Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Методы управления для снижения стресса у мышей

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62593
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 4, 5, 1,2,3, 1,2
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

Summary

В этой статье описывается техника обработки у мышей, техника 3D-обработки, которая облегчает рутинную обработку за счет снижения тревожного поведения, и представлены подробности о двух существующих связанных методах (туннельная и хвостовая обработка).

Abstract

Лабораторные животные подвергаются многочисленным манипуляциям со стороны ученых или поставщиков услуг по уходу за животными. Стресс, который это вызывает, может оказать глубокое влияние на благополучие животных, а также может быть смешанным фактором для экспериментальных переменных, таких как меры тревоги. На протяжении многих лет были разработаны методы обработки, которые минимизируют стресс, связанный с обращением, с особым акцентом на крысах и небольшим вниманием к мышам. Тем не менее, было показано, что мыши могут привыкнуть к манипуляциям с использованием методов обработки. Привыкание мышей к обращению снижает стресс, облегчает рутинное обращение, улучшает самочувствие животных, уменьшает изменчивость данных и повышает надежность экспериментов. Несмотря на благотворное влияние обработки, подход хвостового подъема, который является особенно стрессовым, по-прежнему широко используется. В этой статье представлено подробное описание и демонстрация недавно разработанной техники обработки мышей, предназначенной для минимизации стресса, испытываемого животным во время взаимодействия с человеком. Эта ручная техника выполняется в течение 3 дней (техника 3D-обработки) и фокусируется на способности животного привыкать к экспериментатору. Это исследование также показывает влияние ранее установленных методов обработки туннелей (с использованием поликарбонатного туннеля) и метода подъема хвоста. В частности, изучаются их влияние на тревожное поведение с использованием поведенческих тестов (Elevated-Plus Maze и Novelty Suppressed Feeding), добровольного взаимодействия с экспериментаторами и физиологических измерений (уровни кортикостерона). Техника 3D-обработки и техника обработки туннелей уменьшали фенотипы, подобные тревоге. В первом эксперименте с использованием 6-месячных самцов мышей техника 3D-обработки значительно улучшила взаимодействие экспериментаторов. Во втором эксперименте, используя 2,5-месячную самку, он снижал уровень кортикостерона. Таким образом, 3D-обработка является полезным подходом в сценариях, где взаимодействие с экспериментатором требуется или предпочтительно, или где обработка туннеля может быть невозможна во время эксперимента.

Introduction

Мыши и крысы являются важными активами доклинических исследований1,2 для различных целей, включая эндокринные, физиологические, фармакологические или поведенческие исследования2. Из увеличения числа исследований с участием животных выяснилось, что неконтролируемые переменные окружающей среды, включая взаимодействие с человеком, влияют на различные результаты в биомедицинских исследованиях3,4,5. Это отвечает за значительную изменчивость, наблюдаемую в экспериментах и исследовательских лабораториях4,5,что представляет собой серьезную оговорку в исследованиях на животных.

Были реализованы различные подходы с целью ограничения воздействия экологических стрессоров и снижения реактивности к взаимодействию с человеком. Например, для ограничения воздействия экологических стрессоров в лабораториях внедрена стандартизация жилищных условий и автоматизированные жилищные системы6,7. Что касается взаимодействия с людьми, то широко используемые подходы к обращению с животными и их транспортировке мало внимания относятся к дискомфорту и стрессу животных. Например, взятие животных за хвост или использование щипцов8 увеличивает базовую тревогу9,10,11,уменьшает исследование9,12 и в значительной степени способствует межибытовой изменчивости в исследованиях13,14и между них. В результате были разработаны другие подходы, такие как техника обработки чашек, которая применима к мышам и крысам. При таком подходе животных «вытаскивают» из клетки, и экспериментаторы держат руками, образуя чашку9,10,11. Другая полезная альтернатива обработке хвоста включает в себя использование поликарбонатного туннеля для переноса мышей9,10,15. Такой подход исключает прямое взаимодействие между мышью и экспериментатором. Как чашечная, так и туннельная подходы показали эффективность в снижении тревожного поведения и страха перед экспериментатором, которые могут быть преувеличены отвратительными методами обработки, такими как подъем хвоста / обработка хвоста9,10.

Таким образом, растущее количество доказательств демонстрирует полезность правильного обращения с мышами для снижения изменчивости между особями9,11и улучшения благосостояния животных10. Однако методы, упомянутые выше, по-прежнему сталкиваются с ограничениями. Техника обработки чашек была реализована с графиками от 10 дней (10 сеансов в течение 2 недель16)до 15 недель17,что является значительным количеством времени для персонала объекта и экспериментаторов. Кроме того, эффективность работы с чашками варьируется в зависимости от штамма9, а обычное обращение с чашками в открытых руках может привести к тому, что наивные мыши или особенно прыгучие штаммы прыгают с руки9,18. Обработка туннелей приводит к более последовательным и, как правило, более быстрым результатам в19. Туннели также используются в качестве обогащения домашних клеток. Они помогают животным быстро привыкнуть к обращению и обеспечивают дополнительные преимущества обогащения. Однако обработка туннелей имеет ограничения при перевозке животных между аппаратами. Интересно, что Hurst and West9и Henderson et al.20 продемонстрировали, что использование мягкого и краткого ручного обращения для переноса животных из туннеля в аппарат не влияет на их фенотип.

Чтобы обеспечить альтернативу существующим методам с достижимым привыканием за короткий период времени, в этой статье описывается новая техника, которая расширяет технику обработки чашек, поэтому не требует какого-либо конкретного оборудования. Этот подход использует вехи для оценки уровня комфорта мышей в процессе обработки. Он показывает эффективность в снижении реактивности и стресса мышей (на поведенческом и гормональном уровнях), облегчает рутинное обращение и способствует снижению изменчивости между животными. Подробности этого метода приведены здесь, а его эффективность в снижении тревожного поведения, улучшении взаимодействия с экспериментаторами и ограничении высвобождения периферического гормона стресса (кортикостерона) продемонстрирована в двух отдельных исследованиях (самцы и самки мышей) по сравнению с туннельной обработкой (положительный контроль) и методами обращения с хвостом (отрицательный контроль).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры с участием животных были одобрены комитетом по уходу за животными CAMH и проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными.

ПРИМЕЧАНИЕ: Способ обработки, описанный в настоящем описании, может быть использован для различных штаммов мышей, включая неперегенные (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129 и т.д.) и трансгенные линии. Его также можно использовать с молодыми или старыми мышами, отмечая, что молодые взрослые (4-6 недель) мыши, как правило, немного более активны, чем взрослые или старые мыши, особенно на 1-й день.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Перед началом исследования, в соответствии с руководящими принципами ARRIVE21,случайным образом распределите мышей в каждую группу обработки (3D-Handling, Tunnel Handling или Tail Handling).
  2. Определите помещение для выполнения обработки. Она может быть выполнена как в жилом помещении, так и в отдельном помещении. Если обработка осуществляется в отдельном помещении, что требует перемещения животных на движущейся тележке, позвольте животным прижиться в новом помещении за 20-30 минут до начала протокола обработки.
  3. Для групповых животных используйте временную клетку для размещения мышей после обработки, прежде чем перегруппировать их всех в их первоначальную домашнюю клетку. Это уменьшает потенциальные драки между животными перед обращением (особенно у самцов).
  4. Работайте на прилавке (предпочтительно очищенной столешнице) или в шкафу биобезопасности, при этом клетка для корпуса находится вдали от обрабатываемого животного. Непосредственное приближение к клетке корпуса увеличивает риск прыжков. Если животные размещаются в группе, прыжок мыши, которую обрабатывают в домашнюю клетку, может вызвать стресс у товарищей по клетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работа в шкафу биобезопасности ограничивает риск прыжков мышей на пол и может потребоваться в некоторых помещениях. Этот метод можно использовать в шкафу биобезопасности, следя за тем, чтобы всегда выполнять все шаги внутри шкафа биобезопасности, и избегая мышей, идущих по предплечьям дрессировщика.

