者の存在は、男性のCORTの増加や、雄のマウスではなく、雌のマウスの行動のような不安を引き起こす可能性があることが示されています。これは、本研究の結果とは対照的である。この研究とSorgeらら25 の研究との大きな違いは、ここで説明するアプローチは、実験者との肯定的な(非強化された)相互作用を促進することによって、マウスの取り扱いを習慣化することにあるのに対し、Sorge et al.25 は人間と相互作用しないナイーブなげっ歯類を使用した。実験者が脅威を表していないことを知らない場合、ナイーブマウスは人間の実験者に対して強い反応を示す可能性があると期待できます。しかし、本研究は男性実験者のみで行われ、今後の研究では、このような効果が女性実験者で再現可能かどうかを調査する必要があります。これらの要因を特定することは本論文の範囲外であるが、処理習慣化を実施する場合、またはより一般的な実験設計において、このような変動の原因を特定することの重要性を強調する価値がある。
本研究はまた、マウス9、10、11における不安様行動およびCORTレベルを低減する際のトンネル処理技術の有効性を確認した。このアプローチの追加の利点は、トンネルが濃縮26としてケージに残すことができるということですが、これはストレス/不安反応の減少にも寄与し、福祉10,11の改善に寄与する可能性がある。この場合、実験者の役割は、トンネルを操作するだけで、動物ごとに1分間操作することです。しかし、Gouveiaら19によって記述されているように、トンネルは必ずしも家のケージに残る必要はありませんし、代わりに追加のストレスを引き起こすことなく、動物を移送するために必要な場合にのみ動物に提示することができます。トンネルと 3D 処理の両方のアプローチは、ラボと実験者が自分のニーズに最も適したアプローチを決定するために評価すべき利点を提供します。本研究では、トンネルがケージに残されており、不安のような行動に対して観察された影響は、トンネルの取り扱いと濃縮の組み合わせによるものと考えられる。
どちらも有益な効果を提供しますが、3D およびトンネル処理の手法は制限がありません。共通の制限は、動物施設がそのような手順を実施するのに時間がかかり、潜在的に落胆する可能性があることです。しかし、追加の利点は非常に貴重であり、ストレスを軽減し、実験者や動物ケアプロバイダー(スパンゲンベルクとケリング27に記載されている)との相互作用を改善することによって動物の福祉を改善し、研究の信頼性と再現性。私たちの施設からの証拠は、この技術が動物と夫のスタッフの間の相互作用を改善し、ケージの変化と健康監視を促進することを示唆しています。私たちの施設の他のユーザーから、競合と全体的な操作は、3D技術で処理されたマウスがピックアップされたときに逃げる可能性が低く、私たちの例では、6ヶ月の雄が実験者と対話する傾向があるという我々の発見と一致して、処理されたマウスで有意に容易であると報告されています。フォローアップ研究は、技術の有用性をさらに実証するために、そのような効果を定量化することができます。全体として、この3D処理アプローチは、トンネルアプローチと同様に、特に取り扱いに応じてストレスを最小限に抑えるために日常的な動物の相互作用を精製することによって、3Rのルールに貢献します。データの変動性の減少が観察されたことを考えると、これはまた、一貫した結果を得るために必要な動物の数を減らし、変動性を制限するために使用されるアプローチを洗練する可能性を有する。
提示されたデータに基づく議論のもう一つのポイントは、この研究が一人収容の動物で行われたということです。単一のハウジングは、潜在的な苦痛行動(特に雄マウス)を制限するので好まなかったが、それは、個人間変動性28、29に寄与し得る。グループ間の一貫性のために、すべての動物は単一の収容された。また興味深い点は、ラットにおける陽性実験者と動物の相互作用がラットくすぐられた形で、単居ラット30,31における社会的孤立の効果の一部を緩和することができた。3Dハンドリング技術やGhosal etal.11が説明するカップマッサージ技術など、動物と実験者の間の直接接触を伴う取り扱い技術も同様の効果を有する可能性がある。今後の研究では、単一およびグループ収容動物におけるハンドリング技術の効果を比較することによって、この問題を探求することができます。過去の研究では、グループで行われた環境でマウスを用いたカップおよびトンネル処理アプローチの影響を調べ、同様の結果を得た7,8.これは、ケージから1匹の動物を取り出して(特に雄マウス、または積極的なマウスラインで)置くときに苦渋の行動の可能性を念頭に置いて、単一の家またはグループハウスの状態で保たれた動物と共に本明細書に記載された取り扱いプロトコルを使用することができることを確認する。このような場合は、すべての動物をグループ化する前に一時的なケージを使用することをお勧めします。
結論として、提案された3Dハンドリングアプローチは、マウスの反応性およびストレスの低減に寄与する。また、3日間の処理後の変動性を低減することで、データの信頼性を向上させます。同様の結果は、トンネル処理の10日後にトンネル処理で観察可能です。トンネル処理技術と比較して、3Dハンドリング技術は、生後6ヶ月の雄マウスの実験者との相互作用を増やすという利点を提供しました。3Dまたはトンネル処理技術が、データ生成の大きな改善を表し、研究における動物の使用の減少に大きく貢献するすべての動物施設で実施されるならば。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、この作業を支援してくれたCAMHの動物ケア委員会と、手順の有用性に関する広範なフィードバックを提供したCAMHの動物介護者に感謝し、説明された実験の実行を動機づけ、他のユーザーのための詳細なプロトコルを提出する。この作品は、TPに授与されたCAMHブレイクスルーチャレンジとCAMHからの内部資金によって資金提供された部分でした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. | BD | 2546-CABD305145 | Needles for Blood collection |
| BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk | BD | 367841 | EDTA Coated tubes for blood collection |
| Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding | Bed-O-Cobs | BEDO1/4 | Novel bedding for novelty suppressed feeding |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5424 R | For centrifugation of blood. |
| Corticosterone ELISA Kit | Arbor Assays | K003-H1W | |
| Digital Camera | Panasonic | HC-V770 | Camera to record EPM/Experimenter interactions |
| Elevated Plus Maze | Home Made | n/a | Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor |
| Ethanol | Medstore House Brand | 39753-P016-EA95 | Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning |
| Ethovision XT 15 | Noldus | n/a | Automated animal tracking software |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Memory Card | Kingstone Technology | SDA3/64GB | For video recording and file transfer |
| Novelty Suppressed Feeding Chamber | Home Made | n/a | Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall . |
| Parlycarbonate tubes | Home Made | n/a | 13 cm in length and 5cm in diameter |
| Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding | Purina | n/a | Standard Bedding |
| Spectrophotometer | Biotek | Epoch Microplate Reader |
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