2. ДЕНЬ 1: 5 минут на мышь

  1. Осторожно откройте клетку и поместите крышку сбоку, удалите гнездовые материалы и другие обогащения, такие как ходовые колеса или укрытия.
  2. Введите открытую руку в перчатке в домашнюю клетку, медленно поместив руку вдоль одной стороны стенки клетки (стена, ближайшая к дрессировщику, рисунок 1А).
    1. Не стоит сразу пытаться поднять мышь.
  3. Оставайтесь неподвижными и позвольте животному привыкнуть к присутствию руки в клетке около 30 с.
  4. Попытайтесь поднять мышь на ладони (т.е. избегайте подхватывать животное за хвост).
    1. Если мышь нелегко поднять после 3 попыток, направляйте мышь в угол и чашку обеими руками.
    2. Осторожно переместите руки в сторону мыши, чтобы попытаться поднять ее.
    3. Если это не удается после максимум 3 попыток обеими руками, осторожно поднимите мышь за основание ее хвоста и перенесите ее на предплечье или плоскую руку.
  5. С мышью в руке держите руку как можно более плоской и открытой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает плоскую платформу для мыши, на которую можно наступить, и ограничивает риск укусов.
  6. Держа руку открытой и плоской ладонью вверх, поместите другую руку рядом с рукой, держащей мышь, и позвольте мыши свободно перемещаться из руки в руку без каких-либо ограничений(рисунок 1B).
  7. Дайте мыши исследовать и перемещаться между руками в течение 1 минуты.
    1. В этот момент мыши могут попытаться отпрыгнуть. Расположите руки так, чтобы если мышь прыгнет, она приземлился на столешницу, а не на пол.
    2. Если мышь выглядит так, как будто она готовится к прыжку (двигаясь к краю руки и вставая на задние лапы), медленно поместите другую руку перед ней и попытайтесь направить ее на ходьбу по этой руке. Избегайте резких движений, так как это увеличивает риск прыжков.
    3. Если мышь прыгает, попытайтесь поднять ее, избегая обработки хвоста, и возобновите сеанс обработки. Если мышь остается на полу или вне рук более 10 с, добавьте дополнительное время к сеансу обработки, чтобы компенсировать любое время, когда мышь была вне рук.
    4. Заметь прыжок. Общее количество прыжков может быть использовано для оценки потенциальной изменчивости между животными.
  8. После 1 мин обработки плоскими руками расслабьте ладонь и слегка потягивая мышь в руке, прежде чем осторожно перекатывать мышь между руками(рисунок 1С).
    1. Чтобы «катиться», расположите мышь на ладони, на плоской руке, перпендикулярно пальцам.
    2. Медленно закройте руку, положив пальцы на заднюю часть мыши.
    3. Поместите свободную руку прямо под руку, держащую мышь.
    4. Медленно поворачивайте/поворачивайте руку мышью, чтобы осторожно перенести мышь в другую руку (флип на 180°).
    5. Повторяйте это взад и вперед между руками.
  9. Чередуйте мягкое катание между руками и свободное исследование на открытых руках в течение 60 с, чередуя техники примерно каждые 20 с.
  10. Выполните «тест на укрытие»(рисунок 1D).
    1. Позвольте мыши переместиться к краю руки, затем сведите 2 руки вместе.
    2. Очень медленно, чашка их так, чтобы мышь помещалась внутри «укрытия», образованного руками. Оставьте отверстие, чтобы мышь могла сбежать при необходимости.
    3. Старайтесь держать мышь в укрытии в течение 5-10 с, без каких-либо ограничений.
    4. Чередуйте тест укрытия, перекатывайтесь между руками и свободно исследуйте открытые руки еще 60 с, обязательно выполняя шаг укрытия 3 и более раз.
  11. Во всех процедурах, описанных в 2.10, не торопить процесс. Если мышь кажется напряженной (т.е. осторожно убегает, прыгает с рук, избегая контакта с руками и т.д.), будучи запертой внутри рук, продолжайте кататься между руками и свободное исследование в течение 20 с, а затем повторите попытку.
  12. Веха: Выполните по крайней мере 1 успешное испытание приюта в течение 10 секунд для завершения Дня 1.
    1. Считайте тест на укрытие успешным, когда мышь остается в руках. Если мышь высунет голову и вернется в укрытие, это все равно успешное испытание. Если животное полностью выходит из приюта, это провал.
  13. Позвольте свободное исследование в руках в течение 30 с.
  14. Осторожно замените мышь в клетке. Если группа размещена, поместите мышь во временную клетку до тех пор, пока все партнеры по клетке не будут обработаны. Верните мышей в их первоначальную клетку, подняв их на ладони. Не используйте хвостовой подхват.
  15. Очистите столешница от потенциальных кала и мочи 70% этанолом.
  16. Тщательно промойте перчатки 70% этанолом (или соответствующим чистящим раствором) или смените перчатки перед обращением со следующей мышью (можно сохранить те же перчатки для товарищей по клетке).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнять обработку с разумным количеством животных, чтобы избежать усталости от дрессировщика. Обработка 24 мышей занимает около 2 ч, и рекомендуется не превышать 24 мышей на одного обработчика. Если необходимо обрабатывать больше животных, рекомендуется либо иметь несколько обработчиков, либо разделить процедуры обработки на подгруппы в течение нескольких дней.

3. ДЕНЬ 2: от 3 до 5 минут на мышь

  1. Попытайтесь поднять мышь на ладони. На этом этапе это должно быть уже осуществимо и мыши не должны выпрыгивать из рук.
  2. Начните с открытой ладони, как на 1-й день, что позволит мыши свободно исследовать в течение 20 с.
  3. Затем перевертите мышь между руками несколько раз (4-5 раз).
  4. Выполните «тест на укрытие» в течение 5 с.
  5. Повторите тест на укрытие несколько раз (~5-6) в течение 2-3 минут.
  6. В течение тех же 2-3 минут периода чередуйте с броском между руками и свободным исследованием открытых рук шаг с 1-го дня, чтобы улучшить привыкание.
    1. Нажмите мышь на голову испину (рисунок 1E),5-6 раз. Признак привыкания — это когда мышь позволяет вам прикоснуться к ней, не пытаясь убежать.
    2. Выполните «Тычок в нос»: попробуйте коснуться морды мыши, от 2 до 3 раз(рисунок 1F).
      1. Если мышь пытается укусить или проявляет явные признаки стресса при прикосновении, не пытайтесь сразу же тыкать носом снова. Вместо этого чередуйте с плоской рукой исследования и броска. «Привыкание» отражается тем, что животное не убегает и не поворачивает голову в случаях контакта с человеком.
  7. Во всех процедурах, описанных в 3.4-3.6, не торопить процесс. Если мышь испытывает стресс, будучи запертой внутри рук или не хочет, чтобы ее трогали, продолжайте кататься между руками в течение 20-30 с, а затем повторите попытку.
  8. Основные этапы: Выполните не менее 1 успешного тычка носом в течение 2-3 с для завершения 2-го дня.
  9. Прекратите этот сеанс примерно через 3 минуты обработки, если животное хорошо реагирует на «укрытие», «поглаживание головой», «тыканье носом», и если мышь, по-видимому, готова исследовать руки без признаков стресса.
  10. Если мышь продолжает проявлять признаки стресса или не реагирует хорошо на тест «укрытие» или «тыканье носом», продолжайте сеанс до достижения 5 минут, как в день 1.
  11. Замените мышь в клетке, почистите столешницы и перчатки, как в 1-й день.

4. ДЕНЬ 3: Около 3 минут на мышь

  1. На третий день выполните те же действия, что и во 2-й день, в течение 2-3 минут.
    1. Подберите мышь на ладони.
    2. Перемещейте и перекатывайте мышь между руками
    3. Выполните тест на укрытие.
    4. Попробуйте погладить мышь по спине и голове.
  2. Чередуйте эти шаги примерно в течение 1-2 минут.
  3. Продолжайте процедуру до тех пор, пока мышь не расслабится настолько, чтобы сидеть на ладони, не пытаясь убежать.
  4. До конца 3-го дня повторите тест на укрытие и тест на тыканье носом в качестве теста на привыкание.
    1. Если оба теста могут быть завершены с первой попытки, процесс привыкания завершен. Продолжайте осторожно обращаться с мышью в течение 30 с в минуту.
    2. Если мышь изначально устойчива к любому из тестов, повторите шаги 4.1-4.3 в течение 20-30 с, прежде чем повторно присмачивать тест на тычок носом и укрытие.
    3. Если мышь остается устойчивой к этим тестам через 3 мин, третий день может быть повторен.
  5. Основные этапы: Выполните не менее 2 успешных тестов укрытия по 10 секунд каждый и 2 успешных теста на тычко носом для завершения дня 3 и завершения всей процедуры 3D-обработки.
  6. Верните мышь в клетку, почистите столешницы и перчатки.

5. Факультативный подход к животным, подвергаемым ограничению для инъекций или оважа

ПРИМЕЧАНИЕ: На 3-й день, если животное будет удерживаться в экспериментальных целях (пероральная оваж, внутриперитонеальная инъекция и т. Д.), Мыши могут быть подвергнуты тесту на защемление шеи.

  1. Захватите затылок между большим и указательным пальцами(рисунок 1G).
  2. Поднимите мышь на 3-5 см выше руки на 2-3 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это неестественное положение для взрослых мышей, и если мыши остаются почти неподвижными, они хорошо привыкли к обращению и их будет легко сдерживать в экспериментальных целях.
  3. Поместите мышь обратно в плоскую руку или, если мышь реагирует на защемление шеи, подумайте о том, чтобы поместить ее на рукав экспериментатора, крышку клетки или столешницу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы работаете в шкафу биобезопасности, не кладите мышь на рукав, иначе она может подойти и выйти из шкафа биобезопасности. Предпочитайте размещать мышь на столешнице внутри шкафа биобезопасности.
  4. Оставьте мышь свободно исследовать руку экспериментатора в течение 1 минуты.

6. Необязательный подход для дополнительных дней обработки

  1. В случае сильной стрессовой линии мыши добавьте дополнительные дни, чтобы снизить реактивность и уровень стресса животных, используя методы, описанные в Дне 2/3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие факторы могут влиять на базовый стресс животных, включая штамм, наличие трансгенной модификации, возраст, пол и жилищные условия. Если эти факторы не согласуются между группами, такими как пожилые животные, тестируемые против молодых контрольных групп, или трансгенные животные, тестируемые против контроля дикого типа, рекомендуется использовать одинаковое количество дней привыкания для каждой группы.

7. Обработка туннелей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим только к мышим с туннельной обработкой. Туннели представляют собой поликарбонатные трубы длиной около 13 см и диаметром 5 см.

  1. Поместите туннель в клетку мыши.
  2. Оставьте туннель в клетке за 7 дней до обработки.
  3. Откройте клетку и поместите крышку сбоку.
  4. Осторожно направьте мышь в поликарбонатный туннель (уже в клетку).
  5. Поднимите туннель из клетки, горизонтально. При необходимости свободно накройте концы туннеля, чтобы животное не прыгало/не выпадало из туннеля, потенциально падая обратно в клетку или на пол.
  6. Отодвините животное в туннеле подальше от домашней клетки и держите его подальше от любых поверхностей в течение 30 с.
  7. Поместите туннель обратно в домашнюю клетку, позволив мыши выйти из трубы.
  8. Подождите 60 с, а затем повторите шаги 7.4-7.7 один раз.
  9. Тщательно промойте перчатки 70% этанолом или смените перчатки перед привыканием следующей мыши.
  10. Повторяйте эту процедуру в течение 10 дней подряд.

8. Обработка хвоста

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим только к мышам с хвостовой ручкой. Он используется для переноса мышей из их клетки в аппарат, и наоборот.

  1. Откройте клетку и поместите крышку сбоку.
  2. Обхватите мышей за основание хвоста между большим и указательным пальцами.
  3. Поднимите мышь из клетки.
  4. Через 2-3 с перенесите мышь на противоположное предплечье экспериментатора, сохраняя при этом хватку за хвост, чтобы избежать свисания мыши.
  5. Когда при осуществлении этого эксперимента требуется обработка хвоста (например, перед забором крови для тестирования кортизола), животных переносят на предплечье экспериментатора путем обработки хвоста и удерживают в течение 15 с, прежде чем вернуть в клетку.

9. Надземный плюс Лабиринт

  1. Обстановка в номере
    1. Поместите лабиринт посреди комнаты, под цифровую камеру, оснащенную картой памяти.
    2. Установите свет комнаты на ~60 люкс с помощью 2 стоячих ламп, размещенных за лабиринтом.
    3. Выключите любое верхнее освещение, чтобы избежать прямого света на лабиринте, который создает отражение и нарушает обнаружение животных в лабиринте.
    4. Как только все оборудование будет настроено, перенесите животных в комнату и дайте им акклиматизироваться к световым настройкам и новой среде в течение 30 минут.
  2. Тестирование
    1. Очистите лабиринт 70% этанолом, чтобы предотвратить запахи пыли или животного, которое было протестировано ранее.
    2. Запустите камеру.
    3. Используйте лист бумаги с удостоверением личности животного, чтобы записать удостоверение личности на видео, прежде чем поместить животное в лабиринт (это облегчит правильную идентификацию того, какая мышь снимается на каждом видео).
    4. Используйте соответствующую технику обращения с каждым животным, чтобы перенести его в лабиринт.
    5. Поместите мышь на центральную платформу, покрывая открытой рукой.
    6. Позвольте мыши исследовать аппарат в течение 10 минут, не беспокоя.
    7. Через 10 минут остановите камеру.
    8. Достанем мышь из лабиринта и положи ее обратно в клетку.
    9. Очистите кал и мочу из лабиринта 70% этанолом.
    10. После завершения тестирования со всеми мышами перенесите видео с карты памяти на компьютер для отслеживания видео.
    11. Используя автоматизированное программное обеспечение для отслеживания животных, отслеживайте количество входов в открытые и закрытые руки, а также время, проведенное в открытых или закрытых объятиях (здесь Ethovision XT 14).

10. Взаимодействие экспериментаторов (производное от Херста и Уэста9)

  1. Обстановка в номере
    1. Поместите стол посреди испытательной комнаты под цифровую камеру, оснащенную картой памяти.
    2. Установите свет на 50-70 люкс с 4 лампочками, размещенными в углу комнаты, обращенном к потолку. Выключите верхнее освещение, чтобы избежать прямого света на лабиринте, который создает отражение и нарушает обнаружение животных на арене.
    3. Принесите животных в комнату.
    4. Дайте им акклиматизироваться в комнате в течение 30 минут.
  2. Эксперимент
    1. Поместите домашнюю клетку под цифровую камеру.
    2. Снимите крышку.
    3. Удалите гнездовой материал и другие обогащения, которые могут помешать отслеживанию животных.
    4. Запустите камеру.
    5. Используйте карточку клетки с идентификатором животного, чтобы идентифицировать животное на видео.
    6. Поместите руку в домашнюю клетку вдоль стенки клетки спереди с правой стороны.
      1. Убедитесь, что голова обработчика не блокирует камеру для съемки мыши.
    7. Запустите таймер.
    8. Держите руку неподвижной в течение 2 минут, и пусть мышь исследует руку.
    9. Выньми руку из клетки на 15 с.
    10. Попытайтесь поднять мышь с помощью рук с кубиками и запишите, убегает ли мышь.
    11. Повторяйте последний шаг до пяти раз, каждые 5 секунд или до тех пор, пока мышь не позволит себя поднять.
    12. Запишите количество попыток, необходимых для поднятия мыши.
    13. Возврат гнездового материала и обогащения в клетку.
    14. Очистите перчатки с 70% этанолом или смените перчатки, прежде чем перейти к следующему животному.
    15. После тестирования перенесите видео с карты памяти на компьютер.
    16. Используя автоматизированное программное обеспечение для отслеживания видео, разделите клетку на четыре равных квадранта и запишите время, проведенное мышью в каждом квадранте (здесь Ethovision XT 14).

11. Подавленное кормление новизной

  1. Лишение пищи
    1. За 3 дня до теста выполните полную смену клетки и один раз разместите животных (одиночное жилье предпочтительнее для проведения тестирования домашней клетки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставление свежего постельного белья удаляет потенциальную пыль или маленькие кусочки пищи, накапливающиеся в подстилке с момента последней смены клетки.
    2. За день до тестирования взвесьте всех животных около 6 часов вечера.
    3. Извлеките всю пищу из бункера для еды и убедитесь, что в клетке или в подстилке нет кусочков пищи.
  2. Обстановка в номере
    1. Поместите камеру NSF на стол.
    2. Заполните камеру тонким слоем кукурузной подстилки (или другой подстилки, которая отличается от подстилки, используемой в домашней клетке животных).
    3. Установите свет на 70 люкс с 4 лампочками, размещенными в углу стола, где стоит камера, лицом к потолку. Выключите верхнее освещение, чтобы поддерживать низкое освещение комнаты.
    4. Поместите одну гранулу стандартного чау, используемого в объекте, на сторону камеры, обращенную к экспериментатору (≈10 см от стены).
  3. Тестирование
    1. Утром после лишения пищи принесите животных в комнату за 30 минут до тестирования, чтобы они акклиматизировались к условиям освещения и новой среде.
    2. Взвесьте всех животных, чтобы измерить их потерю веса на основе веса, измеренного в предыдущий день. Животные должны потерять 8-12% в одночасье, чтобы иметь возможность выполнить задачу должным образом.
    3. Сортируйте животных по потере веса и экранируйте их, начиная с мыши, которая потеряла больше всего, до мыши, которая потеряла меньше всего веса.
    4. Убедитесь, что камера заполнена постельным бельем и одной гранулой.
    5. Поместите животное на противоположную сторону камеры, подальше от пищевой гранулы.
    6. Немедленно запустите таймер.
    7. Дайте мыши исследовать камеру в течение 12 минут.
    8. Измерьте латентность, чтобы приблизиться и покормить (животное должно укусить и съесть) на грануле пищи.
      1. Рассмотрим это как подход, когда животное подходит близко к пеллете, нюхает ее и не кусается.
      2. Определите укус, когда животное начинает потреблять гранулу.
    9. Запишите задержку, чтобы приблизиться и питать гранулу за считанные секунды.
    10. После того, как мышь напиталась пищевой гранулой, выньте мышь из камеры.
    11. Выбросьте постельное белье, но сохраните гранулы, которые будут использоваться для тестирования аппетита в домашней клетке мыши.
    12. Сбросьте камеру для следующего животного и приступайте к следующему животному.
    13. Через 15 мин после завершения испытания в камере бросьте гранулу, используемую во время теста, внутрь домашней клетки мыши, к стенке в передней части клетки.
    14. Измерьте задержку для питания гранулы, когда гранула находится в домашней клетке. Это мера для аппетита.
      1. Предпочтительно удалить гнездовой материал, чтобы мышь увидела, что гранула сбрасываются в ее клетку.

12. Сбор сыворотки и измерение кортикостерона

  1. Обрабатывайте животных в течение 1 мин с использованием назначенной методики, за 15 мин до забора крови (это можно сделать с групповыми или одиночными животными, имея в виду риск драк при перегруппировке мышей).
    1. Для мышей с туннельной обработкой направьте их в туннель, поднимите туннель из клетки на 1 мин и замените мышь в своей клетке.
    2. Для мышей с хвостовым хватом возьмите хвостовое основание мыши и извлеките мышь из своей клетки. Перенесите мышь в рукав экспериментаторов на 1 мин, а мышь вернуть в клетку с помощью хвостовой обработки.
    3. Для мышей с 3D-ручкой используйте руки с кубиком, чтобы удалить мышь из клетки. Подержите мышь в руках в течение 1 минуты и верните ее в клетку.
  2. Через 15 мин после обработки приступайте к забору крови из подчелюстнойвеной 22.
  3. Крепко похитим мышь так, чтобы голова мыши была надежно обездвижена.
  4. Найдите место прокола.
    1. Вдоль мандиблы лица есть небольшая голая ямочка, которую можно использовать в качестве ориентира для определения места прокола. Проводя линию между основанием челюсти и этой ямочкой, место прокола лежит за этой ямочкой к уху примерно на 5 мм, сразу за шарниром челюсти.
  5. Держите чистую иглу 23 G перпендикулярно месту прокола и используйте быстрое твердое движение. Кончик иглы должен проникать на глубину от 1-2 мм, кровь будет течь сразу, как только вена будет проколота.
  6. Соберите ~ 150 мкл крови в покрытых ЭДТА сборных пробирках и храните на льду.
  7. Нанесите небольшое давление стерильной марлевой прокладкой на место прокола в течение 5 с или более, чтобы кровь сгустится.
  8. Как только кровь свернется, верните мышь в ее домашнюю клетку.
  9. Центрифуга крови при 4 °C 3,500 х г в течение 10 мин.
  10. Декант супернатанта.
  11. Храните супернатант при -20 °C для последующего анализа.
  12. Измерьте уровень кортикостерона с помощью набора кортикостерона ELISA в соответствии с протоколом производителя.
  13. Используйте спектрофотометр для считывания результатов ИФА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Два отдельных исследования были проведены на мышах C57BL/6. Исследование #1 включало 6-месячных мужчин, а #2 исследования включали 2,5-месячных женщин (N = 36 / исследование) из Лабораторий Джексона (Cat #000664). Мыши прибыли в учреждение в возрасте 2 месяцев. В то время как исследование #2 женщины были обработаны и протестированы через две недели после прибытия, исследование #1 мужчины были обработаны и протестированы только в возрасте 6 месяцев (задержка из-за глобального закрытия пандемии). За это время одна мышь из Study #2 умерла, прежде чем начать эксперименты. Исследование #1 самцы мышей находились под уходом персонала животноводов. Всех мышей поддерживали в 12-часовом цикле света / темноты (7:00 ON, 19:00 OFF), получив доступ к пище и воде ad libitum. Их домашняя клетка была заполнена переработанной газетой в качестве подстилки, а также материала для гнездования. Мышей размещали индивидуально, чтобы ограничить потенциальное агонистическое поведение у самцов, размещенных в группе, во время сеанса обработки или после процедур, таких как сбор крови или поведенческое тестирование. Мыши были рандомизированы в три группы: обработка хвоста, обработка туннеля и 3D-обработка,и обрабатывались в открытой комнате в соответствии с дизайном их соответствующей группы(рисунок 2). Группа, обработанная туннелями, получила туннель в качестве обогащения за 1 неделю до сеанса обработки. Затем они обрабатывались в течение десяти (10) дней подряд, до поведенческого тестирования. Через неделю после завершения различных сеансов обработки началось поведенческое тестирование. На 16-й день мышей тестировали в EPM, а затем в тесте взаимодействия экспериментатора. Два дня спустя мыши были протестированы в NSF. Наконец, на 24-й день кровь была взята через 15 минут после одноминутного сеанса обработки того же типа, что и первоначальная обработка.

Для поведенческого тестирования туннельных животных переводили из клетки в аппарат, используя туннель, насколько это возможно. Однако для эксперимента Elevated-Plus Maze размеры лабиринта затрудняли удаление или размещение животных в лабиринте с помощью туннеля. В этом случае животных перекладывали из туннелей в руки и перевозили в лабиринт. 3D-обработанные мыши обрабатывались в течение трех дней, одновременно с днями 8-10 туннельной обработки(рисунок 2). Мыши с хвостовой обработкой не привыкли к обращению, но с хвостом обращались во время взаимодействия с экспериментаторами. Во время исследования экспериментатор выполнил смену клетки, чтобы обеспечить использование соответствующей техники обработки, используемой для каждой группы.

В тесте взаимодействия экспериментатора животных проверяли на их готовность добровольно взаимодействовать с экспериментатором и простоту обращения в экспериментальном контексте(рисунок 3). ANOVA, выполненная на количестве попыток поднять мышь из клетки, показала значительный эффект подхода к обращению в исследовании #1 самцов (F(2,31)= 6,36, p = 0,004) и в исследовании #2 самок (F(2,33)= 12,21, p = 0,0001). Пост-специальный анализ Шеффа показал, что количество попыток, необходимых для подхватывать мышей, было значительно уменьшено как 3D (p = 0,0061 в исследовании #1 самцов и p = 0,0002 в исследовании #2 самок), так и туннельной обработкой (p = 0,04 в исследовании #1 самцов и p = 0,003 в исследовании #2 самок), по сравнению с группой с хвостовым управлением(рисунок 3A). ANOVA, выполненная за время, проведенное в том же квадранте, что и рука, показала значительный эффект обработки в исследовании #1 мужчин (F(2,31)= 5,38, p = 0,009) и в исследовании #2 женщин (F(2,33)= 3,5, p = 0,04; Рисунок 3B). Пост-специальный анализ Шеффа показал, что исследование #1 самцы мышей, обработанных с помощью метода 3D-обработки, провели значительно больше времени в том же квадранте, чем рука экспериментатора, по сравнению с мышами с хвостовым управлением (p = 0,012). Не было существенных различий между группами по обращению с группами в исследовании #2, 2,5-месячных женщин. Степень взаимодействия с экспериментатором дополнительно демонстрируется комбинированными тепловыми картами центральных точек мышей(рисунок 3С-Е). Они иллюстрируют, как 3D-обработанные самцы мышей из Study #1 проводили больше времени проксимально к руке, включая области рядом с рукой, в то время как мыши с хвостом имели наименьшее общее взаимодействие с рукой.

Эффекты 3D- и туннельной обработки сравнивались с обработкой хвоста в двух тестах тревожного поведения, тесте на подавленное питание с новизной (NSF) и повышенный плюс лабиринт (EPM). В тесте NSF ANOVA, выполненном на подходе к латентности, показал эффект метода обработки, используемого в исследовании #1 мужчин (F(2,31)= 3,5, p = 0,04). Пост-специальный анализ Шеффа в Study #1 самцов показал тенденции от мышей с 3D-обработкой (p = 0,08) и от мышей с туннельной обработкой (p = 0,08) с уменьшенной задержкой подхода по сравнению с мышами с хвостовым обращением(рисунок 4A). Никаких эффектов в исследовании #2 не наблюдалось. ANOVA, выполненная на латентности при приближении в домашней клетке мыши (данные не показаны), не показала никакого эффекта обработки (p = 0,88 в исследовании #1 самцов и p = 0,16 в исследовании #2 самок). ANOVA, выполненная в процентное время в открытых объятиях в EPM, показала значительный эффект обращения в исследовании #2 женщин (F(2,33)= 3,5, p = 0,04). В исследовании #1 мужчин не наблюдалось никаких эффектов (F(2,31)= 2,1, p = 0,1; Рисунок 4B). Пост-специальный анализ Шеффе выявил тенденцию к увеличению времени, проведенного в открытых объятиях у мышей с туннельным обращением из Study #2, по сравнению с мышами с хвостовым обращением (p = 0,07). Что касается процентных записей в открытых объятиях(рисунок 4C),ANOVA не выявила никакого эффекта от обработки, ни в исследовании #1 мужчин, ни в исследовании #2 женщин (F(2,31)= 1,12, p = 0,33; и F(2,33)= 1,3, p = 0,26 соответственно). Поведенческие оценки были обобщены в z-оценке, как в Guilloux et al.23,информируя о потенциальном снижении тревожного поведения по сравнению с мышами с хвостовым управлением(рисунок 4D). ANOVA по z-баллам показал значительный эффект обработки в исследовании #1 мужчин (F(2,31)= 5,6, p = 0,008), но не в исследовании #2 женщин (F(2,33)= 1,07, p = 0,35). Пост-специальный анализ Шеффа показал, что 3D-обработка и обработка туннелей значительно снизили z-балл (p = 0,04 и 0,01 соответственно) по сравнению с обработкой хвоста, предполагая, что оба подхода уменьшают тревожное поведение в исследовании #1 мужчин.

Уровни кортикостерона после обработки также оценивались через 15 минут после короткого сеанса обработки(рисунок 5). ANOVA обнаружила значительный эффект обработки в исследовании #2 женщин (F(2,33)= 4,44, p = 0,01), но не в исследовании #1 мужчин (F(1,31)= 0,53, p = 0,59). В исследовании #2 самок пост-специальный анализ показал значительное снижение уровня кортикостерона у мышей из группы 3D-обработки по сравнению с группой обработки хвоста (p = 0,02).

Чтобы определить, оказали ли методы обработки значительное влияние на изменчивость полученных данных, мы применили тест Бартлетта на однородность дисперсии. Наши результаты не обнаружили существенной разницы в изменчивости в исследовании #2 самок мышей по измерениям (% времени EPM B(2,33)= 4,95, p = 0,087; % Записи EPM B(2, 33)= 3,68, p = 0,16; NSF B(2, 33)= 0,20, p = 0,91; КОРТ В(2, 33)= 1,69, p = 0,42). Однако в исследовании #1 самцов мышей наблюдалась значительная гетерогенность дисперсии в тесте NSF (B(2,31)= 8,08, p = 0,0175) и в измеренных уровнях CORT (B(2,32)= 11,63, p = 0,0029), но не ни в одном из показателей для EPM (% времени EPM B(2,32)= 1,16, p = 0,56; % Записи EPM B(2,32)= 2,79, p = 0,25). Использование F-теста для сравнения двух дисперсий показало, что в тесте NSF дисперсия была значительно снижена для исследования #1 самцов как 3D (F(1,21) = 4,22,p = 0,04), так и методами обработки туннелей (F(1,22)= 4,01; p = 0,03) по сравнению с обработкой хвоста. Для концентрации CORT после обработки только 3D-обработка значительно снизила изменчивость (F(1,20)= 9,65, p = 0,0019) по сравнению с обработкой хвоста.

Figure 1
Рисунок 1. Репрезентативные изображения процедуры 3D-handling.  Изображения иллюстрируют процедуру 3D-обработки. А) Рука в клетке: рука экспериментатора помещается в клетку и держится неподвижно, позволяя мыши привыкнуть к присутствию руки в клетке. Б) Плоская рука: при первом извлечении из клетки мышь помещается на плоскую ладонь. Мышь может свободно обходить ладонь и перемещаться между соседними плоскими руками. В) Бросок: Расслабьте ладонь, чтобы сформировать свободную «чашку» вокруг мыши. Осторожно наклонив чашку в противоположную руку, мышь должна свободно двигаться к этой руке, если не осторожно направить ее в другую руку. D) Укрытие: поместите мышь на край руки, затем сведите обе руки вместе и очень медленно сформируйте чашку вокруг мыши. Мышь не должна быть ограничена, и следует оставить отверстие, чтобы мышь могло убежать. Держите в течение ~ 5-10 с, а затем откройте плоскими руками. E) Голова / Спина Ласк: Пока мышь исследует плоскую ладонь, осторожно погладите мышь по голове и спине. Это приучивает мышь к приближению экспериментатора сверху. F) Тычок в нос: Когда мышь привыкает к обращению, попытайтесь осторожно коснуться мыши прямо на морде. Если мышь не отодвинут голову, она хорошо привыкает к обращению. Ж) Можно выполнить короткое (2-3 с) ущемление шеи в последний день, чтобы измерить привыкание животных в случае будущих вмешательств, требующих раздора. При привыкание к обращению мыши остаются неподвижными во время защемления шеи, в то время как непривычные мыши будут пытаться убежать, вращая хвост, чтобы освободиться от раздора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Экспериментальное проектирование.  После прибытия на объект мышей с хвостовым хлопьем не было привыкания. Мыши с туннельной обработкой привыкли к туннелям в своей домашней клетке в течение одной недели до начала обработки. Мыши с туннельной обработкой обрабатывались с помощью туннельной обработки в течение 10 дней (Первый день обработки = День 1), в то время как мыши с 3D-обработкой привыкли в течение трех дней (День 8-10). Затем мышей подвергали повышенному плюс-лабиринту (EPM) (день 16), тесту взаимодействия экспериментатора (день 19), кормлению с подавленной новизной (день 21) и краткому сеансу обработки с последующим сбором сыворотки для измерения CORT (день 24). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Влияние трех методов обработки на простоту обращения и готовность взаимодействовать с экспериментатором. А) Среднее количество попыток подхватить, необходимых для извлечения мыши из клетки. Исследование #1 самца (левая панель, обработка хвоста N = 12, туннельная обработка N = 12 и 3D-обработка N = 11) и исследование #2 самок (правая панель, N = 12 на группу) мышей как из туннельных, так и из 3D-обработанных групп, показало значительное снижение числа попыток, необходимых для их извлечения из клетки, по сравнению с мышами с хвостовым управлением. Б) Среднее количество времени, проведенного животным в том же квадранте клетки, что и рука экспериментатора. Исследование #1 самцов мышей, обработанных с помощью 3D-техники, показало значительное увеличение времени, проведенного в том же квадранте, что и рука экспериментатора. С-Е) Средние тепловые карты центральной точки мыши по времени, отрисованные в Ethovision XT 14, наглядно продемонстрировали увеличение исследования и взаимодействия с экспериментатором Исследования #1 3D-управляемыми самцами мышей. Полосы ошибок обозначают SEM. *p<0.05, **p<0.01 по сравнению с группой Tail Handled. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 

Figure 4
Рисунок 4. Влияние трех методов обработки на тревожное поведение. A) Задержка при приближении и питании гранулами в камере кормления с подавленной новизной в исследовании #1 самцов мышей (Tail Handling N= 12, Tunnel Handling N=12 и 3D handling N=11) и в Study #2 самок мышей (N=12/группа). Данные исследования #1 самцов мышей в группах 3D-обработки и туннельной обработки показали тенденцию к значительному снижению задержки при приближении к грануле. Б) Средства % времени, проведенного в распростертых объятиях возвышенного плюсового лабиринта. Не было никаких существенных различий между группами в исследовании #1 мужчинами, и тенденция к увеличению времени в открытых объятиях в исследовании #2 женщин в группе по обработке туннелей. C) Записи в открытых объятиях: Не было никаких существенных различий между группами в исследовании #1 мужчинами, а также в исследовании #2 женщинами. Г) Z-балл, обобщающий тревожное поведение. Используя данные, представленные в A, B и C, z-балл был рассчитан с использованием мышей с хвостовым управлением в качестве эталона. Снижение z-балла предполагает снижение тревожного поведения, измеренного тестами NSF и EPM. Исследование #1 самцов мышей, обработанных с использованием 3D- или туннельной техники, показало снижение фенотипа, подобного тревоге, по сравнению с мышами с хвостовым управлением. Полосы ошибок обозначают SEM. *p<0.05 сравнение с хвостовой группой. t показывает трендовый уровень значимости (стр<0,1) по сравнению с хвостовой обработанной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 

Figure 5
Рисунок 5. Уровни кортикостерона после обработки.  Сыворотку собирали через 15 минут после короткого сеанса обработки, а затем уровни CORT измеряли с помощью ИФА как в исследовании, так #1 самца (Tail Handling N = 12, Tunnel Handling N = 12 и 3D handling N = 11) и в исследовании #2 самок мышей (N = 12 / группа). Исследование #2 самок мышей, обработанных с помощью метода 3D-обработки, показало снижение уровня кортикостерона по сравнению с мышами, обработанными хвостом. ANOVA в исследовании #1 самцы мышей не достигли значимости для различий между группами (p = 0,5). Полосы ошибок обозначают SEM. *p<0,05 по сравнению с группой Tail Handled. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Table 1
Таблица 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Это исследование и разработка метода основаны на наблюдении, что методы обработки на мышах все еще упускаются из виду научным сообществом, и что некоторые лаборатории по-прежнему неохотно внедряют методы привыкания или обработки для снижения стресса и реактивности своих животных до экспериментов. Представляя собой временные обязательства, обращение с животными оказывает благотворное влияние на животных, которое может способствовать успеху экспериментов, которые должны быть выполнены, и предотвращает многократное выполнение экспериментов из-за изменчивости данных или чрезмерной реактивности животных. Использование техники 3D-обработки уменьшило попытки побега у мышей. Это также увеличило взаимодействие с экспериментатором и уменьшило фенотипы, подобные тревоге, у наших 6-месячных самцов мышей. Кроме того, 3D-обработка уменьшила вариабельность данных и снизила уровень кортикостерона у 2,5-месячных самок мышей всего через 3 первых дня обработки. Этот подход опирается на мягкие манипуляции, чтобы приужить мышь к обращению с экспериментатором, способствуя более плавной транспортировке и более легкому вмешательству.

Из техники 3D-обработки стоит подчеркнуть, что прогрессия методов обработки происходит в ответ на реактивность мыши, в зависимости от достижения этапов, описанных выше и в таблице 1. Животные должны снизить реактивность до одного шага обработки, прежде чем переходить к следующим шагам. Попытка слишком быстро перейти к «укрытию» или «тыкать носом» на животных, которые недостаточно привыкли, вероятно, приведет к увеличению стресса и потенциально снизит эффективность процедуры. Аналогичным образом, следует контролировать реактивность животного в каждый день обработки и учитывать при принятии решения о том, требуются ли дополнительные дни обработки. Если животные не реагируют хорошо на тест приюта в первый день, не соповетствовая критериям достижения первой вехи, первый день обработки может быть повторен до завершения вехи. Аналогичным образом, если животные не реагируют на тест на тыканье носом на второй день, второй день также может быть повторен. Еще одно предостережение, которое следует отметить при таком подходе, заключается в том, что риск того, что мыши прыгнут, выше в первый день обработки, в частности, при прыгучих штаммах, таких как C57BL6. Следование рекомендациям, описанным выше, должно снизить риск прыжков и предоставить способы ограничения такого поведения. Продолжительность обработки и прохождения через этапы может варьироваться в зависимости от штаммов, особенно при работе с трансгенными моделями, которые, как известно, демонстрируют тревожные фенотипы.

Несколько факторов могут способствовать снижению эффективности представленной техники 3D-обработки. Одним из таких факторов является потенциальный страх или нерешительность со стороны экспериментатора, в случае, если экспериментатор не знаком с работой с мышами или боится мышей. Поэтому влияние на обработчик также следует учитывать. Тем не менее, постепенное повышение уровня взаимодействия с мышами позволяет начинающим экспериментаторам развивать уверенность и большие навыки в выполнении техники обработки по мере прохождения этапов обработки. Предлагаемые шаги / этапы (приют и тесты на тычко носом) могут помочь противостоять потенциальной изменчивости человека у начинающих дрессировщиков, гарантируя, что животные достигнут аналогичных уровней привыкания. Сообщалось, что содействие позитивному взаимодействию человека и животных с животными привело к повышению качества жизни и удовлетворенности состраданием у персонала по уходу за животными24. Таким образом, джентльменство от обработки приносит пользу как дрессировщику, так и животному во время любого общего взаимодействия или вмешательства.

Благодаря своему влиянию на уменьшение числа попыток подхватить мышь, как у 6-месячных самцов, так и у 2,5-месячных самок, 3D-обработка обеспечивает альтернативу туннельной обработке или другим методам, облегчая перевод животных из их клетки в экспериментальный аппарат. Техника 3D-обработки также увеличила взаимодействие 6-месячных самцов мышей с экспериментатором. Это не наблюдалось у 2,5-месячных самок мышей, но самок мышей было легче подхватить, по сравнению с мышами с хвостовым хватом. Это говорит о том, что метод 3D-обработки может быть более подходящим для экспериментов, требующих прямого взаимодействия между животным и экспериментатором, таких как водный лабиринт Морриса (несмотря на потенциальные факторы, смешивающие пол / возраст, обсуждаемые ниже). Другие разработали и использовали ручные методы обращения, состоящие в том, чтобы подбирать животных с помощью кувыпучьих рук, без дополнительных манипуляций10. Хотя эти методы показали положительный эффект, данные в литературе часто представляют протоколы обработки с периодами привыкания, превышающими 10дней 9,16. Кроме того, обработка с кубком без утонченного взаимодействия, обеспечиваемого 3D-обработкой, может не подходить для прыгает штаммов, которые продолжают выпрыгивать и отрываться от рук. Хотя мы не проводили прямого сравнения в этом исследовании с методом чашки, 3D-обработка решает эту проблему и полагается на усовершенствованные движения для содействия взаимодействию между мышью и обработчиком. Исследование, проведенное Ghosal et al.16, использовало технику обработки чашек в сочетании с массажем в течение 5 дней и показало, что эта техника ограничивает влияние стресса на метаболические конечные точки, подчеркивая необходимость утонченных движений и взаимодействия во время обработки для лучшей эффективности. Основываясь на этой технике баночного массажа, 3D-обработка использует дополнительное взаимодействие для привыкания мышей. Используя подход 3D-обработки, обработчики гарантируют, что все мыши достигнут одинакового уровня привыкания, выполняя стандартизированные движения и адаптируя продолжительность процедуры к каждому животному в зависимости от его потребности (в настоящем исследовании все мыши прошли этапы и закончили протокол 3D-обработки за 3 дня). Такой подход можно считать «персонализированным» для каждой мыши, поэтому все животные достигают желаемого уровня привыкания в каждый день обращения. Как упоминалось ранее, если животные не достигают этапов, описанных в протоколе, этот метод может быть скорректирован путем увеличения количества дней. Этот метод показал благотворное влияние на снижение изменчивости между животными в поведенческих исследованиях и физиологических измерениях (уровни CORT), предполагая, что этот подход может способствовать снижению вариабельности внутри исследования и уменьшению влияния экспериментальной ошибки, потенциально приводящей к предвзятым результатам в доклинических исследованиях.

Подтверждающие результаты показали, что мыши, подвергаемые 3D- и туннельной обработке, демонстрируют снижение тревоги в тесте на питание с подавленной новизной по сравнению с мышами с хвостовым управлением. Учитывая комбинированные данные NSF и EPM, оба подхода показали значительные эффекты в снижении тревоги у 6-месячных самцов мышей. Это повторяет результаты о том, что животные, привыкнующие к туннельной обработке, улучшили производительность в тестах на беспокойство9,15 после 10+ дней обработки, и дополнительно демонстрирует потенциал 3D-обработки для демонстрации аналогичных эффектов. Это также показало, что 3D-обработанные 6-месячные самцы мышей приближаются и добровольно больше взаимодействуют со своим экспериментатором, чем 6-месячные самцы мышей, подвергающихся туннельной и хвостовой обработке. Важно отметить, что 2,5-месячные самки мышей, подвергавшиеся 3D-обработке, имели сниженные уровни CORT, что согласуется с ранее опубликованными результатами9. Два исследования (исследование #1 у 6-месячных мужчин и исследование #2 у 2,5-месячных женщин) подтвердили двумя различными способами, что обработка оказывает благотворное влияние на фенотипы, подобные тревоге (либо на поведенческие результаты в исследовании #1, либо на уровни CORT в исследовании #2).

Возможным фактором, способствующим эффекту, является пол экспериментатора, в данном случае мужского пола. Sorge et al.25 показали, что присутствие мужчин-экспериментаторов может привести к увеличению CORT и тревожности, подобного поведению у самцов, но не у самок мышей. Это контрастирует с результатами настоящего исследования. Основное различие между этим исследованием и исследованием Sorge et al.25 заключается в том, что подход, описанный здесь, заключается в приучения мышей к обращению, способствуя положительному (неармированному) взаимодействию с экспериментатором, в то время как Sorge et al.25 использовали наивных грызунов, которые никогда не взаимодействовали с людьми. Можно ожидать, что наивные мыши могут иметь сильную реакцию против экспериментаторов-людей, если они не узнают, что экспериментатор не представляет угрозы. Тем не менее, настоящее исследование было выполнено только с экспериментатором-мужчиной, и будущие исследования должны изучить, воспроизводимы ли такие эффекты с женщиной-экспериментатором. Хотя выделение этих факторов выходит за рамки данной статьи, стоит подчеркнуть важность выявления таких источников изменчивости при реализации привыкания к обращению или в экспериментальном проектировании в целом.

Настоящее исследование также подтвердило эффективность метода обработки туннелей для снижения тревожного поведения и уровней CORT у мышей9,10,11. Дополнительным преимуществом этого подхода является то, что туннель можно оставить в клетке в качестве обогащения26,что также может способствовать снижению реакции на стресс / беспокойство, в целом способствуя улучшению благосостояния10,11. В этом случае роль экспериментатора заключается в том, чтобы манипулировать туннелем только с каждым животным в течение одной минуты. Однако, как описано в Gouveia et al19,туннель не обязательно должен оставаться в домашней клетке и вместо этого может быть представлен животным только тогда, когда требуется перенести животное, не вызывая дополнительного стресса. Оба подхода, туннель и методы 3D-обработки, предлагают преимущества, которые должны быть оценены лабораторией и экспериментаторами, чтобы определить, какой подход наиболее подходит для их потребностей. В настоящем исследовании туннель был оставлен в клетке, и влияние, которое мы наблюдали на тревожное поведение, может быть связано с сочетанием обработки туннеля и обогащения.

Хотя оба обеспечивают благотворное воздействие, методы 3D- и туннельной обработки не лишены ограничений. Общим ограничением является то, что внедрение таких процедур может занять много времени и потенциально обескуражить учреждения по защите животных. Тем не менее, дополнительные преимущества неоценимы, улучшая благополучие животных за счет снижения стресса и улучшения взаимодействия с экспериментаторами и поставщиками услуг по уходу за животными (как описано в Spangenberg and Kelling27),а также надежности и воспроизводимости исследований. Данные нашего учреждения свидетельствуют о том, что этот метод улучшает взаимодействие между животными и персоналом животноводства, облегчая смену клеток и мониторинг здоровья. От других пользователей на нашем объекте сообщается, что раздоры и общие манипуляции значительно легче с обработанными мышами, в соответствии с нашими выводами о том, что мыши, обработанные с помощью 3D-техники, с меньшей вероятностью убегут, когда их подбирают, и в нашем примере 6-месячные самцы более склонны взаимодействовать со своим экспериментатором. Последующие исследования могут количественно оценить такие эффекты, чтобы дополнительно продемонстрировать полезность метода. В целом, этот подход к 3D-обработке, а также туннельный подход способствуют правилу 3R, в частности, путем совершенствования рутинных взаимодействий с животными, чтобы свести к минимуму стресс в ответ на обращение. Учитывая наблюдаемое снижение изменчивости данных, это также может привести к сокращению числа животных, необходимых для получения последовательных результатов, и уточнения подхода, используемого для ограничения изменчивости.

Еще один момент обсуждения, основанный на представленных данных, заключается в том, что это исследование было проведено с животными, которые были однодомными. Одиночное жилье было предпочтительным, поскольку оно ограничивает потенциальное агонистическое поведение (особенно у самцов мышей), которое может способствовать межиндевидуальностиизменчивости 28,29. Для согласованности между группами все животные были размещены в одном доме. Также интересно отметить, что положительные взаимодействия экспериментатора и животных у крыс в виде щекотки крыс, смогли смягчить некоторые эффекты социальной изоляции у однодомных крыс30,31. Возможно, что методы обработки, включающие прямой контакт между животным и экспериментатором, такие как техника 3D-обработки или техника массажа чашек, описанная Ghosal et al.11, могут иметь аналогичный эффект. Будущие исследования могут исследовать этот вопрос, сравнивая эффекты методов обработки у одиночных и групповых животных. Прошлые исследования изучали влияние подходов к обработке чашек и туннелей с мышами в групповой обстановке и получили аналогичные результаты7,8. Это подтверждает, что можно использовать протоколы обращения, описанные в настоящем описании, с животными, содержательными в условиях одного дома или группового дома, имея в виду возможность агонистического поведения при вынимании одного животного из клетки и помещении его обратно (особенно у самцов мышей или агрессивных линий мыши). В таких случаях рекомендуется использовать временную клетку перед перегруппировкой всех животных вместе.

В заключение, предлагаемый подход к 3D-обработке способствует снижению реактивности и стресса у мышей. Это также повышает надежность данных за счет уменьшения изменчивости после 3 дней обработки. Аналогичные результаты наблюдаются и при обработке туннеля, в нашем случае после 10 дней обработки туннеля. По сравнению с техникой обработки туннелей, техника 3D-обработки обеспечила преимущество увеличения взаимодействия с экспериментатором у наших 6-месячных самцов мышей, что может быть критическим в некоторых случаях. Если бы 3D- или туннельный метод обработки был реализован на всех объектах для животных, это представляло бы собой значительное улучшение для генерации данных и в значительной степени способствовало бы сокращению использования животных в исследованиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Авторы благодарят Комитет по уходу за животными CAMH за поддержку этой работы, а также лиц, осуществляющих уход за животными CAMH, которые предоставили обширную обратную связь о полезности процедуры, мотивируя выполнение описанных экспериментов и представление подробного протокола для других пользователей. Эта работа была частично профинансирована CAMH BreakThrough Challenge, присужденной TP, и внутренними фондами CAMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
  2. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
  4. Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
  5. Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
  6. Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
  7. Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
  8. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  9. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  10. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
  11. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
  12. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  13. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
  14. Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
  15. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
  16. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  17. Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
  18. Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
  19. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
  20. Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
  21. Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
  22. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  23. Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
  24. LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
  25. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  26. Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
  27. Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures - a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
  28. Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
  29. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  30. Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
  31. Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).

Tags

Поведение выпуск 175
Методы управления для снижения стресса у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga,… More

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J. L., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter